Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Mắc Rạc (Delavaya toxocarpa French., Sapindaceae)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (9.38 MB, 58 trang )
BỘ Y TẾ
TDƯÒNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
♦ ♦♦
r jfy fç < û a
GÓP PHẨN NGHllN cư ủ THÀNH PHẨN HOÃ HỌC VÀ
MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY MẮC RẠC
(Delavaya toxocarpa French., Saplndaceae)
IKHOẦ LUẬN T ố ĩ NGHIỆP Dược SÎ bẠ\ HỌC KHOẢ 1997-20023
dVgưởL Hướng debí:
íĩ^Piạm ^-Jíianíi U\ij
Îb Æ .J V C S . Cẩn D uyét J v 3 a
<^Nơi iÃựa kiện :
!ẼỘ mân ^Òuợa íiệu.--^Uxư ờ nỹ Í ầ ồ ạ í họ a Í 2 òược c M ~ à dVộ i
O k ờ i CịLaỉi iÃựa íỈLệh: 17ừ 01Ị OSỊ 2 0 0 2 ctến 2& /
Ệ A - ( 0. o ỷ % \
M w -V I Ê \R
HÀ NỘI, THÁNG 5 NĂM 2002
05Ị
2002
LỜ3 c ả m
0®
¿>M xin lừiiị tó lỏntị kínk trọtuỊ ầ ỉùêí fíft tâu iắe tới QcS.ÇJcS.
^[)lt(ỊHỉ ÇJltanh JCụ, ^OS/ÌỈCảS. (ịìín ÇJui Qitịíi - những, ntỊnòi đã tân
tình kưênụ. dẫn em. thựe hiện kítố luận 11(11/.
ốm eũuạ xỉn gửi lồi ếnt ăn tới ếa tkầụ ê qiúú, ếe ễ líĨỊ tkl
ỀIL ti'O/ hộ m ền r/)n'ọe liệu, ếe phồng, ban khóa tronạ DÙ tiíỊOỈii tvtiờtKỊ
đã tạo đỉềií kiện oă ụìúp ítỡ em hồn thành kliúá Luận tốt uụhiêp ỈMìniị
tiiời gian. qua.
(ễUiếi ittạ, tơi dein cảnt tìu tới tất cả bạn bề ồ nqtiòi thản đã (tộtKỊ
oièít, khuụln khích tỏi ivotKị q trinh hón thành Uhố Luận nài/.
Hà Nội, thống 5 năm 2002
ơinh viên
Tăng thị Diệu Linh
LUC
ĐẬT VẤN ĐỂ
Trang
..............................................................................................
PHẦN 1 : TỔNG QUAN ............................................................................ 2
1. Cây Mắc rạc - Delavaya toxocarpa French., Sapỉndaceae ................... 2
1.1.
2
Đặc điểm thực vật và sinh th á i...........................................
1.1.1. Vị trí phân loại của cây Mắc rạc .......................................
2
1.1.2. Đặc điểm thực vật .....................................................
3
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố .............................................
4
1.2.
Thành phần hoá học ................................................
4
1.3.
Tác dụng và công dụng ......................................................
4
1.4.
Những kết quả nghiên cưú bước đầu về cây Mắc rạ c ........................... 4
1.4.1. Nghiên cứu về thực vật ................................................
4
1.4.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học .........................................................5
1.4.3. Thử độc tính cấp của dịch chiết lá ...............................................
5
1.4.4. Thử tác dụng kích ứng trên da của dầu hạt ...............................................5
2.
Tác dụng sinh học của flavonoid nói chung và định hướng
nghiên cứu tác dụng sinh học của flavonoid trong lá Mắc r ạ c .................. 6
PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u . 7
1. Nguyên liệ u .................................................................
2. Phương pháp nghiên cứ u ................................................................
7
7
PHẦN 3 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả ...........................................11
1. Nghiên cứu vê thành phần hoá h ọ c .......................................................... 11
1.1. Nghiên cứu về flavonoid trong lá Mắc r ạ c .............................................. 11
1.1.1. Chiết xuất flavonoid trong l á .....................................................
11
1.1.2. Định tính cắn flavonoid toàn phần bằng phản ứng hoá h ọ c .................. 13
1.1.3. Định tính flavonoid toàn phần bằng sắc ký lớp m ỏng............................14
1.1.4. Định lượng flavonoid toàn phần trong l á .................................................17
1.1.5. Phân lập flavonoid.....................................................................
18
1.1.6. Nhận dạng F q ...............................................................
19
1.2. Nghiên cứu về saponin trong lá Mắc r ạ c ................................................. 21
1.2.1. Chiết xuất saponin trong l á ...............................................................
21
1.2.2. Định tính cắn saponin toàn phần ........................................................ 22
1.2.3. Định tính saponin toàn phần bằng sắc ký lớp m ỏng.......................... 23
1.2.4. Thuỷ phân saponin và định tính sapogenin bằng sắc ký lớp mỏng..... 24
1.2.5. Định lượng saponin toàn phần trong l á ................................................. 25
1.3. Nghiên cứu về dầu hạt Mắc r ạ c ............................................................26
1.3.1. Khảo sát sơ bộ thành phần dầu hạt bằng SKLM................................ 26
1.3.2. Phân tích thành phần các acid béo của dầu hạt bằng sắc ký khí........ 27
1.3.3. Xác định một số chỉ số của dầu hạt ....................................................27
1.3.4. Định lượng dầu béo trong h ạ t.................................................................30
2. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của flavonoid toàn phần.......... 31
2.1. Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột............. 31
2.2. Xác định hoạt tính dọn gốc tự do anỉon Superoxide 0 2' ...................... 36
2.3. Thử tác dụng bảo vệ g a n ...................................................................
38
PHẦN 4 : BÀN L U Ậ N ................................................................................40
1. Bàn luận vê kết quả nghiên cứu thành phần hoá h ọ c ......................... 40
2. Bàn luận về kết quả thử tác dụng sinh h ọ c ............................................41
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT.................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
AS
Ánh sáng
c s — acid
Chỉ số acid
c s — iod
Chỉ số iod
c s — XPH
Chỉ số xà phòng hoá
CNQG
Công nghệ quốc gia
CT
Chỉ thị
Dd
Dung dịch
HTCO
Hoạt tính chống oxy hoá
IC50
50% inhibitory concentration
KHTN
Khoa học tự nhiên
MDA
Malonyldialdehyd
Nm
Nanomet
Nmol
Nanomol
POL
Peroxidation of lipid
p/ư
Phản ứng
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
TT
Thuốc thử
ĐẶT VÂN ĐỂ
Trong xu hướng tìm hiểu và khai thác những nguồn dược liệu quí từ trong
thiên nhiên, chúng tôi đến với Mắc rạc (Dầu choòng), một loài cây được biết
đến về hàm lượng dầu cao trong hạt và đã từng được nhân dân địa phương sử
dụng để trị một số bệnh ngoài da. Nhưng thật lý thú, cây thuốc này không chỉ
có giá trị về mặt sử dụng mà còn rất đáng lưu ý do mang một nguồn gen quí
hiếm. Là một cây có tên trong Sách đỏ Việt Nam, theo các nhà khoa học đây
là đại diện duy nhất của chi Delavaya đặc hữu của nam Trung Quốc và bắc
Việt Nam, với một nguồn gen hiếm và độc đáo. Mặt khác cây còn có ưu điểm
nổi bật về mặt sinh thái là khả năng sống và phát triển được ngay cả trên
những vùng đất cằn cỗi, những vùng núi đá vôi tạo ra triển vọng trồng để phủ
xanh đồi trọc. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu của một số luận văn tốt
nghiệp Dược sĩ đại học mới chỉ là bước đầu và còn rất sơ bộ, do đó chúng tôi
được giao nhiệm vụ tiếp tục nghiên cứu cây Mắc rạc với những nội dung sau:
- Nghiên cứu thành phần íìavonoid và saponin trong lá, dầu béo trong hạt
Mắc rạc.
-
Thử tác dụng chống oxy hoá và tác dụng bảo vệ gan của ílavonoid toàn
phần.
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1. Cây Mắc rạc - Delavaya toxocarpa French., Sapindaceae
1.1. Đặc điểm thực vật và sinh thái
1.1.1. Vị trí phân loại của cây Mắc rạc [7]
Theo hệ thống phân loại của Takhtaijan - 1987 , cây Mắc rạc (còn gọi
là cây Dầu choòng, tên khoa học là Delavaya toxocarpa French., Sapindaceae)
có vị trí như sau :
Bộ Bồ hòn có 9 họ , trong đó 6 họ có đại diện ở Việt Nam và họ Bồ hòn
(Sapindaceae) là họ có nhiều đại diện nhất [7].
Trên thế giới, họ Bồ hòn là một họ lớn (với 140 chi, 1600 loài), phân bố ở
vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, đặc biệt ở châu Á và châu Mỹ [4,10]. Tại Việt
Nam, họ này có 30 chi và 60 loài [10]. Tuy nhiên trong số đó, chi Delavaya lại
2
là chi đơn loài : chỉ có một đại diện duy nhất là cây Mắc rạc [14]. Chính bởi
vậy đây là một loài hiếm, tuy hiện tại chưa phải là đối tượng đang hoặc sẽ bị
đe doạ nhưng sự tồn tại của chúng là mỏng manh.
1.1.2. Đặc điểm thực vật [9,12,14]
Mắc rạc ( Delavaya toxocarpa French., Sapindaceae) là cây gỗ nhỏ, ít khi
cao quá 10 - 12 m, đường kính thân đến 0,3 m. Lá kép lông chim, có 3 lá chét
, mép có răng nằm. Cuống lá dài 3-5 cm. Phiến lá chét giữa hình bầu dục dài,
dài 7-15 cm, rộng 2,5-3 cm, nhẵn cả 2 mặt, có 10-20 đôi gân bậc hai. 2 lá chét
bên nhỏ hơn một chút. Cụm hoa chuỳ, dài 6-12 cm, mọc ở đầu cành, gần như
không lông. Hoa tạp tính to, màu trắng hoặc hồng, thơm. Lá đài 5, hình bầu
dục, dài 4-5 mm, có lông. Cánh hoa 5, hình bầu dục dài hay bầu dục, dài 4-8
mm, không lông. Nhị 8, đính bên trong đĩa, hơi thò ra, có chỉ nhị nhẵn, dài 2
mm. Bầu gần hình cầu, phủ lông màu trắng xám, cuống ngắn, 2-3 ô, mỗi ô 2
noãn, vòi hình dùi. Quả dài 2 cm, rộng 3,5 mm, màu hồng xám, mở làm 2-3
mảnh. Hạt đen dạng hạt nhãn.
Mùa hoa nở : tháng 4-6.
Mùa quả chín : tháng 8-10.
Tái sinh chủ yếu bằng hạt.
Hình 1: Lá và quả Mắc rạc
Hình 2: Cây Mắc rạc mọc ở núi đá vôi
3
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố [9,12,13,14]
Cây mọc trong rừng xanh hoặc rừng phục hồi, thường ở nơi có độ cao
250-2000 m, có thể mọc được trên đất cằn cỗi, ở núi đá vôi. Đây là một ưu thế
quan trọng của loài này trong việc trồng trọt, phát triển và khai thác chúng.
Về phân bố, tại Việt Nam, loài này có tại Hà Giang, Tuyên Quang, Cao
Bằng, Lạng Sơn ; trên thế giới, có ở Trung Quốc (vùng Vân Nam).
1.2. Thành phần hoá học
Theo những tài liệu chúng tôi tham khảo được, chưa thấy tài liệu nào
công bố về thành phần hoá học của cây này, trừ một số tài liệu mới chỉ nói
đến hạt có chứa dầu. Vì vậy, một phần quan trọng trong đề tài của chúng tôi là
nghiên cứu, tìm hiểu về thành phần hoá học của loài này.
1.3. Tác dụng và công dụng
Họ Bồ hòn (Sapindaceae) là một họ lớn và nhiều loài trong họ này có
những giá trị sử dụng rất có ý nghĩa như làm cây ăn quả (nhãn, vải, chôm
chôm...), làm thuốc (long nhãn), và nhiều cây lấy gỗ (cây chành chành, cây
sâng...)[7]
Với Mắc rạc, người ta mới biết đến tác dụng của dầu hạt để diệt một số
ký sinh trùng như ghẻ, chấy hay để trị nấm ngoài da mà nhân dân địa phương
đã từng sử dụng [9]. Ngoài ra, dầu hạt còn được dùng để chế xà phòng , làm
dầu bôi trơn, gỗ cứng của cây được dùng trong xây dựng và đóng đồ gia dụng,
nông cụ. Tuy nhiên với một hàm lượng dầu hạt cao, chắc chắn còn có thể khai
thác thêm ở loài này những ứng dụng vào nhiều ngành công nghệ khác.
1.4. Những kết quả nghiên cứu bước đầu về cây Mắc rạc của nhóm sình
viên làm luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học dưới sự hướng dẫn của
GS.TS. Phạm Thanh Kỳ [1,3]
1.4.1. Nghiên cứu về thực vật
* Lấy mẫu và xác định tên khoa học
4
Nhóm nghiên cứu đã lấy mẫu cây tươi tại Cao Bằng, ép tiêu bản khô,
mô tả đặc điểm thực vật và GS. Vũ Văn Chuyên đã xác định mẫu cây nghiên
cứu là Dầu choòng (Mắc rạ c ), có tên khoa học là Delavaya toxocarpa French.,
Sapindaceae.
* Đặc điểm vi phẫu
Cắt ngang phiến lá phần gân chính, tẩy, nhuộm kép, sau đó quan sát dưới
kính hiển vi thấy các đặc điểm: Gân lá : nổi cao cả hai m ặ t; Biểu bì: gồm một
lớp tế bào hình chữ nhật đều đặn, mặt ngoài hoá cutin dầy; Mô dậu: gồm hai
lớp tế bào hình trụ xếp sát biểu bì trên; Mô dày: cấu tạo bởi những tế bào
màng dày góc, hình nhiều cạnh, nằm ở gân chính, sau biểu bì trên và biểu bì
dưới; Mô mềm: tế bào có màng mỏng; Tinh thể canxi oxalat hình khối nằm rải
rác trong mô mềm và cạnh các bó sợi; Sợi gồm 2-3 lớp tế bào bao vòng quanh
bó libe gỗ; Bó libe-gỗ: libe nằm ngoài, gỗ nằm trong.
* Đặc điểm bột lá
Lá được sấy khô ở 50-60°C. Tán thành bột mịn. Bột có màu vàng nhạt. Soi
kính hiển vi thấy các đặc điểm sau: Mảnh biểu b ì : tế bào hình nhiều cạnh, có
mang lỗ khí hoặc không mang lỗ khí; Tinh thể canxi oxalat hình khối; Mô
mềm: tế bào có màng mỏng, trong có chứa diệp lục; Mạch mạng, mạch xoắn;
Sợi màu vàng nhạt, có khoang rộng .
1.4.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học
Đã định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá bằng phản ứng hoá học, kết
quả cho thấy: dược liệu có chứa flavonoid, saponin, tanin, đường khử tự do,
hợp chất sterol và acid hữu cơ.
1.4.3.Thử độc tính cấp của dịch chiết lá
Đã cho chuột nhắt trắng uống tới liều 240 g dược liệu khô/kg thể trọng
chuột, chuột vẫn không chết. Do đó không tính được liều LD50.
1.4.4.
Thử tác dụng kích ứng trên da của dầu hạt
5
Thí nghiệm được tiến hành trên thỏ, kết quả cho thấy thỏ không có biểu
hiện gì khác thường, không có dấu hiệu thỏ bị ngứa hay khó chịu. Trong tất cả
các lần quan sát sau khi bỏ mẫu thử, khoảng da đặt mẫu thử và khoảng da đối
chứng đều không có phản ứng ban đỏ hoặc phù nề. Thỏ ăn uống và hoạt động
bình thường trong thời gian theo dõi. Do đó các tác giả đã kết luận: Dầu hạt
không gây kích ứng trên da.
2. Tác dụng sinh học của flavonoid nói chung và định hướng nghiên cứu
tác dụng sinh học của flavonoid trong lá Mác rạc
Flavonoid - hay nói chính xác hơn là các dược liệu chứa flavonoid từ
lâu đã được sử dụng rất rộng rãi trong Đồng y theo các bài thuốc y học cổ
truyền. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt ở các lĩnh vực:
hoá học, dược lý, sinh hoá,... vai trò của nhóm chất flavonoid đã được khẳng
định và được chứng minh một cách khoa học. Một loạt các cơ chế tác dụng
được giải thích đã làm rõ các tác dụng sinh học của nhóm chất tự nhiên này
[5] như: tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính dòn và tính thấm của
mao mạch do ức chế tác động của enzym hyaluronidase; tác dụng chống độc
của flavonoid qua việc làm giảm tổn thương gan, bảo vệ chức năng gan khi cơ
thể nhiễm độc; tác dụng chống loét được ứng dụng trong điều trị đau dạ dày;
tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid được chứng minh bằng thực nghiệm
là do khả năng ức chế con đường sinh tổng hợp Prostaglandin và rất nhiều tác
dụng sinh học quan trọng khác trên các tổ chức cơ trơn, trên hệ tiết niệu, hệ
tuần hoàn, hệ thần kinh và gần đây là cả tác dụng chống ung thư và tác dụng
kháng HIV của một số flavonoid. Nhưng trên hết, tác dụng mà các nhà khoa
học đang rất quan tâm ở flavonoid đó là tác dụng chống oxy hoá.
Với sự làm rõ vai trò của các gốc tự do trong các quá trình bệnh lý, việc
tìm ra các chất có hoạt tính chống oxy hoá có ý nghĩa rất lớn trong Y học. Đối
với các flavonoid, hoạt tính chống oxy hoá còn tuỳ thuộc vào nhóm OH và vị
trí của các nhóm OH trong khung phân tử [2]. Tuy không phải tất cả các chất
6
trong nhóm đều có tác dụng này nhưng đa số các Aavonoid có tính chất chống
oxy hoá rõ rệt do
+ khả năng dập tắt các gốc tự do như HO', ROO, ...(theo cơ chế cân bằng
Quinon- Hydro quinon).
+ tạo được phức chelat với các ion kim loại- tác nhân xúc tác của nhiều phản
ứng oxy hoá.
Nhờ đó các Aavonoid này ngăn ngừa các nguy cơ : biến dị, huỷ hoại tế baò,
ung thư, lão hoá, tai biến mạch, thoái hoá gan....
Chính vì vậy, thử tác dụng chống oxy hoá của ílavonoid là một phần
không thể thiếu khi nghiên cứu tác dụng sinh học của ílavonoiđ trong lá Mắc
rạc. Từ giai đoạn nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá invitro bảo vệ tế bào gan
và não (trên chuột) đến giai đoạn thử tác dụng bảo vệ gan invivo của chúng tôi
đều không nằm ngoài xu hướng chung trong định hướng nghiên cưú tác dụng
của Aavonoid.
Cho tới nay, có rất nhiều phương pháp được áp dụng để nghiên cứu tác
dụng chống oxy hoá [16]. Phổ biến là các phương pháp nghiên cứu gắn với
quá trình peroxyd hoá lipid (POL) - quá trình tương tác giữa các dạng oxy
hoạt động với các acid béo chưa no tạo ra những sản phẩm độc hại và các
phản ứng gốc tự do lan truyền trong cơ thể. Thông qua các sản phẩm được tạo
ra từ quá trình này (lượng các dien liên hợp, lượng các gốc tự do, lượng MDA,
các khí etan, pentan giải phóng ra...) có thể đánh giá mức độ xảy ra mạnh hay
yếu của quá trình POL, từ đó xác định được hoạt tính chống oxy hoá của chất
cần nghiên cứu. Ngoài ra có thể đánh giá tác dụng chống oxy hoá thông qua
việc xác định hoạt tính dọn gốc tự do anion superoxide 0 2' . Trong điều kiện
có thể, chúng tôi tiến hành thử tác dụng chống oxy hoá bằng 2 phương pháp:
- Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não trên chuột.
-
Xác định hoạt tính dọn gốc tự do anion superoxide 0 2" .
7
PHẦN 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu
Lá và hạt được thu hái tại Cao Bằng mùa hè năm 1999, 2000, 2001 sau
khi thu hái đem phơi khô để nghiên cứu.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Định tính Aavonoid, saponin trong lá Mắc rạc bằng phản ứng hoá học
theo các tài liệu:
- Bài giảng Dược liệu [5]
- Thực tập Dược liệu [6]
- Phương pháp nghiên cứu hoá học thành phần cây thuốc [11]
- DĐVN II, tập 3 [8]
2.2. Định tính Aavonoid, saponin bằng SKLM [5,6,11,15]
- Bản mỏng Silicagen 60 GF254 của hãng Merck.
- Phương pháp sắc ký 1 chiều, 2 chiều.
2.3. Định tính dầu hạt bằng SKLM
- Bản mỏng tự tráng bằng Silicagen G của Viện Kiểm nghiệm.
-
Phương pháp sắc ký 1 chiều.
2.4. Định lượng lìavonoid, saponin, dầu hạt bằng phương pháp cân.
2.5. Đo độ ẩm dược liệu bằng máy Sartorius (Germany) tại Bộ môn Dược liệu
- Trường ĐH Dược HN.
2.6.Phân lập Aavonoid bằng sắc ký cột: sử dụng silicagen dùng cho SK cột của
hãng Merck, cỡ hạt 15 - 40 ụ,m.
8
2.7. Đo phổ tử ngoại trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary IF varian
(Australia) và đo phổ hồng ngoại trên máy Berman tại Phòng Thí nghiệm
trung tâm- trường ĐH Dược Hà Nội.
2.8. Đo phổ khối trên máy 5989 B-MS tại Phòng Cấu trúc - Viện Hoá học Trung tâm KHTN và CNQG.
2.9.
Xác định các chỉ số của dầu béo theo DĐVNII, tập 3 [8 ].
2.10. Phân tích thành phần các acid béo của dầu hạt bằng phương pháp sắc ký
khí:
Thành phần các acid béo được xác định dưới dạng methylester trên máy
sắc ký khí Shimadzu GC- 17A (Japan), FDI detector, cột mao dẫn pha đảo
CBD 10 M25-0,25 (ID = 0,22 mm/ L=25 m/ slight- polarity/ film thickness^
0,25 |im). Chạy cột chế độ đẳng nhiệt ở 210°c, injector:240°c, khí
mang:nitrogen. Kết quả được tính toán trên máy CR- 7A Chromatopac
Shimadzu, kết hợp với hệ chất chuẩn.
Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Hoá- Sinh, Viện Hoá học- Trung
tâm KHTN và CNQG.
2.11. Thử tác dụng chống oxy hoá invitro của flavonoid toàn phần trong lá
Mắc rạc:
* Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan và não chuột theo phương
pháp của Jadwiga Robax (Ba Lan, 1987) và Mitsno Tanaka (Nhật Bản, 1994).
Nguyên tắc của phương pháp : Thực hiện phản ứng peroxyd hoá lipid
(POL) trên dịch đồng thể gan (não) chuột với nồng độ chất thử tăng dần (song
song làm mẫu trắng để đối chứng). Phản ứng tạo ra sản phẩm Malonyl
dialdehyd (MDA) có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric tạo ra hợp
chất Trimethine màu hồng. Đo cường độ màu của dung dịch ở bước sóng X =
532 nm để xác định lượng MDA tạo thành. HTCO được tính bằng phần trăm
(%) MDA bị ức chế tạo ra ở mẫu thử so với mẫu đối chứng (coi HTCO của
mâũ chứng bằng không).
9
Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Đông y thực nghiệm - Viện Y
học cổ truyền VN.
* Xác định hoạt tính dọn gốc tự do anion Superoxide 0 2' theo phương pháp
của Imanari và cộng sự [17].
Nguyên tắc của phương pháp : Tiến hành phản ứng tạo ra anion
Superoxide 0 2 trong hệ Xanthin/Xanthin oxydase với nồng độ chất thử tăng
dần (song song làm mẫu trắng để đối chứng). Các gốc anion Superoxide 0 2
có khả năng phản ứng với Nitro Blue Tétrazolium (NBT) tạo ra dung dịch có
màu xanh tím. Đo quang ở bước sóng X = 570 nm. Hoạt tính dọn gốc tự do
(tính theo phần trăm) được xác định bằng cách so sánh mật độ quang của
dung dịch mẫu thử với dung dịch mẫu chứng (coi hoạt tính dọn gốc tự do của
mẫu chứng bằng không).
Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Đông y thực nghiệm - Viện Y
học cổ truyền VN.
2.12.Thử tác dụng bảo vệ gan của Flavonoid toàn phần trong lá Mắc rạc.
Nguyên tắc của phương pháp: tiến hành thí nghiệm trên 3 lô chuột:
-
Lô
1: lô chứng sinh lý (để đối chứng)
-
Lô
2: lô chứng bệnh lý (để so sánh)
-
Lô 3: lô thử thuốc (được uống flavonoid)
Gây viêm gan cấp trên lô 2 và lô 3 bằng CC14. Sau khi cho lô 3 uống
thuốc thử trong 7 ngày, tiến hành định lượng GPT và Bilirubin trong máu của
3 lô chuột. So sánh mức độ tăng GPT và Bilirubin trong máu của lô 2, lô 3 với
lô đối chúng (lô 1), từ đó đánh giá tác dụng giảm độ tăng men GPT và
Bilirubin của flavonoid trên lô thử thuốc.
Thí nghiệm được tiến hành tại Khoa Dược lý Sinh hoá- Viện Dược liệu.
10
PHẦN 3 : THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
1. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
1.1. Nghiên cứu về Aavonoid trong lá Mắc rạc
1 .1 .1 .Chiết xuấtýlavonoid trong lá
Cho bột lá vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Loại clorophin
bằng cloroíorm cho tới khi dịch chiết trong suốt. Túi bã dược liệu được lấy ra
và để bay hơi hết dung môi cloroíorm. Sau đó chiết bằng methanol trong bình
Soxhlet cho tới khi dịch chiết trong suốt, không cho phản ứng với NaOH 0,1N.
Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cho tới cắn.
Hoà tan hoàn toàn cắn trong một lượng tối thiểu ethanol tuyệt đối. Rót từ từ
dung dịch đó vào aceton (lượng aceton có thể tích gấp 5 lần thể tích dung dịch
ethanol), đồng thời khuấy nhẹ. Saponin tủa, lọc tủa saponin toàn phần. Dịch
lọc đem cô tơí cắn. Hoà tan cắn vào nước nóng, lọc loại tạp. Dịch lọc được
cho vào bình gạn 500 ml, chiết bằng ethylacetat nhiều lần cho tới khi lớp
nước không cho phản ứng Cyanidin. Dịch chiết ethylacetat được gộp lại, cất
thu hồi dung môi, ta thu được cắn íìavonoid toàn phần.
Quá trình chiết xuất có thể tóm tắt bằng sơ đồ 1.
11
Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết xuất ílavonoid và saponin trong lá.
12
cắn Aavonoid được kiểm tra bằng phản ứng hoá học và định tính bằng SKLM.
1 .1 .2.Định tính cắn flavonoid toàn phần bằng phản ứng hoá học
Lấy một ít cắn ílavonoid hoà trong cồn 90° thành dung dịch thử, làm các
phản ứng sau:
• Phản ứng Cyanidin :
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử, thêm ít bột Mg, rồi nhỏ từ từ
HC1 đậm đặc. Dung dịch chuyển sang màu đỏ thẫm (phản ứng dương tính).
• Phản úng với kiềm :
- Nhỏ một giọt dung dịch thử lên giấy lọc, để khô rồi hơ trên lọ NH3 đặc,
thấy vết có màu vàng tăng lên rõ rệt (phản ứng dương tính).
- Cho 1 ml dung dịch thử vào ống nghiệm, thêm vài giọt NaOH 10%thấy
xuất hiện tủa màu vàng đậm (phản ứng dương tính).
• Phản ứng với FeCl3 5% :
Cho 1 ml dung dịch thử vào ống nghiệm, thêm vào vài giọt FeCl3 5% thấy
xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính).
• Phản ứng với A1C13 3% trong cồn :
Cho 1 ml dung dịch thử vào ống nghiệm, thêm vài giọt AICI3 3% thấy xuất
hiện tủa vàng ánh xanh (phản ứng dương tính).
• Phản ứng với chì acetat 30%
Cho 1 ml dung dịch thử vào ống nghiệm, thêm vào vài giọt dung dịch chì
acetat 30 % thấy xuất hiện tủa vàng đậm (phản ứng dương tính).
• Kiểm tra saponin trong cắn:
Lấy 5 ml nước cất cho vào 1 ống nghiệm to, thêm vài giọt dịch thử (cắn /
cồn 90°), lắc mạnh, không thấy xuất hiện cột bọt bền (phản ứng âm tính).
• Nhận xét: các phản ứng định tính Aavonoid trên đều dương tính chứng tỏ
cắn thu được từ quá trình chiết xuất (theo sơ đồ 1) đúng là ũavonoid và không
lẫn saponin.
13
1.1.3. Định tính flavonoid toàn phần bằng SKLM
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký : hoà một lượng nhỏ cắn flavonoid toàn phần
(chiết xuất theo sơ đồ 1) trong methanol làm dịch chấm sắc ký.
- Chuẩn bị bản mỏng sắc ký : dùng bản mỏng silicagel GF254 tráng sẩn của
hãng MERCK, hoạt hoá ở 1 10°c trong 30 phút.
• SKLM 1 chiều
- Các hệ dung môi khai triển:
+ Hệ I : Ethylacetat- acid formic- cloroform (2:1:2).
+ Hệ I I : Cloroform- methanol (8:2).
- Hiện màu bằng
+hơi amoniac
+thuốc thử A1C13 3% trong cồn tuyệt đối.
- Kết quả được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Kết quả SKLM flavonoid toàn phần với hệ I
Màu sắc
STT
Rf
1
0,06
2
0,21
3
0,34
4
0,40
5
0,61
6
0,70
AS
thường
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
u v 366
Đô lớn
và độ
A1C13/UV 366 đậm
của vết
nh3
AICI3
-
vàng
vàng
nâu
vàng sáng
++
-
vàng
vàng
vàng sáng
+++
-
vàng
vàng
nâu
vàng sáng
++
-
vàng
vàng
vàng sáng
+++
-
vàng
vàng
nâu
vàng sáng
++
vàng
sáng
vàng
vàng
vàng sáng
+++
14
Bảng 2: Kết quả SKLM flavonoid toàn phần vói hệ II
Màu sắc
STT
Rf
1
0,20
2
0,36
3
0,68
4
0,74
5
0,80
AS
thường
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
vàng
nâu
Đô lớn
và độ
A1C13/UV 366 đậm
của vết
nh3
AICI3
vàng
vàng
vàng sáng
++
vàng
vàng
vàng sáng
+++
-
vàng
vàng
vàng nâu
+++
-
vàng
vàng nâu
++
-
vàng
vàng nâu
+++
U V 366
vàng
sáng
vàng
sáng
vàng
nâu
vàng
nâu
*Nhận x é t: Hệ I cho kết quả SKLM tốt hơn: có 6 vết chất hiện màu với thuốc
thử AICI3 3% trong cồn.
• SKLM 2 chiều
- Các hệ dung môi khai triển :
+ Chiều 1 (hệ I): Ethylacetat- acid formic- cloroform (2:1:2).
+ Chiều 2 (hệ II): Cloroform- methanol (8:2).
- Hiện màu bằng thuốc thử AIƠ 3 3% trong cồn tuyệt đối.
- Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ (hình 3) và bảng 3.
15
•m at
Hình 3 : Sắc ký đồ SKLM 2 chiều ílavonoid toàn phần
Bảng 3: Kết quả SKLM 2 chiều Aavonoid toàn phần
Màu sắc
Độ lớn và
STT
AS thường
độ đậm
A1C13
A1C13/UV 366
-
vàng nâu
vàng nâu
++
-
vàng
vàng sáng
+++
-
vàng nâu
vàng nâu
++
-
vàng
vàng sáng
++
-
vàng
vàng sáng
++
u v 366
của vết
1
vàng nâu
2
vàng nâu
3
vàng nâu
4
vàng nâu
5
vàng nâu
6
vàng nâu
-
vàng nâu
vàng nâu
+++
7
vàng nâu
vàng sáng
vàng
vàng sáng
++
8
vàng nâu
-
vàng
vàng sáng
++
16
*Nhận x é t: Kết quả SKLM 2 chiều cho thấy: từ 6 vết flavonoid ban đầu (sau
khi triển khai sắc ký với hệ I) đã tách thành 8 vết hiện màu với thuốc thử
A1C13 3% trong cồn.
1 .1 .4.Định lượng flavonoid toàn phần trong lá
Cân chính xác khoảng 10,00 g bột lá (đã xác định độ ẩm) chiết xuất theo
sơ đồ 1. Cắn flavonoid toàn phần thu được đem sấy ở 70-80°C tới trọng lượng
không đổi, cân cắn và tính ra hàm lượng theo công thức sau:
a
Ftp = ________________
M . (100% - x%)
. 100
Trong đó :
Ftp: Hàm lượng flavonoid toàn phần (%),
a : Khối lượng cắn khô flavonoid (g).
M : Khối lượng dược liệu đem định lượng (g).
x%: Độ ẩm của dược liệu.
Kết quả định lượng íìavonoid được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Kết quả định lượng Aavonoid toàn phần trong lá Mắc rạc
Mẫu
Khối lượng
dược liệu (g)
Độ ẩm (%)
Khối lượng cắn
Hàm lượng
flavonoid (g)
flavonoid (%)
1
10,0027
10,37
0,1384
1,54
2
10,1296
10,37
0,1544
1,70
3
10,1880
10,37
0,1616
1,77
4
10,0832
10,37
0,1573
1,74
5
10,1254
10,37
0,1519
1,67
6
10,0327
10,37
0,1404
1,56
Trung bình
1,66± 0,10
Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong lá được tính theo phương
pháp thống kê với mức ý nghĩa a=0,05 cho hàm lượng flavonoid toàn phần
trong lá là 1,66 ± 0,10 %.
1.1.5. Phân lập flavonoid.
* Tách 1 phân đoạn từ flavonoid toàn phần.
Hoà tan khoảng 1 g cắn flavonoid toàn phần trong một lượng tối thiểu
ethylacetat thu được dung dịch màu nâu vàng đậm đặc. Thêm từ từ vào dung
dịch đó một lượng ether dầu hoả gấp 2 lần thể tích dung dịch ban đầu thấy
trong dung dịch xuất hiện tủa đục. Để lắng khoảng 8 giờ, tủa sẽ keo lại và có
màu nâu ở đáy cốc, dung dịch phía trên trong trở lại và có màu vàng tươi. Gạn
riêng dịch trong (Fl) và tủa (F2) đem kiểm tra bằng SKLM.
Kết quả trên sắc ký đồ (khai triển với hệ I) cho thấy Flvà F2 là 2 phân
đoạn riêng biệt. Theo dự đoán, F1 chứa các aglycon (ít phân cực) nên vẫn tan
tốt khi độ phân cực của dung môi giảm (do cho thêm ether dầu hoả). Trên sắc
ký đồ, phân đoạn F1 tách thành các vết tròn, gọn hơn so với phân đoạn F2. Do
đó, phân đoạn F1 được chọn để tiếp tục phân lập flavonoid.
* Phân lập flavonoid từ phân đoạn F1 bằng sắc ký cột.
- Chuẩn bị cột sắc ký:
+ Silicagen cột cỡ hạt 15- 40 |im được hoạt hoá ở 110°c trong 1 giờ.
+ Cột sắc ký có kích thước (1,5 X 40 cm) được lắp thẳng đứng trên gía. Lót
đáy cột bằng một lớp bông mỏng. Cân khoảng 15g silicagen đã hoạt hoá, nhồi
cột với dung môi CHC13.
+ Phân đoạn F1 đem bay hơi bớt dung môi thành một dung dịch đậm đặc.
Thêm vào một lượng nhỏ silicagen, trộn đều và để dung môi bay hơi tự nhiên
thành một khối bột khô tơi.
Sau thời gian ổn định cột, đưa khối bột vào cột và bắt đầu rửa giải.
- Rửa giải:
18
+ cho dung môi chảy qua cột với tốc độ 15 giọt/phút, hứng vào các ống
nghiệm nhỏ mỗi ống khoảng 5 ml.
+ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần:
CHCI3 - Methanol
(10:0)
30 ml
CHCI3 - Methanol
(9,8:0,2)
20 ml
CHCI3 —Methanol
(9,6:0,4)
30 ml
cuối cùng rửa cột bằng methanol.
+ Các ống từ số 17 đến số 20 (tương ứng với dung môi rửa giải có tỉ lệ
CHCl3:MeOH - 9,6:0,4) khi chấm kiểm tra trên SKLM (hệ II) cho 2 vết, trong
đó có 1 vết có màu vàng sáng đậm. Ngay sau khi hứng 5-10 phút, tại các ống
này xuất hiện từng chùm tinh thể hình kim, màu vàng. Gạn bỏ dịch mẹ, gộp
các tinh thể lại rồi kết tinh lại trong cồn thu được một chất, ký hiệu là Fq (hình
4). Chấm kiểm tra Fq và dịch mẹ trên SKLM (hệ II), kết quả: Fq cho 1 vết duy
nhất màu vàng, dịch mẹ cho 2 vết nhưng trong đó vết tương đương Fq rất mờ
nhạt.
Hình 4 : Tinh thể Fq
l.l.ó.N hận dạng Fq
* Kiểm tra độ tinh khiết của Fq bằng SKLM
Hoà tan một ít tinh thể chất Fq trong cồn chấm lên bản mỏng Silicagen
GF254 (MERCK) đã tráng sẩn, rồi khai triển trên 3 hệ dung môi khác nhau:
+ Hệ I : Ethylacetat- acid formic- cloroform (2:1:2).
+ Hệ I I : Cloroform- methanol (8:2).
19
+ Hệ I I I : Ethylacetat- acid formic-nước (8 : 1: 1).
Kết quả cho thấy ở 3 hệ dung môi trên dịch chấm Fq luôn chỉ lên 1 vết
màu vàng.
*Chúng tôi dự kiến Fq có thể là Quercetin, do đó đã tiến hành SKLM chất Fq
đối chiếu với Quercetin chuẩn trên 3 hệ dung môi khác nhau (hệ I, hệ II, hệ
III).
Trên cùng một bản sắc ký (4 X 10 cm), chấm song song 3 vết
- vết 1: Fq.
- vết 2: Quercetin chuẩn.
- vết 3: Fq và Quercetin chuẩn (chấm chồng 2 vết lên nhau).
Kết quả sắc ký: với cả 3 hệ dung môi khác nhau, mỗi vết chấm đều chỉ
lên một vết duy nhất và 3 vết này luôn có Rf tương đương nhau trên sắc ký đồ.
Để có thể kết luận chắc chắn, chúng tôi tiến hành đo phổ (UV, IR, MS)
của chất Fq đối chiếu với phổ của Quercetin chuẩn.
* Kết quả đo phổ
- Phổ tử ngoại (UV) đo trong methanol (Phụ lục 1).
+ Fq có các đỉnh hấp thụ cực đại ở các bước sóng Ằ,max = 368 nm, 254 nm, 205
+ Quercetin chuẩn có các đỉnh hấp thụ cực đại ở các bước sóng Ằ,max= 370 nm,
255 nm, 205 nm.
- Phổ hồng ngoại (IR) đo dưới dạng viên nén KBr cho thấy chất Fq có các
đỉnh hấp thu mạnh đặc trưng trùng hợp với phổ IR của Quercetin chuẩn (Phụ
lục 2, Phụ lục 3)
+ 3406 cm '1 (v O H ): dao động của nhóm OH.
+1664 em' 1 (v c = 0 ) : dao động của nhóm carbonyl liên hợp không tạo cầu
hydro.
+1609 cm' 1 (v c = 0 ) : dao động của nhóm carbonyl liên hợp tạo cầu hydro.
20
