Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của phương thuốc tam hoàng thang
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (17.62 MB, 46 trang )
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THU THUỶ
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
★
★
★
★
★
★
★
★
★
★
ị
★
★
★
★
★
★
★
★
*
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN c ủ a
I
PHƯƠNG THUỐC TAM HOÀNG THANG
*
★
( KHOẢ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1997-2002)
Ị
★
★
★
★
★
PGS.TS.PHẠM XUÂN SINH
ThS. NGUYỄN THẾ HÙNG
BỘ MÔN DƯỢC HỌC c ổ TRUYỀN
PHÒNG VI SINH - KHÁNG SINH - BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP Dược
Thời gian thực hiện: 04/03/02 - 25/05/02.
*
í
í
★
★
★
★
★
★
JÍỜ1 @cí/n ƠQI
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
PGS. TS. PHẠM XUÂN SINH
T hs. NGUYỄN THÊ HÙNG
là những người đã tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn
TS. CAO VĂN THU - PHÒNG VI SINH - KHÁNG SINH
BỘ MÔN CÔNG NGHIỆP Dược
đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình nghiên cứu và làm
việc tại cơ sở.
Đồng thời tôi xin cảm ơn các phòng ban chức năng, các thầy cô trong BỘ
MÔN DƯỢC HỌC C ổ TRUYỀN, các đồng nghiệp đã giúp tôi hoàn thành khoá luận
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội ngày 25 tháng 5 năm 2002
SINH VIÊN
NGUYỄN THỊ THU THUỶ
m a•m m m
•
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ể.............................................................................................................................1
PHẦN 1 TỔNG QUAN...........................................................................................................2
1.1 Vài nét về thuốc thang của Y Học cổ Truyền........................................ 2
1.2 Phương thuốc Tam Hoàng Thang..............................................................2
1.3 Các vị thuốc trong phương Tam Hoàng Thang....................................... 5
1.3.1 Hoàng Liên...........................................................................................5
1.3.2 Hoàng B á .............................................................................................. 8
1.3.3 Hoàng Cầm......................................................................................... 11
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ............................................................... 14
2.1 Nguyên vật liệu..........................................................................................14
2.2 Phương pháp nghiên cứu..........................................................................15
2.2.1 Sắc thuốc............................................................................................ 15
2.2.2 Nghiên cứu về hoá học.....................................................................15
2.2.3 Nghiên cứu tính kháng khuẩn.........................................................18
2.3 Kết quả và nhận xét.................................................................................22
2.3.1 Nghiên cứu về nguyên liệu..............................................................22
2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính......................................25
2.3.3 Nghiên cứu tính kháng khuẩn........................................................ 35
2.4 Bàn luận..................................................................................................... 39
PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT............................ ....................................................40
3.1 Kết luận.....................................................................................................40
3.2 Đề xuất...................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................41
QUI ƯỚC VIẾT TẮT
HB
Hoàng Bá
HC
Hoàng Cầm
HL
Hoàng Liên
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
THT
Tam hoàng thang
TT
Thuốc thử
YHCT
Y Học Cổ Truyền
ĐẶT VẤN ĐỂ
Để tồn tại và phát triển, con người đã luôn tìm ra những phương cách
nhằm chống lại, hạn chế những tác động của thiên nhiên và môi trường ảnh
hưởng đến sức khoẻ của mình. Một trong những phương cách đó là sử dụng
thuốc y học cổ truyền.
Lúc đầu, con người sử dụng cây cỏ quanh mình để chữa bệnh theo kinh
nghiệm bản thân. Theo thời gian các kinh nghiệm đó được đúc kết lại thành
những nguyên tắc, lý luận tương đối hoàn chỉnh, giúp việc sử dụng thuốc cổ
truyền mang tính khoa học hơn.
Hiện nay thuốc y học cổ truyền đã và đang trở thành một xu thế mạnh
không chỉ ở nước ta mà còn nhiều nước trên thế giới. Một số bệnh nan giải
như gan, thận, bệnh mạn tính... cũng được chữa bằng thuốc cổ truyền cho kết
quả tốt. Vì thuốc cổ truyền có tác dụng điều hoà âm dương, cân bằng sự hoạt
động giữa các bộ phận trong cơ thể. Mặt khác, khi sử dụng hầu như không có
tác dụng phụ.
Để góp phần nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng của phương
thuốc, chúng tôi đã tiến hành “ Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng
kháng khuẩn của phương thuốc TAM HOÀNG THANG ” - một phương
thuốc kinh điển của y học cổ truyền với mục tiêu sau đây:
1. Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của phương thuốc THT.
2. Nghiên cứu tính kháng khuẩn của phương thuốc THT.
1
PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.1 VÀI NÉT VỀ THUỐC THANG CỦA YHCT.
- Thuốc cổ truyền là một vị thuốc sống hoặc chín hay một chế phẩm thuốc
được phối ngũ ( lập phương ) và bào chế theo phương pháp của YHCT từ một
hay nhiều vị thuốc có nguồn gốc thực vật, động vật, khoáng vật, có tác dụng
chữa bệnh hoặc có lợi cho sức khoẻ con người [2].
- Trên thực tế, người ta thường phối hợp các vị thuốc với nhau hơn là dùng
riêng lẻ. Việc phối hợp thành phương thuốc ( đặc biệt là thuốcthang ) nhằm
làm tăng tác dụng, giảm độc tính trong điều trị bệnh.
- Thuốc thang là một trong những dạng thuốc của YHCT được cấu tạo từ
những dược liệu đã chế biến và được bào chế bằng cách sắc với nước ở nhiệt
độ bằng hoặc thấp hơn 100°c. Thuốc thang có thể ngâm với rượu ở nhiệt độ
thường trong thời gian dài [7].
- Thuốc thang được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá do đó đưa lại hiệu quả
nhanh, hay dùng trong bệnh cấp tính [7].
- Thuốc thang được cấu tạo dựa trên nguyên lý của YHCT, theo nguyên tắc có
đủ các thành phần: Quân ,Thần, Tá, Sứ [5].
1.2 PHƯƠNG THUỐC TAM HOÀNG THANG.
THT là phương thuốc kinh điển, được sử dụng chủ yếu trong các trường hợp
nhiệt nhập vào phần dinh, phần huyết, phần tâm bào, gây sốt cao, mê sảng, bất
tỉnh, thần chí không ổn định, đôi khi phát cuồng co giật [2,5,8,17,18].
THT được cấu tạo từ 3 vị thuốc thuộc loại thanh nhiệt táo thấp. Do 3 vị có
màu vàng nên có tên phương THT.
* Công thức của THT:
Hoàng Liên
Hoàng Bá
đồng lượng
Hoàng Cầm
2
Trong đó HL có tác dụng tả hoả ở tạng tâm, lại có thể dẫn thuốc đến các tạng
phủ bị bệnh nên vừa là Quân vừa là Sứ. HC có tác dụng tả hoả ở thượng tiêu,
t
ở tạng phế, làm tăng tác dụng hạ sốt của HL; HB có tác dụng thanh nhiệt chủ
yếu ở hạ tiêu, bàng quang, làm tăng tác dụng hạ sốt của HL nên HC, HB vừa
là Thần vừa là Tá.
* Cách dùng-liều dùng.
- Thường được dùng dưới dạng sắc.
- Uống 2 lần trong ngày.
* Chú ý khi dùng:
- Không nên dùng với người âm hư, tỳ hư, tiết tả.
- Các vị thuốc trong bài đều có vị rất đắng, do đó khi sử dụng cần chú ý về
liều lượng và thời gian sử dụng. Không nên dùng liều cao kéo dài, vì sẽ làm tê
liệt thần kinh vị giác, gây cảm giác ăn không biết ngon hoặc buồn nôn [2,4].
- Gần đây người ta đã bào chế dưới dạng cải tiến - Viên nén.
* Một số bài thuốc có nguồn gốc từ phương THT.
Từ cổ phương THT, các lương y đã gia giảm tạo nên những phương thuốc mới
như:
(1). Tam Hoàng Giải Độc Thang [17].
Hoàng liên 8g
Hoàng cầm 8g
Hoàng bá
Chi tử
8g
12g
Có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, giải độc ở tam tiêu. Chủ trị phiền táo, nhiệt
độc, sốt cao, nôn ra máu, chảy máu cam.
Bài thuốc còn có tên Hoàng Liên giải độc thang và đã được nghiên cứu về ảnh
hưởng của phương pháp sắc đến hàm lượng hoạt chất trong bài [14].
(2). Tam Hoàng Cự Thắng Thang [17,18].
Hoàng Liên 3,2g
Mang Tiêu
4g
Thạch Cao
12g
Hoàng Bá
Chỉ Thực
8g
Cam Thảo
3,2g
Đại Hoàng
8g
8g
Hoàng Cầm 8g
Có tác dụng trị dương độc, phát cuồng, phiền khát, đại tiện táo bón, thở gấp.
3
(3). Tam Hoàng Thục Ngải Thang [17,18].
Hoàng Liên
Hoàng Cầm
Hoàng Bá
Thục Ngải
Lượng bằng nhau.
Có tác dụng trị chứng đậu, sởi, ỉa chảy ra máu mủ hôi thối, cơ thể phát sốt,
phiền khát.
(4). Tam Hoàng Thạch Cao Thang [17,18].
Hoàng Bá
4g
Thạch Cao lOg
Tri Mẫu 6g
Hoàng Liên 8g
Huyền Sâm 4g
Cam thảo 2,8g
Hoàng Cầm 6g
Có tác dụng trị tam tiêu thực nhiệt.
* Hiện nay, Bệnh viện Y học Dân Tộc Cao Bằng đang sử bài thuốc có tên Bột
Tam Hoàng; trên cơ cở gia giảm một số vị thuốc của phương THT để phòng
nhiễm khuẩn sau khi thắt trĩ. Bài thuốc có thành phần:
Hoàng Liên
1 kg
Hoàng Bá nam
1 kg
Hoàng Đằng
1 kg
CuS04
100 g
1.3 CÁC VỊ THUỐC TRONG PHƯƠNG.
1.3.1 HOÀNG LIÊN
* Đặc điểm thực vật, phân bố, thu hái.
Có nhiều loại HL chân gà: Coptis chinensis Franch.; Coptis teeta Wall.;
( 2 loài này có ở Việt nam [11] ); Coptis teetoides C.Y. Cheng.; Coptis
deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao.; Coptis quinqueseeta W.T. Wang., Coptis
omeiensis ( Chen ) C.Y.Cheng, Họ Hoàng Liên-Ranunculaceae. Ở Trung
Quốc có tất cả các loài HL trên.
HL chân gà Coptis chinensis Franch.,
thuộc cây thảo, sống nhiều năm.Thân rễ
màu vàng thường phân nhánh. Lá có
cuống dài tập trung ở gốc, phiến lá chia
thành 3 thuỳ chính, mép răng cưa không
đều. Hoa nhỏ màu vàng mọc thành tụ
tán trên một cuống dài khoảng 25cm, có
khoảng 20 nhị, 8-12 lá noãn rời nhau.
Hình 1: Hoàng Liên
Quả đại [3,9,10,11,13,21].
HL thường mọc ở vùng núi cao 1500-1800m. Ở nước ta, HL mọc trên núi
Hoàng Liên Sơn ( Lào C ai), Quảng Bạ ( Hà Giang ). Ở Trung Quốc, HL mọc
hoang và trồng ở Vân Nam,Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam.. ..[3,13].
Sau khi trồng 4-5 năm, người ta đào cả cây, loại bỏ đất cát, cắt loại thân lá,
đem phơi, sấy khô rồi đóng gói.
* Bộ phận dùng.
Thân rễ - Rhizoma Coptidis
Là những mẩu cong queo, dài 3-5cm, rộng 0,2-0,5cm, có nhiều đốt khúc
khuỷu và phân nhánh nhiều. Nhánh trông giống hình chân gà, mặt ngoài màu
vàng nâu mang vết tích rễ phụ và cuống lá. Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang
5
không phẳng, phần gỗ màu vàng tươi, không mùi, vị rất đắng [1,3,6,20,21].
Các loại HL khác, thân rễ màu vàng, ít phân nhánh cũng cố bán trên thị
trường Việt Nam.
- Bột: Màu vàng ,vị rất đắng. Dưới tia tử ngoại có huỳnh quang màu vàng tươi.
Soi kính hiển vi thấy: tế bào mô cứng hình tròn hay nhiều cạnh; hạt tinh bột
hình trứng hay bầu dục; mảnh bần màu vàng nâu; mạch mạng; sợi có thành rất
dày [1,3,6].
* Chế biến.
HL được chế biến theo nhiều cách khác nhau, cụ thể được chế biến thành: HL
phiến, HL ủ rượu, HL trích nước gừng, HL trích với ngô thù du, HL sao vàng,
HL sao đất, HL thán, HL chế giấm, HL trích muối, HL trích mật lợn [16].
* Thành phần hoá học.
Thân rễ HL chứa nhiều Alcaloid ( 5-8% ) trong đó chủ yếu là Berberin. Ngoài
ra còn có Palmatin, Worenin, Coptisin, Jatrorizin, MagnoAorin, Columbamin,
Urbenin, Acid íerulic [3,19,22].
Công thức cấu tạo của một số Alcaloid phân lập từ rễ HL:
Berberin Rị+ R2 = - CH2 Palmatin Rj = R2 = - CH3
Jatrorizin R|= - H
Worenin
V— CH =
h 3c o
CH — COOH
Acid íerulic
6
H3CO
HO
Columbamin
Từ Berberin, Palmatin người ta hydro hoá tạo
Tetrahydroberberin và Tetrahydropalmatin có công thức:
OCH3
OCH,
Tetrahydroberberin: R|+ R2 = - CH2 Tetrahydropalmatin: Rị = R2= - CH3
* Tác dụng sinh học của HL.
- Tác dụng kháng khuẩn: Nước sắc HL có phổ kháng khuẩn rất rộng. Nước
sắc thể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở những nồng độ pha loãng sau: nồng
độ 1:5120 có tác dụng trên Shigella shiga; nồng độ 1:2560 có tác dụng với
Shigella dysenteriae; nồng độ 1:1640 có tác dụng với Staphylococcus aureus;
nồng độ 1:640 có tác dụng với Bacillus cholerae; nồng độ 1:80 với Bacillus
coli, Bacillus proteus; nồng độ 1:5 với Bacillus pyocyaneus [3].
Cơ chế tác dụng do Berberin ức chế sự tổng hợp ARN, protein và ngăn ngừa
sự chuyển hoá hydradcarbon của vi khuẩn.
- HL có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và quá trình thực bào; là tác
nhân kháng độc tố, kháng viêm. HL có thể gây hạ huyết áp do tác dụng vào
thụ thể M ( muscarinic ) và làm giảm hoạt động của enzym cholinesterase. HL
có tác dụng chống thiếu máu cục bộ ở não do giảm sự ngưng kết tiểu cầu và
7
giảm lượng Thomboxan A2. Nó tăng cường chức năng tâm thất trái khi đã suy
yếu bởi tính hướng cơ đặc hiệu và giãn mạch nhẹ toàn cơ thể [19].
- HL chế gừng có tác dụng hạ sốt tốt, HL chế giấm có tác dụng lợi mật tốt [1].
- Ngoài ra HL còn có tác dụng trên virus cúm, amip và một số nấm gây bệnh
ngoài da [14].
- Sản phẩm hydro hoá của Berberin là Tertrahydroberberin, có tác dụng an
thần, mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [3].
* Công dụng, liều dùng.
Theo đông y HL vị đắng tính hàn, qui vào 5 kinh: can, đởm, tâm, vị, đại
tràng. HL có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, giải độc hạ hoả, chỉ huyết, thanh
tâm trừ phiền, thanh can sáng mắt. Dùng để chữa sốt cao, mê sảng, lỵ, tâm hoả
thịnh, nôn ra máu, đau mắt đỏ, mất ngủ.
Ngày dùng 2-12g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột [2,4,8,23,24].
1.3.2 HOÀNG BÁ
* Đặc điểm thực vật, phân b ô , thu hái.
Có 2 loài HB: Phellodendron amurense Rurp. và Phellodendron chinense
Schneider, thuộc họ Cam -Rutaceae.
HB thuộc cây gỗ, cao 10-25cm, cành
rất phát triển.vỏ màu nâu hoặc màu
xám nhạt, vỏ phân thành hai lớp; lớp
bần dày có đường rách dọc, lớp trong
màu vàng tươi. Lá kép lông chim, có
khoảng 5-13 lá chét, mép lá có răng
cưa. Phần gốc của gân mang lông che
chở mềm. Hoa nhỏ màu vàng, mẫu 5,
đơn tính khác gốc. Quả mọng hình cầu
[3,7,10,13,21].
Hình 2: Hoàng Bá
HB mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc, Xiberi. Việt Nam đã di thực và
trồng thí nghiệm thấy cây mọc tốt nhưng chưa trồng trên qui mô lớn, còn phải
nhập của Trung Quốc [3].
Vỏ thu hái ở cây đã trồng trên 10 năm, thường thu hái vào mùa hạ, cạo sạch
lớp bần, cắt thành từng miếng phơi khô [3,13].
* Bộ phận dùng.
Vỏ thân, vỏ cành già - Cortex Phellodendri.
Vỏ thân màu nâu, dày 0,3 -0,5cm, dài 20 - 40cm, rộng 3-6 cm. Mặt ngoài
có chỗ còn sót lại lớp bần mầu nâu đất, có những vết lõm sần sùi và rãnh dọc.
Mặt trong màu nâu nhạt, có các vết nhăn dọc nhỏ, dài. Vết bẻ lởm chởm màu
vàng rơm.Thể chất chắc, nhẹ [3,7,20,21].
- Bột: Màu vàng tươi, vị rất đắng. Soi kính hiển vi có: đám sợi màu vàng có
vách dày hoá gỗ; sợi chữa tinh thể hình lăng trụ; mảnh mô mềm với các tế bào
hình tròn; mảnh bần màu vàng nâu hình chữ nhật [3,7].
* Chê biến.
HB được chế biến bằng nhiều cách khác nhau, cụ thể được chế thành: HB
phiến, HB sao, HB trích rượu, HB trích muối, HB thán [16].
* Thành phần hoá học.
Thành phần hoá học chính là Alcaloid trong đó chủ yếu là Berberin còn có
một lượng nhỏ Palmatin, Phellodendrin, MagnoAorin, Jatrorizin, Candixin,....
Phellodendrin
Obakunon
9
HO
CH2 — CH2— N(CH3)3
Candixin
R .o
R
OH Phellodendrozid
OH
R2
glucose
H
H
H
glucose
H
Dihydrophellozid H
glucose
glucose
Phellamurin
Ố
^
Rị
* Tác dụng sinh học của Hoàng Bá.
- Tác dụng kháng khuẩn: HB có tác dụng kháng khuẩn tốt,đặcbiệt tốt trên
Bạch hầu, Liên cầu, Tả, Lỵ, Salmonella [3,14,19].
- HB có tác dụng kích thích hoạt động thực bào của bạch cầu. Nó có tác dụng
giãn mạch, tăng tuần hoàn vành, hạ huyết áp [15,19].
- Hợp chất Lacton trong HB có tác dụng ức chế thần kinh trung ương và gây
hạ đường huyết ở thỏ [13].
- Phellodendrin có tác dụng ức chế miễn dịch nhưng khác Prednisolon và
Cyclophosphamid do không ảnh hưởng đến sự sản xuất kháng thể của hồng
cầu cừu và chuột [19].
* Công dụng, liều dùng.
Theo đông y, HB vị đắng tính hàn quy vào 3 kinh: thận, bàng quang, tỳ.
HB có tác dụng tư âm giáng hoả, thanh nhiệt táo thấp, giải độc tiêu viêm được
dùng trong các trường hợp âm hư phát sốt, hạ tiêu thấp nhiệt ( như bàng
quang thấp nhiệt dẫn đến tiểu tiện ngắn đỏ hoặc buốt rắ t), còn dùng khi cơ
thể bị thấp chẩn, lở ngứa, mun nhọt.
Ngày dùng: 6 - 12 g dưới dạng thuốc sắc hoặc thuốc bột [2,4,23,24].
10
1.3.3 HOÀNG CẦM.
* Đặc điểm thực vật, phân bố, thu hái.
HC - Scutellaria baicalensis Georgi, Họ hoa môi - Lamiaceae.
HC là cây thuộc thảo nhiều năm,
cao khoảng 20 - 50 cm, thân
đứng vuông, lá mọc đối, cuống
ngắn hoặc không có. Phiến lá
hình mác, mép nguyên. Hoa mọc
hướng về một phía ở ngọn. Hoa
hình môi, màu xanh lơ, có 4 nhị,
Hình 3: Hoàng Cầm
bầu 4 ngăn [3,7,9,10,13,21].
HC mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc ( Hắc Long Giang, Hà Bắc,
Vân Nam... .)• Hiện nay HC còn phải nhập từ Trung Quốc [3,13].
Rễ HC được thu hái vào mùa xuân hoặc mùa thu. Khi thu hái, bỏ rễ con,
thân lá, phơi gần khô thì đập bỏ lớp vỏ ngoài rồi lại phơi khô.
* Bộ phận dùng.
Là rễ cây HC Radix Scutellariae.
Dược liệu hình truỳ, vặn xoắn, dài 8 - 2 5 cm, đường kính 1 - 3 cm. Mặt
ngoài màu nâu vàng hoặc vàng thẫm, rải rác có vết rễ con hơi lồi. Trên vỏ có
những vết dọc vặn vẹo hoặc vân dạng mạng. Phần dưới có các sọc dọc và các
vết ngăn nhỏ. Thể chất chắc, dòn, dễ bẻ. Mặt bẻ màu vàng thẫm, giữa có lõi
màu nâu đỏ. Rễ già bên trong có bột vụn màu nâu hoặc đen nâu. Dược liệu bị
ẩm sẽ chuyển thành màu xanh vàng [3,7,20].
- Bột màu vàng hay màu nâu, vị đắng. Soi kính hiển vi thấy: sợi rải rác hay tập
trung thành bó, hình thoi, thành dày, ống lỗ nhỏ; mảnh mô mềm chứa hạt tinh
bột; tinh bột kép đôi hay kép ba; tế bào mô cứng có thành dày; mảng mạch
chấm và mạch điểm [3,7].
11
* Chế biến.
HC được chế biến bằng nhiều cách khác nhau, cụ thể được chế thành: HC
phiến, HC tẩm rượu, HC sao tồn tính, HC sao cháy cạnh, HC trích mật, HC
trích gừng [16].
* Thành phần hoá học.
Thành phần chính là Aavonoid như Baicalein, Baicalin, Scutellarein,
Scutellarin, Wogonin, Wogonosid, 7- Metroxynorwogonin, Scullcapílavon I,
II.
Ngoài ra còn có Tanin thuộc nhóm Pyrocatechin, nhựa [3,19,22].
Công thức cấu tạo một số chất trong rễ Hoàng Cầm:
Baicalein
Baicalin
Scutellarein
Scutellarin
R=
R=
R=
R=
- H;
- Gluc;
- H;
- Gluc;
Wogonin
R= - H;
Wogonosid R= - Gluc;
7- Metroxynorwogonin
R= - CH3;
R j= - H
R j= - H
R ,= - OH
R j= - OH
R j= - CH3
Rị= - CH3
R j= - H
SkullcapAavon I R= - H; Rị= - CH3
SkullcapAavon II R= - OCH3; R|= -OCH3
* Tác dụng sinh học của Hoàng Cầm.
- Tác dụng kháng khuẩn: HC có tác dụng trên Staphylococcus, Streptococcus,
E. coli, Tả, Lỵ, Thương hàn, Bạch hầu... [3,13].
- Tác dụng chống Virus: HC có tác dụng ức chế đối với Virus Influenza [19].
- HC có tác dụng hạ nhiệt, chữa ho, lợi tiểu, an thần, hạ huyết áp [3,15].
- Baicalein có tác dụng hạ sốt yếu hơn Aspirin, còn là tác nhân kháng độc tố.
12
Glycosid của Baicalein là baicalin có tác dụng chống viêm, chống khối u.
Baicalin ngăn ngừa lây nhiễm HIV do ức chế HIV - 1 RT [19].
- Cả Baicalin và Baicalein đều có tác dụng bảo vệ hồng cầu tốt hơn octocoíerol. Ngoài ra Baicalein có tác dụng lợi mật tốt hơn Baicalin [19].
* Công dụng, liều dùng.
HC vị đắng tính hàn, qui vào kinh: tâm, phế, can đởm, đại tràng, tiểu tràng.
HC có tác dụng thanh thấp nhiệt, trừ hoả độc ưu tiên ở thượng tiêu ( tạng
phế ), lương huyết an thai; dùng cho các bệnh phế ung, phế có mủ, viêm
phổi... gây sốt cao. Ngoài ra còn có tác dụng trừ thấp nhiệt ỏ vị tràng, thanh
can nhiệt, chỉ huyết.
Ngày dùng 6 - 15 g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột [2,4,23,24].
13
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU.
* Nguyên liệu.
- Thân rễ HL chân gà (Coptis chinensis Franch.) thu hái trên dãy núi Hoàng
Liên Sơn - Thôn Séo Mý Tỷ, Xã Tả Van, Huyện Sa Pa, Tỉnh Lào Cai.
- Thân rễ HL Trung Quốc mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội.
- Rễ HC (Scutellaria baicalensis Georgi) mua ờ Phố Lãn Ông - Hà Nội.
-V ỏ HB ( Phellodendron sp.) mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội.
- Hoá chất đạt tiêu chuẩn phân tích mua tại CTTNHH HOÁHỌC ỨNG DỤNG- Phố
Lê Thánh Tông - Hà Nội.
- Berberin chuẩn từ trung tâm kiểm nghiệm sở Y Tế Hà Nội.
- Palmatin chuẩn từ Bộ môn Dược Liệu trường Đại Học Dược Hà nội.
- Các môi trường dùng cho nghiên cứu kháng khuẩn được bào chế theo đúng
tiêu chuẩn tại phòng thí nghiệm Vi Sinh - Kháng Sinh, Bộ môn Công nghiệp
Dược Trường Đại Học Dược.
* Đối tượng nghiên cứu.
- Phương thuốc THT được bào chế từ 3 loại dược liệu: HL, HB, HC có cùng
trọng lượng.
- Khả năng kháng khuẩn của THT trên một số vi khuẩn kiểm định.
* Dụng cụ thí nghiệm.
- Máy xác định độ ẩm dược liệu “Precisa HA 6.0
- Máy cất quay thu hồi dung môi “Buchi”.
- Máy đo tử ngoại u v “Camag”.
- Tủ sấy “Shellab” và “Memert”.
- Nồi hấp tiệt trùng.
- Các dụng cụ đo lường đạt tiêu chuẩn kiểm định.
14
2.2
PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.2.1 SẮC THUỐC
Cân 15 g dược liệu ( HL, HB, HC, TH T), thêm 90 ml nước, đun sôi nhỏ lửa
trong 1 giờ, gạn lấy dịch sắc. Tiến hành sắc 3 lần, gộp các dịch sắc, cô nhỏ lửa
còn 15 ml; được dịch sắc 1:1.
2.2 .2 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CHÍNH CỦA PHƯƠNG THT VÀ TỪNG VỊ THUỐC
TRONG PHƯƠNG.
* Định tính Alcaloid bằng phản ứng hoá học.
- Tiến hành sắc như mục (2.2.1) đối với THT và các vị thuốc có alcaloid trong
thành phần.
- Chiết Alcaloid: Lần lượt kiềm hoá từng dịch sắc bằng NaOH 10 %, sau đó
chuyển vào các bình gạn tương ứng. Lắc với chloroíorm (3 lần X 15ml). Tách
lấy lớp chloroíorm vào các cốc tương ứng, acid hoá dịch chloroíorm bằng HC1
10%. Tách lấy lớp acid làm phản ứng với các thuốc thử chung Alcaloid.
- Các phản ứng:
+ Phản ứng với TT Mayer: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt TT Mayer. Nếu xuất
hiện tủa trắng vàng là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với TT Bouchardat: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt TT. Nếu xuất
hiện tủa nâu đỏ là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với TT Dragendorff: 1 ml dịch chiết, thêm2-3 giọt TT. Nếu xuất
hiện tủa màu da cam là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với acid Picric: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3giọt TT.Nếu xuất hiện
tủa màu vàng là phản ứng dương tính.
* Định tính Flavonoid bằng phản ứng hoá học.
- Sắc thuốc như mục ( 2.2.1) được 15 ml dịch sắc HC, 15 ml dịch sắc THT .
- Chiết Flavonoid: thêm từ từ vào từng dịch sắc trên cồn 95° cho đến khi
không thấy xuất hiện tủa thêm. Để lắng, lọc, cô dịch lọc trên nồi cách thuỷ
đến dạng cao mềm. Thêm 10 ml nước sôi, lắc đều cho tan, lọc vào bình gạn.
15
Thêm ethylacetat ( 3 lần X 10 m l), lắc, tách lấy lớp ethylacetat làm phản ứng:
+ Phản ứng với NaOH 10%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml NaOH 10%. Nếu
xuất hiện màu vàng là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng vói Acetat chì 30%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml Acetat chì. Nếu
thấy xuất hiện tủa nâu là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với F e ơ 3 5%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml F e ơ 3 5%. Nếu xuất
hiện tủa màu xanh đen là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với NH3: nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô, đem hơ trên
hơi NH3. Nếu màu vàng tăng lên là phản ứng dương tính.
+ Phản ứng Cyanidin: lml dịch chiết, thêm 0,lg Mg, vài giọt HCL đặc, đun
cách thuỷ vài phút. Nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính.
* Định tính Alcaloid bằng SKLM.
- Chuẩn bị dung dịch phân tích.
Sắc thuốc như mục (2.2.1 ) ta được 15 ml dịch sắc HL, 15 ml dịch sắc HB, 15
ml dịch sắc THT. Cô dịch sắc tới cắn, hoà tan bằng acid HC1 10%, lọc qua
giấy lọc vào bình gạn, kiềm hoá dịch lọc bằng NaOH 10%, lắc với chloroform
(3 lần X 15 ml), tách lấy lớp chloroform, cô trên nồi cách thuỷ còn khoảng 1
ml, ta được dịch phân tích.
- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu.
+ Cân 0,005 g Berberin chuẩn, hoà vào 1 ml chloroíbrm.
+ Cân 0,005 g Palmatin chuẩn, hoà vào 1 ml chloroíorm.
- Chất hấp phụ:
Sử dụng Silicagel G của Merck, bản nhôm tráng sẵn Silicagel GF254 Merck.
- Hệ dung môi khai triển.
+ Hệ 1: Toluen : Aceton : Ethylacetat: Acid formic (5 :2 :2 :ỉ ).
+ Hệ 2: n-Butanol: Acid acetic : Nước ( 7 :1 :2 ).
- Dung dịch hiện màu.
+ Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm.
16
+ Dung dịch Iod 1% trong chloroíorm.
+ Dung dịch Dragendorff.
* Định tính Flavonoid bằng SKLM .
- Dịch chấm sắc ký
Dùng dịch chiết trong ethylacetat nói trên.
- Chất hấp phụ
Sử dụng Silicagel G của Merck, bản nhôm tráng sẵn Silicagel GF254 Merck.
- Hệ dung môi khai triển.
+ Hệ 1: Toluen : Chloroform : Aceton ( 8 :5 :7 ).
+ Hệ 2: Chloroíorm : Acid acetic (9:1 ).
- Thuốc thử hiện màu.
+ Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
+ Hơi NH3 đặc.
+ H2S 0 4 20% trong MeOH.
* Định lượng Alcaloid.
- Định lượng Alcaloid toàn phần bằng phương pháp cân.
+ Nguyên tắc: dựa vào độ tan khác nhau của Alcaloid trong dung môi phân
cực và không phân cực.
+ Cách tiến hành: cân chính xác một lượng dược liệu, xác định độ ẩm, sắc,
loại tạp bằng cách chuyển alcaloid từ dạng bazơ sangdạng muối vàngược lại.
Chiết alcaloid bazơ bằng chloroíorm.
* Định lượng riavonoid.
- Nguyên tắc: dựa vào độ tan của Flavonoid trong cồn cao độ ( 95° ) và
ethylacetat.
- Tiến hành: cân chính xác một lượng dược liệu, xác định độ ẩm, sắc, loại tạp
bằng cồn cao độ, chiết bằng ethylacetat.
* Xử lý kết quả [12].
- Hàm lượng Alcaloid và Flavonoid được tính theo công thức:
(a-b) X 100
x%= ------- ----------- X 100%
m X (100-d)
Trong đó
x% : là hàm lượng phần trăm alcaloid hoặc ílavonoid
a:
làkhối lượng cắn ( kể cả b ì )
b :
là
khối lượng bì
m : là khối lượng dược liệu
d:
độ ẩm dược liệu ( % )
- Dùng phương pháp thônơ kê toán học trong nghành dược để sử lý kết quả:
s
Trong đó:
=
n
Số mẫu làm
X
Giá trị trung bình
s
Độ lệch chuẩn
k
Khoảng tin cậy
t
thay đổi tuỳ thuộc độ tự do n-1 của mẫu
với p = 95% ta có t = 2,776
2.2.3 NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG KHUẨN.
Thí nghiêm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Kháng sinh, Bộ
môn công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội theo phương pháp sử
dụng khoanh giấy lọc.
18
* Chủng vi khuẩn
10 chủng vi khuẩn đã sử dụng gồm:
- 5 chủng vi khuẩn Gram ( + ):
Bacillus subtilis
ATCC 6633 viết tắt là
BS.
Bacillus cereus
ATCC 9946 viết tắt là
BC.
Sarcina lutea
ATCC
9341 viết tắt là
SL.
Staphylococcus aureus ATCC 12228 viết tắt là
Sta.
Bacillus pumilus
BP.
ATCC 10241 viết tắt là
- 5 chủng vi khuẩn Gram ( - ) :
Shigeỉla flexneri
DT 112
viết tắt là
Shi.
Salmonella typhv
DT 220
viết tắt là
Typh.
Escherichia coli
ATCC 25922 viết tắt là
EC.
Proteus mirabilis
BV 108
Pro.
viết tắt là
Pseudomonas aeruginosa VM 201 viết tắt là
Pseu.
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn.
Dùng môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định.
Công thức:
Cao thịt
0,3%.
Pepton
0,5%.
NaCl
0,5%.
Nước cất vừa đủ lOOml.
pH trung tính.
Pha lOOml môi trường, lấy 10 ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống 5ml môi
trường. Đem hấp tiệt trùng ở 117 - 118°c trong 30 phút. Sau đó lấy ra, để
nguội, cấy các chủng vi khuẩn kiểm định vào, mỗi chủng vi khuẩn cấy vào
một ống môi trường ( tiến hành trong tủ cấy vô trùng ). Sau khi cấy xong,
nuôi vi khuẩn trong tủ ấm ở 37°c, thời gian nuôi từ 18 - 24 giờ.
* Chuẩn bị chế phẩm thử và mẫu thử.
- Chuẩn bị chế phẩm thử.
19
sắc như mục ( 2.2.1 ) ta được các dịch sắc: HL tỷ lệ 1:1, HB tỷ lệ 1:1, HC tỷ
lệ 1:1, THTtỷ lệ 1:1.
- Mãu thử.
+ Dung dịch Penicillin G 30 UI = 1 8 |ig/ml.
+ Dung dịch Gentamicin 20 UI = 20 n-g/ml.
* Chuẩn bị khoanh giấy thử.
- Đục khoanh giấy lọc có đường kính D = 6,0 mm, khối lượng từ 33,5 34,0mg.
- Hấp tiệt trùng các khoanh giấy ở nhiệt độ 117 - 1 18°c trong 30 phút, sau đó
sấy khô ở 60°c trong khoảng 5 - 1 0 giờ.
- Cho các khoanh giấy đã tiệt trùng vào 6 đĩa petri sạch khác nhau. Mỗi đĩa
tẩm một trong các dịch: Pen, Gen, HL, HB, HC, THT. Sau mỗi lần tẩm, đem
sấy ở nhiệt độ 50°c cho đến khô. Tẩm 3 lần.
Kết quả: Mỗi khoanh giấy tẩm dịch sắc chứa khoảng 0,8g dược liệu. Mỗi
khoanh giấy tẩm Pen chứa khoảng 1 UI kháng sinh. Mỗi khoanh giấy tẩm Gen
chứa khoảng 0,7 UI kháng sinh.
* Chuẩn bị môi trường thử kháng khuẩn.
Sử dụng môi trường thạch thường có công thức:
Cao thịt
0,3%
Pepton
0,5%
NaCl
0,5%
Thạch
1,6%
Nước cất vừa đủ
lOOOml
pH
trung tính
Pha 1000 ml môi trường, chia vào 10 bình nón dung tích 250ml mỗi bình
lOOml, đem hấp tiệt trùng ở 117-118°c trong 30 phút. Để nguội đến 45-50°C
rồi lần lượt cho mỗi vi khuẩn kiểm định đã nuôi vào mỗi bình nói trên; lắc đều
rồi phân ra 10 hộp petri. Để nguội xuống nhiệt độ phòng.
20
* Thử tính kháng khuẩn.
- Mỗi vi khuẩn làm trên 5 đĩa petri.
- Trên mỗi đĩa petri đã đổ thạch, đặt các khoanh giấy đã tẩm kháng sinh và
dịch sắc theo sơ đồ:
Trong đó:
KS
: Khoanh giấy tẩm kháng sinh
HL
: Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Liên
HB
: Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Bá
THT
: Khoanh giấy tẩm dịch sắc Tam Hoàng Thang
HC
: Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Cầm
Sau khi cấy, để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 10°c trong 2 giờ cho hoạt chất
khuếch tán trong môi trường thạch. Sau đó để các hộp petri vào tủ ấm ở nhiệt
độ 37°c trong 1 8 - 2 4 giờ.
Khi đủ thời gian, đưa ra đọc kết quả và đo các vòng vô khuẩn ( nếu có ).
21
