Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của flavonoid lá chay (artocarpus tonkinensis a chev ex gagnep)

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRỊNH HIỂN TRUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHAN HOÁ HỌC VÀ
TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA
FLAVONOID LÁ CHAY
(.Artocarpus tonkinensis A.chev.ex Gagnep)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ

1997 - 2002

Người hướng dẫn :TS. Trần Lưu Vân Hiền
GS . TS Phạm Thanh Kỳ
Nơi thực hiện

: Bộ môn Dược Liệu
Trường đại học Dược Hà Nội
Phòng Đông Y thực nghiệm
Viện Y học Cổ truyền Việt Nam

Thời gian thực hiện : 3/2002 -

Hà Nội, 5-2002


LỜI CÁM ƠN

(J)âi. lềậup kính ỉron/ị t%à hiỉi òa Síĩu sảa, tồi xiềi hàiị tả lồi eáễti ờti ahàtt
thàn h tjớl:

Ç7&. ÇjfUfLJhi'u (ĩ)ãtL Jôieic
.

ÇÎ& (J)luu9L Çjliatth Jüp

(ìlhữtuị, »upười đĩt true, tiếp, hưổttạ, (lấn íùi eíủ hảfr tồi hớàti iíu ìtth kítớú Luận
tó /

iUfhiêjfL nàụ,. Çîôi (tủtup æiit ỈHUỊ, tfr Lòiitp (tảtn ổtL tố i

QílạẮUí ( (ĩỳiên Jỗ€ÚÍ
eùễUỊ, tởàếi

-

^ )< íộ

.Çj&

^ỗũỈLtup

Çjrump ta n t Ulitìư hae. tư. nhiên ÚỈL eồếUị, tiiịítè Qịiếe. ^ ỉíl)

tó eáa ỉhầtp e& lỉA tnồtL
úiêiL ph m u ị (Hiíwm QJ- thưa iUịldent dã. nldêt tìn h (jJúft đií eii& tò i ttônụ, ếịưá

triait thu!e kiejt UltöCL Luậểi iiùip.
JÔCL nội, ỉhátiạ. 5 nànt 2 0 0 2
cỲ ĩ).

Çjritih JCiên

Q w /« //

.


MỤC LỤC
Đạt vấn đề
1
Chương I : Tổng quan
3
1. Một số vấn đề về Aavonoid và tác dụng sinh học của chúng
3
1.1 Đại cương về Aavonoid
3
1.2 Một số tác dụng sinh học của ílavonoid
4
1.2.1 Khái niệm về gốc tự do
4
1.2.2 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động
4.
1.2.3 Các chất chống oxy hoá
5
1.2.4 Tác dụng chống gốc tự do của ílavonoid

7
1.2.5 ứng dụng ílavonoid trong y học
7
2. Cây chay, một dược liệu có tác dụng chống oxy hoá
8
2.1 Đặc điểm thực vật
8
2.2 Tình hình nghiên cứu về tác dụng làm thuốc của cày chay
9
Chương n : Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
11
1. Nguyên liệu nghiên cứu
11
2. Phương pháp nghiên cứu
11
2.1 Các phương pháp nghiên cứu hoá học
11
2.2 Phương pháp thử tác dụng sinh học
11
Chương m : Thực nghiệm và kết quả
13
1. Nghiên cứu thành phần hoá học
13
1.1 Định tính một số nhóm hợp chất trong lá chay
13
1.2 Định ỉượrig ílavonoid toàn phần trong lá
19
1.3 Chiết xuất ílavonoid toàn phần từ lá chay
20
1.4 Phân tích ílavonoid toàn phần bằng sắc kí lớp mỏng

22
1.5 Phân lập ílavonoid bằng sắc kí cột kết hợp với SKLMđiều chế 23
1.6 Nhận dạng ílavonoid
25
1.6.1 Đối chiếu Fị F2 với chất chuẩn bằng SKLM
25
1.6.2 Nhận dạng các ílavonoid Fị,F2
26
A Nhận dạng F!
26
B Nhận dạng F 2
27
2 Nghiên cứu tác dụng sinh học
30


2.1 Thử tác dụng chống oxy hoá của Ftp, Fj, F2
2.2 So sánh tác dụng chống oxy hoá của Ftp,Fj, F2
Chương IV : Kết luận và đề xuất
1 Kết luận
2 Đề xuất
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

30
36
37
37
37
38

40


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
AOA
CCOXH
DOXHĐ
EtOAc
F
MDA
MeOH
SKC
SKLM
SOD

Hoạt tính chống oxy hoá.
Chất chống oxy hoá.
Dạng oxy hoạt động.
Ethylacetat.
Flavonoid toàn phần.
Malonyldialdehyd.
Methanol.
Sắc kí cột.
Sắc kí lớp mỏng.
Superoxydismutate.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, gốc tự do và vai trò của gốc tự do trong cơ chế

bệnh sinh và phát triển cúa nhiều loại bệnh đã thu hút sự chú ý của rất nhiều
nhà y sinh học, các phòng thí nghiệm trên thế giới. Trong số các loại gốc tự do
người ta quan tâm nhiều nhất đến các dạng oxy hoạt động.
Mặc dù với nồng độ rất thấp nhưng do có tính oxy hoá mạnh các dạng oxy
hoạt động dễ dàng tương tác với hầu hết các chất hữu cơ ở nơi sinh ra gây tổn
thương tế bào. Vì một lý do nào đó, thường là do ảnh hưởng của các tác nhân
gây bệnh, các dạng oxy hoạt động gia tăng khó kiểm soát trong khi đó hệ
thống các chất chống oxy hoá không đủ để triệt tiêu chúng, kết quả là trong cơ
thể tồn nhiều gốc tự do của oxy. Nhiều bệnh nguy hiểm như các bệnh tim
mạch, thấp khớp, ung thu', các rối loạn viêm nhiễm cũng như quá trình lão
hoá đều đã được coi là đưực phát sinh do stress oxy hoá. Trong các trường hợp
này người ta nghĩ đến việc đưa thêm các chất chống oxy hoá từ ngoài vào,
chúng ta đã biết đến vitaminC, vitaminE, caroten, các flavonoid....[2].
Flavonoid là một hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong thực vật. Chúng
có nhiều tác dụng sinh học quan trọng. Đặc biệt tác dụng dọn gốc tự do và
chống oxy hoá của các flavonoid đang được các nhà khoa học trong nước và
trên thế giới rất quan tâm nghiên cứu.
Tại Việt Nam lá cây chay (Artocapus tonkinensis A.chev.ex Gagnep họ
dâu tằm Moraceae) được sử dụng trong nhân dân dưới dạng nước sắc để chữa
các bệnh đau lưng, tê mỏi... Nhóm nghiên cứu Viện y học cổ truyền và bộ
môn miễn dịch học viện Quân y đã tiến hành nhiều nghiên cứu về mặt sinh
học miễn dịch của thành phần flavonoid tổng số từ lá cây chay, và đã chứng
minh là thành phần này có tác dụng chống lại tổn thương màng tế bào thận
sau thiếu máu- tưới máu irở lại [5], tác dụng ức chế sự chuyển dạng lympho
bào khi có mặt PHA một chất kích thích phân bào không đặc hiệu [6 ].
1


v ề mặt hoá học chúng tôi chưa tìm thấy các tài liệu nghiên cứu có liên
quan về các chất có hoạt tính sinh học trong dịch chiết lá chay. Để có thêm

những cơ sở khoa học cho việc dùng lá chay làm thuốc chữa bệnh, chúng tôi
tiến hành đề tài nghiên cứu này với nhiệm vụ là:
-

Chiết xuất và phân lập một số ílavonoid chính trong lá chay và nhận
dạng chúng.

-

Thăm dò tác dụng chống oxy hoá của ílavonoid tổng số từ lá chay và so
sánh khả năng chống oxy hoá của các phân đoạn qua test xác định
MDA trong dịch đồng thể tế bào gan.


CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
1. Một sô vấn đề về flavonoid và tác dụng sinh học của chúng
1.1 Đại cương về flavonoid [7]
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Phần
lớn các chất flavonoid có màu vàng( flavus tiếng la tinh có nghĩa là màu
vàng). Cũng có một số chất có màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu cũng thuộc
nhóm. Mặt khác từ thực vật một số nhóm hợp chất không thuộc flavonoid
nhưng lại có màu vàng như carotennoid, anthranoid, xanthon...
Cấu trúc hoá học: ßavonoid là những chất có cấu trúc hoá học kiểu c 6C3 - C6 tức là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một
mạch 3 carbon vòng hoặc mở.

Ö

( mạch c vòng )

( mạch c mở )

Bản chất hoá học của flavonoid là những polyphenol, chúng thường ở
dạng gỉycosid hay dạng aglycon. Hầu hết các flavonoid tồn tại ở các dạng
gỉycosid khác nhau. Sự đa dạng của các flavonoid do bởi sự khác nhau của
nhóm đường và vị trí liên kết của chúng vào các vị trí khác nhau của phân tử
flavonoid. Đường có thể khác nhau về độ lớn của vòng oxy, cấu hình của các
liên kết glycosid và thứ tự liên kết giữa chúng. Trong các flavonoid glycosid,
đường thường gặp ở vị trí 7- sau đó là vị trí 3- rất hiếm khi gặp ở vị trí 5.
Trong các flavonoid glycosid loại đường đơn thường gặp D-gỉycosa, Dqaìactosa, L-arabinosa, L-rhamnosa. . . Các aglycon và các gỉycosid của nó rất
đa dạng. Có tới hơn 2000 các hợp chất flavonoid tự nhiên, tuy nhiên hiện nay

3


chỉ mới có khoảng 500 flavonoid đã được nghiên cứu về mặt hoá học và hoạt
tính sinh học của chúng.
Flavonoid có ở tất cả các bộ phận của cây, nhất là ở hoa, là chất màu
tạo màu sắc rực rỡ cho hoa có sức quyến rũ côn tràng, giúp cho việc thụ phấn
của hoa. Trong cây, flavonoid đảm nhận các chức năng như: là chất bảo vệ của
cây, CCOXH, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào thực vật. Chất ức chế các tác
nhân phá hoại cây như: vi khuẩn, vi rút, côn trùng, động vật ăn cỏ... Một số
flavonoid có tác dụng điều hòa sinh trưởng.
Trong y học flavonoid đã được dùng làm thuốc chữa bệnh có nhiều tác
dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus. Flavonoid còn có tác dụng
làm tăng sức bền thành mao mạch chống xơ vữa động mạch (như rutin,
kesperidiỉi). Một số flavonoid có tác dụng bảo vệ tế bào gan, nhuận gan, lợi
mật. Một số flavonoỉd khác như eupatin, eupatovetỉn có tác dụng ức chế khối
u.
1.2 Một số tác dụng sinh học của flavonoid
1.2.1 Khái niệm về gốc tự do [11]

Gốc tự do là những tiểu phân hoá học (nguyên tử, phân tử, ion...) có điện
tử không cặp đôi ở orbital hoá trị. Ví dụ: gốc methyl *CH3 , gốc *H , gốc Cl*,

gốc Superoxyd 0 2~*.
Đặc trưng của gốc tự do:
•

Do có điện tử độc thân (tức là một tiểu phân mang điện, luôn chuyển
động), nên gốc tự do có mô men từ spin.

•

Các gốc tự do có khả năng phản ứng cao.

1.2.2 Sự hình thành các dạng oxy hoạt động [11]
Oxy được hít thở theo đường hô hấp vào máu rồi tới tận các tế bào, tham
gia nhiều phản ứng sinh hoá học cơ bản để duy trì sự sống. Những phản ứng
sinh hoá học quan trọng nhất có sự tham gia của oxy là một loạt các phản ứng
4


oxy hoá khử liên tiếp xảy ra ở chuỗi hô hấp tế bào. ứ ig với mỗi giai đoạn oxy
nhận một điện tử, tạo ra một trạng thái gốc trung gian. Đầu tiên oxy nhận một
điện tử từ phân tử cytocrom, tạo ra gốc Superoxyd 0 2“ *, gốc Superoxyd này
nhanh chóng được các enzym Superoxyd dismutase (SOD) phân huỷ, tạo ra
hydroperoxyd (H20 2) theo phản ứng:

0 2~ *+ 0 2~* + 2H+ ------ SQD

►

H 20 2 + '02

Ở những nấc tiếp theo là những tiểu phân trung gian như hydroperoxyd
(H20 2), gốc hydroxyl (OH*). Những tiểu phân này rất dễ nhường hoặc nhận
điện tử. Vì thế người ta gọi chúng là những tiểu phân có khả năng phản ứng
cao.
Một số ion kim loại chuyển tiếp Fe2+ , Cu2+ có thể xúc tác cho quá trình tạo
ra nhiều gốc hydroxyl trong phản ứng của 0 2~* với H 20 7 (phản ứng Fenton)

02~# + H 202 -----

—

-----►

“OH + *OH + ^ 2

Các gốc OH* có khả năng phản ứng nhanh với các acid béo chưa no tạo ra
các hydroperoxyd lipid (LOOH). Sự phân huỷ các LOOH tiếp theo tạo ra các
gốc mới như: gốc alkoxyl (LO*), gốc peroxyl (LOO*). Những tiểu phân gốc
này cũng có tính oxy hoá mạnh, dễ dàng tương tác với các phân tử bên cạnh
tạo ra các phân tử mới.
Tất cả các tiểu phân chứa oxy có hoạt tính này ( 0 2_ *, *0H, H 20 „ LO*,
LOO*...) được gọi là các dạng oxy hoạt động (DOXHĐ).
1.2.3 Các chất chống oxy hoá [2]
Các phản ứng oxy hoá là một phần thiết yếu trong quá trình chuyển hoá để
cung cấp năng lượng cho cơ thể. Các phản ứng thường xảy ra với sự tham gia
của các DOXHĐ. Đó là những chất có hoạt tính cao về mặt hoá học. Bản thân
các DOXHĐ là những dạng chuyển hoá sinh lý bình thường của cơ thể.

Nhưng vì ở trạng thái gốc tự do, hoạt tính oxy hoá lớn nên hầu như tức thì
chúng phản ứng với các phân tử hữu cơ bèn cạnh tạo ra quá trình oxy hoá và
phản ứng gốc tự do lan truyền trong cơ thể. Những chất có khả năng phân huỷ,
loại bỏ các DOXHĐ được gọi là CCOXH (antioxydant). Bình thường, trong cơ
thể luôn có một hệ thống CCOXH để điều hoà quá trình sản sinh ra các
DOXHĐ. Những CCOXH điển hình trong cơ thể như: enzim Superoxyd
dismutase chứa Mn/ty thể (SOD), catalase, vitamin E, vitamin

c, transferin,

ceruloplasmin, ...chính nhờ những CCOXH này mà việc sinh ra các DOXHĐ
vẫn duy trì được cân bằng thích hợp, lượng các DOXHĐ trong cơ thể rất thấp,
tác hại do chúng gây ra không lớn. Khi có mặt những tác nhân oxy hoá thì
hàm lượng các DOXHĐ tăng lên dần trong cơ thể dẫn đến xuất hiện các tĩnh
trạng bệnh lý.
Các tác nhân oxy hoá kể trên làm tăng các DOXHĐ trong cơ thể. Đó cũng
chính là nguyên nhân sâu xa của hàng trăm chứng bệnh như các trường hợp
viêm, thiếu máu cục bộ, xơ vữa động mạch, sự thoái hoá của hệ thần kinh, sự
phát triển của các khối u, sự lão hoá của các cơ quan phủ tạng và của toàn cơ
thể...
Do vậy, việc nghiên cứu các CCOXH (antioxyđant) được các nhà khoa học
trong nước và trên thế giới ngày càng quan tâm. Khó có thể tìm thấy một tạp
chí y - sinh học nào không nói đến các chất oxy hoá, các CCOXH đã được
biết đến như vitamin

c, vitamin E, caroten.. .Trong các CCOXH có nguồn gốc

tự nhiên người ta thường quan tàm đến các flavonoid.

Đặc biệt trong những thập kỷ gần đây người ta chú ý nhiều đến vai trò
chống oxy hoá (antioxydant) bảo vệ tế bào, chống lão hoá tế bào. Các
biflavonoid đã được chứng minh có tác dụng tạo ra gốc bền (tức là các gốc ít
độc hại với cơ thể xét về mặt phản ứng). Flavonoid có thể tạo ra sự “khoá” các
phức hợp có kim loại như Fe2+ , Cu2+ là các chất xúc tác cho phản ứng Fenton


sinh ra gốc tự do độc hại với cơ thể. Ngoài ra flavonoid còn góp phần loại trừ
gốc tự do peroxyd.
1.2.4 Tác dụng chống gốc tự do của flavonoid [11]
Cấu trúc đặc biệt của các flavonoid với hệthống

dây nối đôi cho phép

chúng dễ dàng tạo thành các gốc tự do, các gốc tự do này tương đối bền vững
do sự liên hợp của gốc tự do và vòng thơm. Vì vậy, khi tham gia vào phản ứng
oxy hoá thì chúng sẽ thay thế các gốc tự do hoạt động được tạo ra trong nhiều
quá trình bệnh lý khác nhau. Điều đó dẫn đến chuỗi phản ứng gốc bị đứt và ức
chế sự tạo thành chất độc với cơ thể.
RO *2 + ArOH ------► R 0 2H + ArO*
Trong đó:

ArOH : flavonoid
RO*2 : gốc tự do hoạt động
ArO*: gốc tự do bền vững

ArO* ở dạng quỉnon hoặc semiquinon có khả năng phản ứng với các gốc tự
do hoạt động để loại trừ chúng trong cơ thể:
ArO* + R*

------ ► Ar OR

Kết quả là gốc tự do hoạt động R* bị tiêu diệt, phản ứng dây chuyền bị cắt
đứt. Gần đây, một số tác giả đưa ra cơ chế giải thích tác dụng chống oxy hoá
của flavonoid là do sự tương tác mang tính hiệp đồng của flavonoid với các
chất chống oxy hoá sẩn cỏ trong tế bào, như glutathion peroxydase (GSH-PO).
Như vậy, các flavonoịd có khả năng dọn gốc tự do hoặc biến gốc tự do hoạt
động thành gốc trơ.
1.2.5 ứng dụng của flavonoid trong y học [2]
Trong y học lâm sàng, tác dụng của flavonoid rất đa dạng, dưới đây là một
số phương hướng ứng dụng chính.
+ Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch và thành tế bào nên được sử
dụng trong những trường hợp chẩn đoán hoặc có nguy cơ chảy máu như cao


huyết áp, bảo vệ mao mạch khỏi bị histamin làm tổn thương, tăng nhanh sự
phục hồi các mao mạch đã bị ảnh hưởng xấu của tia tử ngoại và tia X.
+ Chống dị ứng
+ Chống viêm loét do các nguyên nhân nội sinh hoặc ngoại sinh, kháng
nhiều loại vi khuẩn và nấm khó tiêu diệt.
+ Điều trị nhiều bệnh về gan, mật.
+ Phòng và chữa một số bệnh liên quan đến chuyển hoá như :
- Điều hoà hàm lương các dạng cholesteron trong máu, tránh nguy cơ
xơ vữa mạch, phục hồi trương lực cơ tim, điều hoà nhịp tim và huyết áp, điều
hoà chuyển hoá calci.
- Ảnh hưởng lên hệ thống nội tiết nên có vai trò đáng kể trong việc điều
hoà cân bằng sinh học của cơ thể.
+ Dùng bioflavonoid để hỗ trợ cho cơ thể khi dùng nhiều kháng sinh hoặc
sống trong môi trường có nhiều bức xạ ion.
+ Về phương diện miễn dịch học: nhiều bioflavonoid có khả năng kích

ihíeh limpho bào sản xuâì inteferon, chống virus xâm nhập vào cơ thể và kìm
hãm sự nhân lên của virus.
Giảm đau do tác dụng chống co thắt, giãn cơ trơn. Làm giảm các đám xuấl
huyết nhỏ trong bệnh đái đường.
+ Một số flavonoid có tác dụng chống khối u lành tính và ác tính. Tính
chất này phụ thuộc vào sự có mặt của hệ thống nối đôi liên hợp trong phân tử
và vị trí các nhóm thế.
+ Làm tăng tạo máu do làm tăng tổng hợp acid folic của vi khuẩn đường
ruột, tăng sô lượng hồng cầu và tỉ lệ hemoglobin.
+ Loại trừ dấu hiệu thần kinh do thiếu vitamin

c.

2. Cây chay, một dược liệu có tác dụng chống oxy hoá
2.1 Đặc điểm thực vật [10]

8


Cây chay có tên khoa học là Artocapus tonkinensis A. Chev. ex Gagnep
thuộc họ dâu tằm (Moraceae). Cây to, cao từ 10 đến 15m, phân cành nhiều.
Cành lúc non có lông hung, sau nhẩn, vỏ màu xám. Lá mọc hình so le, xếp
thành hai dãy, phiến lá hình trái xoan hay bầu dục, dài 7 - 1 5 cm, rộng 3 - 7
cm, gốc Iròn, đầu nhọn, mặt trên của lá nhẵn bóng, mặt dưới có lông và các
đường gân. Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái ở cùng một cây. Quả
phức, hình cầu không đều, lúc còn non vỏ nhẵn và màu xanh nhạt, lúc chín
màu vàng có lông nhung, bên trong có nhiều hạt trắng ngà được bọc một lớp
cùi màu đỏ. Cùi ăn được có vị ngọt hơi chua. Mùa ra hoa là tháng 3- 4, mùa
thu hoạch quả là tháng 7 - 8 hàng năm. Cây mọc hoang dại, nhưng do tập tục
ăn trầu bằng vỏ chay nên nhân dân ở một số vùng đã trồng cây chay ở vườn

nhà để lấy vỏ.
2.2 Tình hình nghiên cứu về tác dụng làm thuốc của cây chay.
Trên thế giới chúng tỏi chưa thấy tài liệu nào công bố về tác dụng chữa
bệnh của cây chay.
Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian dùng lá và rễ cây chay sắc uống
để chữa đau lưng, tê m ỏi...Đ ã có nhiều tác giả nghiên cứu về tác dụng chữa
bệnh của các sản phẩm chiết xuất từ lá chay, phân tích các thành phần có hoạt
tính chữa bệnh và bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của nó. GS Phan Trúc
Lâm và cộng sự đã dùng nước sắc lá chay chữa thành công cho những trường
hợp bị bệnh nhược cơ nặng, một bệnh tự miễn phải chữa bằng các thuốc ức
chế miễn dịch như: prednisoỉon, azathioprin... [9]
Phạm Mạnh Hùng và cộng sự đã dùng flavonoid của

G ây

chay với liều

125mg/kg thể trọng trên chuột thực nghiệm ghép da dị gien thấy thuốc có tác
dụng làm kéo dài thời gian sống dư của mảnh da ghép.
Lê Đình Khánh thăm dò tác dụng của flavonoid cây chay với liều 5mg/kg
thể trọng trên chuột ghép thận đồng loại thấy thuốc có tác dụng ức chế thải
ghép.
9


Tại khoa Dược lý, phòng Đông y thực nghiệm, Viện Y học cổ truyền trung
ương đã đánh giá độc tính cấp diễn của flavonoid tổng số từ lá cây chay thấy
LD50 là 5,750 mg/kg thể trọng chuột, liều an toàn tối đa là 1,250 mg/kg thể
trọng chuột.
Nguyễn Thái Hồng , Vũ Tân Trào, Trần Lưu Vân Hiền đã nghiên cứu thấy

tác dụng của f ìavonoỉd lá chay ức chế sự chuyển dạng của limpho bào ở bệnh
nhân Lupus ban đỏ hệ thống [6 ].
Ngô Quốc Anh, Trần Văn Sung đã nghiên cứu về thành phần hoá học và
tác dụng ức chế miễn dịch của fỉavonoid lá chay trên thực nghiệm và bước đầu
nghiên cứu tác dụng trên lâm sàng [ 1 ].
Nhìn chung, các tác giả đã chứng minh được tác dụng ức chế miễn dịch
của Ịìavonoìd lá chay trên thực nghiệm và bước đầu nghiên cứu tác dụng trên
lâm sàng.

10


CHƯONG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
1 Nguyên liệu nghiên cứu
Dược liệu là lá của câv chay, được thu hái tại Phú Thọ. Mẫu cây được xác
định tên khoa học là: Artocarpus tonkinensis A-chev.ex Gagnep, họ dâu tằm
(Moraceae). Mẫu lá được lưu tại phòng Đông y thực nghiệm- Viện y học cổ
truyền Việt Nam.
Lá hái vào tháng 3, chọn những lá xanh tốt, không sâu bệnh. Lá hái về bỏ
cành non, sấy khô ở nhiệt độ 50-60° c trong tủ sấy có thông gió.
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Các phương pháp nghiên cứu hoá học [3], [4], [8]
Định tính các nhóm chất hoá học trong lá chay bằng các phản ứng định
tính.
Định lượng Aavonoid toàn phần trong lá chay bằng phương pháp cân.
Dùng phương pháp sắc kí cột để phân lập các íìavonoid. Rửa giải cột bằng
các hệ dung môi khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng, với bản mỏng silicagel
GF 754 (MERCK) để kiểm tra các phân đoạn thu được.

-

Đo phổ tử ngoại UV-VIS trên máy GBC2855.
Đo phổ hồng ngoại trên máy PERKIN ELMER.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao trên máy IMPACT-400HP.

-

Ghi phổ khối trên máy MS-ENGIN 5989 N/S.
Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy BRUKER AVANCE-500.
( Các phổ được ghi tại viện Hoá-TTKHTN & CNQG và phòng thí nghiệm

trung tâm đại học Dược Hà Nội)
2.2 Phương pháp thử hoạt tính sinh học [13]
Thăm dò tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào gan chuột nhắl
trắng, theo phương pháp của Jawiga Robak ( Ba Lan 1974) và Misno Tanaka
(Nhật Bản 1994). Phưưng pháp này dựa trên sự xác định Malonyldialdehyd


(MDA),một trong các sản phẩm của sự, peroxy hoá lipid. Chất này phản ứng
' với acid thiobarbituric tạo phức hợp trimethine có màu hồng, sản phẩm phức
hợp này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 532nm ( đo quang trên máy
ELx800 tại phòng Đông y thực nghiệm viện YHCTVN ).

12


CHƯONGIII: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
■

■

1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
1.1 Định tính một số nhóm hợp chất trong lá chay
Ạ

Định tính alcaloid:

Cho khoảng 3g nguyên liệu vào bình nón dung tích lOOml, thấm ẩm dược liệu
bằng dung dịch NH 4OH 0,5N. Sau 30phút cho cloroíorm vào, đậy kín. Ngâm
12h, gạn dịch cloroíorm vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ với dung dịch H2S 0 4 IN,
gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid.
- Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3giọt thuốc thử Dragendorff
không thấy xuất hiện tủa da cam.
- Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Maver, không
thấy xuất hiện tủa trắng
- Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat,
không thấy xuất hiện tủa nâu.
Kết luận: Không có alcaloid.
¿*>\* Định tính anthraglycosid:
-Phản ứng Bomtraeger
Lấy 3g nguyên liệu cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 40ml dung
dịchH 2S 0 4, đun sôi cách thuỷ trong 15phút. Để nguội, lọc. Cho dịch lọc vào
bình gạn. Lắc với 5ml ether ethylic, thêm 3ml dung dịch NaOH 10%, thấy lớp
nước màu đỏ sim, lớp ether không màu. Phản ứng dương tính.
-Phản ứng vi thăng hoa:
Đặt một ít dược liệu trong một nắp chai, hơ nhẹ trên đèn cồn cho đến khi bay
hơi hết nước. Đặt lên miệng nắp chai một lam kính, trên lam kính có để một
miếng bông tẩm nước lạnh. Để nắp chai trực tiếp trên nguồn nhiệt, sau 5lOphút lấy lam kính để nguội soi trên kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu
vàng. Phản ứng dương tính.

13


Kết luận: Có anthraglycosid.
ĩ ^ * Định tính acid hữu cơ:
Cho lg nguyên liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp
lOphút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể N aiC03. Không thấy
có bọt C 0 2 bay lên. Phản ứng âm tính.
Kết luận: Không có acid hữu cơ.
^ t * Định tính coumarin:
Lấy khoảng lg dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm 10ml cồn 96°. Đun sôi
cách thuỷ 30phũt. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc làm các phản ứng.
- Phản ứng đóng mở vòng lacton:
+ Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống lml dịch chiết. Thêm vào ống thứ nhất
0,5ml dung dịch NaOH Ỉ0%, ống thứ hai để nguyên. Đun cách thuỷ cả hai
ống nghiệm đến sôi, để nguội, rồi quan sát:
Ống 1: Có tủa đục màu vàng.
Ống 2: Trong.
+ Thêm vào cả hai ống mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, quan sát:
Ông 1: Trong suốt.
Ống 2: Có tủa đục.
+ Acid hoá ống i bằng vài siọt HC1 đậm đặc. ố n g 1 sẽ trở lại như ống 2. Phản
ứng dương tính.
- Phản ứng huỳnh quang:
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên trên giọt đó lgiọt dung dịch
NaOH 10 %. Để khô rồi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại thấy có huỳnh quang.
Phản ứng dương tính.
- Phản ứng diazo hoá:

Cho một lml dịch chiết vào ống nghiệm, Thêm lml dung dịch NaOH 10%.
Đun sôi cách thuỷ 5 phút. Lấy ra để nguội rồi thêm vào đó 2 - 3gịọt thuốc thử
diazo, thấy xuất hiện màu đỏ. Phản ứng dương tính.
Kết luận: Có coumarin.
*0

* Định tính ílavonoid:
Lấy lg dược liệu cho vào ống nghiệm, thêm cồn 90°. Đun cách thuỷ sôi trong
lOphút. Lọc nóng, dịch lọc để làm phản ứng định tính.
- Phản ứng cyanidin (phản ứng khử hoá):
Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm một ít bột magiê kim loại và 5 giọt
HC1 đặc, lắc đều rồi đun nóng cách thuỷ, khoảng 5phút sau xuất hiện màu đỏ
đậm. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:
Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy
xuất hiện tủa xanh. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với NH3:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi hơ ỉên miệng lọ amoniac đặc
thấy màu vàng đậm lên. Phản ứng dương tính.
Kết luận: Có ílavonoid.
V-* Định tính tanin:
Cho vào ốníĩ nghiệm 12 dược liêu, thêm lOml nước cất, đun sôi trực tiếp
5phúí. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc ỉàm các phản ứng sau:
- Phản ứng với gelatín 1%:
Cho lm l dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa
bông trắng. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dung dịch F e ơ 3 5%:
Cho lml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt FeCl3 5%, lắc thấy xuất hiện
tủa xanh.

Kết luận: Có tanin.

15


Ị- f * Định tính glycosid tim:
Cho vào bình nón duns tích 100ml khoảng I 0 g dược liệu, thêm 80ml cồn 25°.
Ngâm 24giờ, gạn lấy dịch chiết. Loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% dư.
Lọc bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn và lắc kỹ 2 lần với cioroform mỗi lần
20ml, gạn lấy dịch cloroform vào cốc thuỷ tinh. Bốc hơi cách thuỷ đến khô.
Cắn được hoà tan bằng cồn 90°, dịch chiết cồn để làm phản ứng định tính
glycosid tim.
- Phản ứng Legal:
Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprussiat
1% và vài giọt dung dịch NaOH 10% để đảm bảo kiềm dư, không thấy xuất

hiện màu hồng. Phản ứng âm tính.
- Phản ứng Baljet:
Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0,5ml thuốc thử picrosodic, không
thấy xuất hiện màu đỏ da cam. Phản ứng âm tính.
- Phản ứng Lieberman:
Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ thành cắn. Cho tiếp vào
0,5ml anhyđricacetic. Lắc đều cho đến khi tan hết cắn. Đặt nghiêng ống
nghiệm 45°. Cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc (0,ômi) theo thành ống
nghiệm, để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp. ở giữa hai lớp chát
lỏng không ĩhấy xuất hiện một vòng tím đỏ. Phản ứng âm tính.
-Phản ứng Keller-kiliani:
Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, cồ cách thuỷ thành cắn. Cho tiếp vào i mỉ
FeCl3 5% trong acid acetic, nghiêng ống nghiệm, cho rừ từ acid sulfuricáặc
theo thành ống nghiệm. Không thấy vòng màu đỏ giữa hai lớp phân cách.

Phản ứng âm tính.
Kết luận: Không có glycosid tim.
<1

* Định tính saponin:

16


- Cho 2 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh trong 15
giây, không có bọt. Phản ứng âm tính.
Kết luận: Không có saponin.
0

* Định tính đường khử:
Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml cồn. Đun cách thuỷ
lOphút, lọc. Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt TT FelingA
và 3 giọt FelingB, đun cách thuỷ trong ìophút, thấy có tủa đỏ gạch. Phản ứng
dương tính.
Kết luận: Có đường khử tự do.

1

* Định tính chất béo:
Lấy lOg bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài, dung tích 50ml đổ ngập
ether dầu hoả, ngâm aua đêm, lọc. Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc hơ
nóng cho bay hơi dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc. Phản ứng
âm tính.
Kết luận: Không có ehất béo.

1\

* Định tính sterol:

Lấy 5g dược liệu cho vào cốc có mỏ dung tích 100ml, thêm 40ml nước đun
cánh thuỷ l-2giờ, lọc, lấy dịch chiết rồi đun cách thuỷ với H2S 0 4 loãng. Sau
đó lắc với cloroform, gạn lấy lớp cloroform làm phản ứng Saikowski. Lấy dịch
chiết vào ống nghiệm thêm từ từ H 2S 0 4 đặc theo thành ống, thấy giữa mặt tiếp
xúc của hai lớp chất lỏng có môt vòng màu đỏ. Phản ứng dương tính.
Kết luận: Có sterol.
Kết quả định tính các nhóm chất trong lá chay tóm tắt ở bảng 1.

17


Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lú chay
Nhóm chất

TT

Alcaloid

1

Glycosid tim

2

Flavonoid

3

Phản ứng định tính

Kết quả

TT Mayer

-

TT Dragendorff

-

TT Bouchardat

-

Phản ứng Lieberman

-

Phản ứng Baljer

-

Phản ứng Legal

-

Phản ứng Kellerkiliani

-

Phản ứng Cyanidin

+++

Phản ứng với kiềm

+++

Đánh giá sơ bộ Ị

Không có

Không có

Có

1

1
1

Ị

Phản ứng với FeCl3 5%
Phản ứng mởđóngvòng Lacton
4

* Coumarin

5

+++

Ị

+

Phản ứng với TT Diazo

++

Phản ứng huỳnh quang

1

Saponin

Hiện tượns tạo bọt

-

Tanin

Phản ứng với FeCl3 5%

CÓ

Khồng có

++
Có

6

7

ị

Anthranoid

Phản ứng với gelatin 1%

+

Phản ứng Bomtraeger

+

Phán ứng vi thăng hoa

+

ỉ

Có
11

;

8

Acid hữu cơ

Phản ứng với Na-,C03

9

Đường khử

Với TT Fehling (A và B )

10

Chất béo

Vết mờ trên giấy lọc

-

Không có

11

Sterol

Phản ứng Salkowski

+

Có

Acid amin

Với TT Ninhydrin 3%

12

1

1

ị
ị1
Iỉ
Ị

+ Phản ứng dương tính rõ.

++ Phản ứng dương tính vừa.

- Phản ứng âm tính.

18

'

Có

j
ị
ị

Có

Ký hiệu:
+++ Phản ứng dương tính rất rõ.

Khỏng có


*Nhận xét: Qua các phản ứng định tính sơ bộ, chúng tôi thấy trong lá chay
có chứa ílavonoiđ, anthranoid, đường khử tự do, acid amin, sterol, coumarin,
tanin, không thấy có alcaloiđ, glycosid tim, saponin, acid hữu cơ, chất béo.
1.2 Định lượng Aavonoid toàn phần trong lá
• Loại tạp:
Trong lá chay có nhiều cloroíin, có thể tan trong ether dầu hoả, đoroíorm ,
ethylethylic. Lấy 2g bột lá chay cho vào bình soxhlet chiết với từng loại dung
môi. Dịch chiết được thử flavonoiđ bằng cách rỏ giọt trên giấy lọc rồi hơ
amoniac. Kết quả cho thấv ether dầu hoả có khả năng loại cloroíin tốt nhất mà
không hoà tan ílavonoid.
•

Định lượng:
Cân chính xác khoảng 5g bột lá chay đã xác định độ ẩm. Cho vào bình

soxhlet chiết với ether dầu hoả trên cách thuỷ cho đến khi dịch chiết trên bình

hết màu xanh. Lấy gói dược liệu ra để ở nhiệt độ phòng cho bay hơi hết dung
môi, tiếp tục chiết bằng methanol cho đến khi dịch chiết trên soxhlet hết màu
vàng. Cất thu hồi methanoỊ hoà tan cắn bằng nước nóng, lọc để nguội rồi lắc
với ethylacetat nhiều lần trong bình gạn cho tới khi lớp ethylacetat hết màu
vàng. Gộp dịch chiết ethylacetat lại bốc hơi dung môi thu được cắn ílavonoid
toàn phần. Sấy cắn ở 60°c đến khối lượng không đổi. Cân khối lượng cắn thu
được.
* Công thức tính:
Hàm lượng Ptp = ___t ___ 100
a (ì-m )
b: Khối lượng Ftp
a: Khối lược dược liệu,
m: Độ ẩm.

19


Bảng 2 Kết quả định ỉượnqỷĩavonoỉd toàn phần
Khối lượng dược

Độ ẩm

Khối lượng Ftp

Hàm lượng Ftp trong

liệu (g)

(%)

(g)

lá (%).

1

5,0127

5,9

0,0920

1,95

2

5,0018

5,9

0,0853

1,81

3

5,0050

5,9

0,0721

1,53

4

5,0089

5,9

0,0905

1,92

5

5,0140

5,9

0,0913

1,94

STT

Số mẫu n = 5. Đo độ ẩm trên máy GRAINERII.
* Giá trị thực được tính theo công thức:

-

s

Trong đó:
ỊLi:

giá trị thực

x: giá trị trung bình
Với a = 0,95.
ta : là một hệ số phụ thuộc vào số bậc tự do k=n-l và phụ thuộc vào độ
kỳ vọng a.

s : Độ lệch chuẩn:
S2

X ( * ..- * ) 2

n -1
Dùng phương pháp toán thống kê tính được hàm lượng Ftp = 1,83 ± 0,19 %.
1.3 Chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá chay
Lấy 500g dược liệu được sấy khô ở 60°c, đem tán nhỏ. Bột dược ỉiệu
được chiết cách thuỷ bằng 1500ml nước trong 5giờ, lọc lấy dịch chiết nước, bã
dược liệu được chiết lần nữa với lOOOmỉ nước trong 4giờ, lọc và gộp dịch
chiết của 2 lẩn. Dịch chiết nước được loại tạp bằng n- hexan sau đó chiết

20