phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy toluene

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHỊU NHIỆT
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TOLUENE

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS. TS.NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
VÕ NGỌC THẢO NGUYÊN
MSSV:3082615
LỚP:CNSHTT K34

Cần Thơ, Tháng 05/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Võ Ngọc Thảo Nguyên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
Qua quá trình thực hiện luận văn, em đã học hỏi được rất nhiều. Lần đầu tiên, em
được trải nghiệm quá trình nghiên cứu khoa học thật sự và đầy thú vị. Cũng nhờ quá
trình này, em càng hiểu và quý trọng những tình cảm, sự giúp đỡ của mọi người. Em
xin gởi lời cám ơn chân thành đến mọi người.
Đầu tiên, em xin chân thành cám ơn toàn thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu
và Phát triển Công Nghệ Sinh Học đã mang đến cho em chân trời tri thức, giúp đỡ em
hết mình trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình.
Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Hiệp, người vừa là cố vấn học
tập, đã quan tâm, giúp đỡ em trong suốt 05 năm đại học, vừa là thầy hướng dẫn tận
tụy. Nhờ sự giúp đỡ tận tình của thầy mà em có thể hoàn thành luận văn này.
Ngoài ra, em cũng xin chân thành cám ơn anh, chị và các bạn thuộc phòng thí
nghiệm Vi Sinh Vật, phòng Sinh học Phân tử thực vật đã hỗ trợ em hết mình trong quá
trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, em xin gởi lời tri ân đến gia đình. Nơi về hạnh phúc và an lành cho
em.

Võ Ngọc Thảo Nguyên

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƢỢC
Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp cuộc sống con người ngày càng tốt
hơn. Tuy nhiên, công nghiệp hóa không đi liền với bảo vệ mội trường dẫn tới những
ảnh hưởng tiêu cực lên Trái Đất cũng như sức khỏe con người. Nhiễm độc Toluene,
một loại dung môi hữu cơ được sử dụng phổ biến ở ngành công nghiệp sơn và thuộc
da, là vấn đề đang được các nhà nghiên cứu khoa học quan tâm. Mục tiêu của đề tài
là phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy
Toluene. Mẫu đất thu được tại 04 nguồn: mẫu dất gần Nhà máy thuộc da Tây Đô, Xí
nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa có nguy cơ nhiễm độc Toluene cao ở
địa bàn thành phố Cần Thơ được tăng sinh khối vi khuẩn bằng cách ủ với Toluene ở
nồng độ 1% và 10% ở 45oC ở cả hai pha khí và pha lỏng và sử dụng môi trường MSB
(mineral salt basal) để phân lập. Các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển với
Toluene là nguồn carbon duy nhất và khả năng tạo enzyme protease, cellulase,
amylase và lipase được giải trình tự và chứng minh khả năng phân hủy bằng phương
pháp đếm mật số phát triển với Toluene là nguồn carbon duy nhất ở các nồng độ 0%,
1%, 1,5%, 2%. Từ 04 nguồn đất đã phân lập được 09 dòng vi khuẩn. Hầu hết các
dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp các enzyme. Ba dòng được tuyển chọn chính
là T14, T38 và T50. Kết quả giải trình tự và so sánh bằng BLAST cho biết các dòng vi
khuẩn này có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis (T14),
Bacillus subtilis (T38) và Acinetobacter sp. (T50). Dòng T38 (Bacillus subtlis) được
chọn để kiểm tra khả năng sử dụng Toluene như nguồn carbon duy nhất và đã chứng
minh có thể phát triển ở nổng độ Toluene 1% và 1,5%.
Từ khóa: Dung môi hữu cơ, nhiễm độc Toluene, phân lập, sự phân hủy, vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ....................................................................................................... ii
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... iii
TÓM LƢỢC ................................................................................................................... i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... vii
CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................................ viii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU...........................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................2
2.1. Sơ lƣợc về dung môi hữu cơ ..................................................................................3
2.1.1. Định nghĩa.......................................................................................................... 3
2.1.2. Phân loại ............................................................................................................ 3
2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ................................................................................5
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng sự phân hủy dung môi hữu cơ ........................................7
2.3.1. Biện pháp xử lý sinh học là gì? ......................................................................... 7
2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng sự phân hủy sinh học của dung môi hữu cơ .................. 8
2.4. Cơ chế phân hủy dung môi hữu cơ .....................................................................10
2.4.1. Phân hủy hiếu khí ............................................................................................ 10

2.4.2. Phân hủy kỵ khí ............................................................................................... 11

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

2.5. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................12
2.5.1. Ngoài nước....................................................................................................... 12
2.5.2. Trong nước....................................................................................................... 13
CHƢƠNG 3. .................................................................................................................14
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................14
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu .......................................................................................14
3.1.1. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 14
3.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 15
3.1.3. Vật liệu ............................................................................................................. 16
3.1.4. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................ 16
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .....................................................................................16
3.2.1. Chuẩn bị thí nghiệm......................................................................................... 16
3.2.2. Phân lập vi khuẩn............................................................................................. 17
3.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ......................................... 17
3.2.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene ...................... 19
3.2.5. Khảo sát khả năng tạo một số enzyme ............................................................ 19
3.2.6. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ....................................... 20

3.2.7. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy dung môi hữu cơ ....................... 20
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................23
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...................................................................................23
4.2. Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc................................23
4.3. Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy
Toluene .........................................................................................................................26

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

4.4. Kết quả khảo sát khả năng tạo một số enzyme của các dòng vi khuẩn đã đƣợc
phân lập ........................................................................................................................27
4.4.1.Khảo sát khả năng tạo enzyme protease …………………………………...27
4.4.2. Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase ……………………………………..28
4.4.3. Khảo sát khả năng tạo enzyme amylase…………………………………...29
4.4.4. Khảo sát khả năng tạo enzyme cellulase…………………………………..30
4.5. Kết quả giải trình tự .............................................................................................32
4.6. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy Toluene ......................................35
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................36
5.1. Kết luận .................................................................................................................36
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................37

PHỤ LỤC .........................................................................................................................
Phụ lục 1: Kết quả
1. Kết quả trả cứu BLAST của dòng T14 ......................................................................
2. Kết quả tra cứu BLAST của dòng T38 ......................................................................
3. Kết quả tra cứu BLAST của dòng T50 ......................................................................
Phụ lục 2: Kết quả ...........................................................................................................
1. Bảng 13: Kết quả thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy
Toluene (OD 600nm) .....................................................................................................
2. Bảng 14: Kết quả thí nghiệm khả nẳng tạo enzyme của các dòng vi khuẩn .............

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Phụ lục 3: Kết quả thống kê ...........................................................................................
1. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme protease.......................................................
2. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme lipase..........................................................
3. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme cellulase ......................................................
4. Kết quả thống kê khả năng tạo enzyme amylase .......................................................

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thường gặp………………………………..…3
Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm năng áp dụng biện pháp xử lý sinh học...............8
Bảng 3: Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy............................................9
Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng trong thí nhiệm ......................................................21
Bảng 5: Nguồn gốc các dòng vi khẩn đã phân lập........................................................23
Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập.................................24
Bảng 7: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn đã phân lập.......................................24
Bảng 8: Khả năng tạo enzyme protease của các dòng vi khuẩn phân lập được............28
Bảng 9: Khả năng tạo enzyme lipase của các dòng vi khuẩn phân lập được................29
Bảng 10: Khả năng tạo enzyme amylase của các dòng vi khuẩn phân lập được..........29
Bảng 11: Khả năng tạo enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn phân lập được.........30
Bảng 13: Mật số vi khuẩn của dòng T38......................................................................35

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Nguyên tắc chính của quá trình phân hủy hiếu khí hydrocarbon gắn với
quá trình tăng trưởng...........................................................................................10
Hình 2: Nguyên tắc pha loãng.……………………………………………..…..22
Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn sau 2 ngày……………..……25
Hình 4: Kết quả nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn.............................................26
Hình 5: Chỉ số đo OD của các dòng vi khuẩn ở ngày 0, ngày 02 và ngày
04..................................................................................................................27
Hình 6: Vòng sáng được tạo ra trong môi trường CMC và tinh bột của một số dòng vi
khuẩn.............................................................................................................................31

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

CHỮ VIẾT TẮT
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
CDC: Centers for Disease Control and Prevention

CMC: Carbonxy methyl cellulose
LB: Luria Bertani
MSB: Mineral Salt Basal
NIOSH: The National Institue for Occupational Saftey and Health
OD: Optical density
TOL: Toluene
VOCs: Volatile Organic Coumpounds

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

viii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Nền công nghiệp ngày càng phát triển giúp tăng năng suất và hiệu quả lao động.
Nhờ đó, đời sống con người cũng được cải thiện về mặt vật chất. Tuy nhiên, mặt trái
của nền sản xuất công nghiệp là không thể phủ nhận khi mức độ ô nhiễm ngày càng
tăng. Ô nhiễm do chất thải công nghiệp, cụ thể là dung môi hữu cơ, không những ảnh
hưởng đến hệ sinh thái mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người (Lau,
2001). Mặc dù dung môi hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong các ngành sản xuất từ
chất nhuộm, plastic, mực in, vải cho tới sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm nhưng
nếu không được xử lý đúng cách thì lượng lớn dung môi hữu cơ tích tụ lâu ngày sẽ gây
độc nghiêm trọng cho môi trường và con người.

Các phương pháp xử lý truyền thống đối với những vùng bị nhiễm độc dung môi
hữu cơ hay hydrocarbon bao gồm tách lớp đất đã bị ô nhiễm, cách ly vùng bị ô nhiễm
(Vidali, 2001). Tuy nhiên, những phương pháp này không hiệu quả vì không giải
quyết được triệt để nguồn ô nhiễm. Ngoài ra, phương pháp đốt hoặc dùng hóa chất
cũng được sử dụng nhưng lại có nhiều nhược điểm và đòi hỏi kinh phí cao. Trong tình
hình đó, phương pháp xử lý sinh học xuất hiện như một giải pháp tích cực giúp xử lý ô
nhiễm hydrocarbon với những ưu điểm như giá thành thấp, không đòi hỏi kỹ thuật cao
và tận dụng được quá trình phân hủy tự nhiên của vi sinh vật. Cũng chính vì lẽ đó mà
các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu để có thể tìm ra những loài vi
khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ với hiệu suất cao nhằm nâng cao hiệu
quả của biện pháp xử lý sinh học.
Việt Nam với những quần thể vi sinh vật phong phú sẽ là địa điểm đầy tiềm năng
để có thể phân lập được những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene với hiệu
quả cao. Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy
Toluene” được đề xuất.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy
Toluene.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về dung môi hữu cơ
2.1.1. Định nghĩa
Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh (Centers for Disease Control and
Prevention-CDC) của Mỹ định nghĩa dung môi là những chất có khả năng hòa tan
hoặc phân tán một hoặc nhiều chất khác. Dung môi hữu cơ là những dung môi có
nguồn gốc carbon (chúng có chứa nguyên tử carbon trong cấu trúc phân tử). Trong
sách “Hướng dẫn về an toàn sử dụng dung môi hữu cơ” của bộ lao động Newzeland,
dung môi được định nghĩa là bất kỳ dung dịch nào có khả năng hòa tan một chất
(Tyson et al., 1992). Cụm từ “Dung môi hữu cơ” được dùng để chỉ một nhóm lớn
những hóa chất có nguồn gốc từ những sản phẩm dầu mỏ (petroleum). Như vậy, ta có
thể định nghĩa dung môi hữu cơ là những dung dịch có khả năng hòa tan các chất
khác và có chứa carbon có nguồn gốc từ petroleum.
2.1.2. Phân loại
Dung môi hữu cơ được phân loại dựa trên cấu trúc hóa học của chúng gồm có
các nhóm chính: nhóm có chứa clo, hợp chất aliphatic, hợp chất thơm, rượu, glycol,
ether, este, keton, aldehyde và những loại khác. Bảng 1 cho thấy một số nhóm chính
của dung môi hữu cơ.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Bảng 1: Một số nhóm dung môi hữu cơ thƣờng gặp
Nhóm

Tên dung môi hữu cơ

Hợp chất có chứa clo

Trichloroethane
Trichloroethylene
Methylene chloride
Chloroform
Carbon tetrachloride

Hợp chất aliphatic

Hợp chất vòng thơm

Rượu/Glycol/ Ether

Ester/ketones/Aldehyd
es

Các loại khác

Tetrachlorethylene
n-hexane
n-heptane
Pentane
Cyclohexene
Cyclohexane
Petroleum ether
Benzene
Toluene
Xylene
Naphthalenes
Methanol
Ethanol
Propanol
Butanol
Ethylene glycol
Diethyl ether
Ethyl acetate
Acetone
Methyl ethyl ketone
Methyl isobutyl ketone
Methyl n-butyl ketone
Formaldehyde
Glutaraldehyde

Carbon disulphide
Pyridine
amide
amine

(*Nguồn: ngày 10/01/2013)

Dung môi sử dụng trong công nghiệp thường là hỗn hợp của nhiều chất khác
nhau. Ví dụ như dung môi “methylated spirit” là sự pha trộn giữa methanol và ethanol.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Có thể có tới 20 hợp chất trong một số dung môi hữu cơ. Ví dụ: White Spirit,
Turpentine and Kerosene (Tyson et al., 1992).
2.2 Độc tính của dung môi hữu cơ
Theo thống kê của trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), ở
Mỹ, 9,8 triệu công nhân phơi nhiễm với dung môi hữu cơ có trong các sản phẩm như
sơn, véc-ni, chất kết dính, keo dán, chất tẩy nhờn và trong ngành sản xuất thuốc
nhuộm, polymer, plastic, vải, mực in, sản phẩm nông nghiệp và dược phẩm. Điều đáng
lo ngại là rất nhiều những dung môi hữu cơ được cảnh báo bởi NIOSH (Viện quốc gia
về an toàn lao động và sức khỏe) như chất gây ung thư (benzene, carbon tetrachloride,

trichloethylene), chất độc sinh sản (2-ethoxyethanol, 2-methoxyethanol, methyl
chloride) và chất độc thần kinh (n-hexane, tetrachloroethylene, toluene). Những
nghiên cứu gần đây cho thấy có sự liên quan giữa sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ
(trichloroethylene, perchloroethylene, carbon tettrachlorine) và bệnh Parkinson
(Goldman et al., 2012).
Những dung môi hữu cơ thường gặp ở nước ta bao gồm VOCs (Volatile Organic
Compounds), Benzene và Toluene.
Nhiễm độc các chất VOCs: VOCs là tên gọi chung các chất lỏng hay chất rắn có chứa
carbon hữu cơ rất dễ bay hơi. Một số chất thông dụng như acetone, ethylacetate,
buthylacetate .v.v. Nguồn ô nhiễm VOCs phát sinh do đốt không triệt để xăng dầu, các
dung môi hữu cơ tự bay hơi, bay hơi của xăng dầu, bay hơi của các hoá chất rơi vãi.
Cây xanh khi trao đổi khí ban đêm cũng thải VOCs. Nhìn chung, xăng và sơn là hai
thứ thải ra VOCs nhiều nhất. Chúng ít gây độc mãn tính mà chủ yếu gây độc cấp tính
như chóng mặt, say nôn, sưng mắt, co giật, ngạt viêm phổi. Chỉ một số ít chất có khả
năng gây độc mãn tính thì lại tạo ra ung thư máu, bệnh thần kinh (Bạch Thái Toàn,
2008)
Nhiễm độc Benzen: Benzen là một chất lỏng dễ bay hơi khi hỗn hợp với không
khí có thể gây nổ. Benzen xâm nhập vào cơ thể qua da (tiếp xúc trực tiếp) và qua phổi.
Khi xâm nhập, khoảng 75% - 90% được cơ thể thải ra trong vòng nửa giờ. Phần còn
lại tích lũy trong mỡ và tuỷ xương, não sau đó được bài tiết chậm ra ngoài. Phần

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

benzen tích lũy này có thể gây các biểu hiện bệnh lý: Gây ra sự tăng tạm thời của bạch
cầu; gây ra sự rối loạn oxy hoá - khử của tế bào dẫn đến tình trạng xuất huyết bên
trong cơ thể; nếu hấp thu nhiều benzen cơ thể sẽ bị nhiễm độc với các hội chứng khó
chịu, đau đầu, chóng mặt, nôn, có thể dẫn đến tử vong vì suy hô hấp. Nếu thường
xuyên tiếp xúc với benzen có thể gây nhiễm độc mãn tính. Lúc đầu là rối loạn tiêu
hoá, ăn kém ngon, xung huyết niêm mạc miệng, rối loạn thần kinh, đau đầu, bị chuột
rút, cảm giác kiến bò, thiếu máu nhẹ, xuất huyết trong, phụ nữ hay bị rong kinh, khó
thở do thiếu máu. Tiếp theo là xuất huyết trong nặng, thiếu máu nặng, giảm bạch cầu.
Phụ nữ bị nhiễm độc nặng có thể bị đẻ non hoặc sẩy thai đây là bệnh nguy hiểm vì
benzen có thể tích luỹ lâu dài trong tuỷ xương. Bệnh có thể xuất hiện sau 2 năm kể từ
khi bị nhiễm benzene (Bạch Thái Toàn, 2008).
Benzen được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các chất hữu cơ, dùng
làm dung môi hoà tan mỡ, cao su, vecni, tẩy da, vải sợi, lau khô, tẩy dầu mỡ bám trên
các dụng cụ, vật liệu, phương tiện. Năm 1997, Chính phủ nước ta đã có quyết định
cấm dùng benzen làm dung môi pha chế sơn. Những ngành khác cần sử dụng benzen
thì phải được sự cho phép của cơ quan có thẩm quyền. Điều này cho thấy benzen cực
kỳ độc hại. Người sử dụng hãy cảnh giác với các sản phẩm sơn, nhất là sơn được sản
xuất bằng công nghệ lạc hậu. Chất thải từ các nhà máy thuộc da, dệt nhuộm cơ khí, các
xưởng sửa chữa tân trang xe, máy, đóng tàu cũng là những nguồn phát thải benzene
(Bạch Thái Toàn, 2008)
Nhiễm độc Toluen: Toluen là chất dễ bay hơi, cháy nổ. Chỉ cần một nồng độ nhỏ
1/1000, Toluen đã gây cảm giác mất thăng bằng, đau đầu, nếu nồng độ cao hơn có thể
gây ảo giác, choáng ngất. Toluen có trong sơn, nhựa, keo dán công nghiệp và là chất
xúc tác trong công nghệ in ảnh (Bạch Thái Toàn,2008)
Sự hấp thu dung môi hữu cơ thường qua tiếp xúc ngoài da hoặc qua đường hô
hấp. Nhân tố ảnh hưởng tới tốc độ và mức độ hấp thụ qua da bao gồm thời gian tiếp
xúc, nồng độ dung môi và tình trạng của da (độ ẩm của da, vết thương…) và tính tan
của các dung môi. Tốc độ thâm nhập qua da đã được chứng minh liên quan trực tiếp

đến tính tan của dung môi. Nói chung, hợp chất clo được hấp thu qua da nhiều hơn các
hợp chất không chứa clo. Hợp chất vòng thơm để xâm nhập qua da hơn hợp chất
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

aliphatic (Baker, 1988). Sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ có thể được miêu tả như phơi
nhiễm cấp tính (tiếp xúc trong thời gian ngắn nhưng nồng độ cao) hoặc phơi nhiễm
mãn tính (tiếp xúc liên tục trong thời gian dài). Sự phơi nhiễm này có thể gây độc tại
bộ phận cơ thể tiếp xúc với dung môi hữu cơ (tác động cục bộ) hoặc gây thay đổi chức
năng của những cơ quan khác (tác động hệ thống). Phản ứng có thể xảy ra ngay lập tức
(cấp tính) hoặc mãn tính.
Sự hấp thu qua phổi phụ thuộc vào nồng độ dung môi được hít vào, tính tan của
các dung môi và tốc độ trao đổi khí của phổi. Một ví dụ cụ thể là nếu một người công
nhân phải làm việc với tần suất cao dẫn đến tăng tốc độ trao đổi khí của phổi sẽ hít vào
lượng dung môi hữu cơ dễ bay hơi nhiều hơn (Baker, 1988).
Trong môi trường, hợp chất thơm là một trong những chất ô nhiễm khó xử lý
nhất (Seo et al., 2009). Dung môi hữu cơ có tác động tiêu cực đến môi trường xung
quanh, ảnh hưởng đến hệ sinh thái, ức chế sự phát triển của thực vật và động vật. Thí
nghiệm cho thấy, động vật phơi nhiễm với dung môi hữu cơ như n-hexane bị ảnh
hưởng đến màng tế bào, sự cân bằng của trao đổi tín hiệu thần kinh và ảnh hưởng tới
hô hấp tế bào cũng như sinh tổng hợp protein (Baker, 1988).
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng sự phân hủy dung môi hữu cơ

2.3.1. Biện pháp xử lý sinh học là gì?
Biện pháp xử lý sinh học (bioremediation) được định nghĩa là quá trình mà
những chất thải hữu cơ được phân hủy bằng con đường sinh học dưới điều kiện được
kiểm soát cho đến khi đạt được trạng thái vô hại hoặc đến mức độ được chấp nhận bởi
cơ quan quản lý (Vidali, 2001). Quần thể vi khuẩn sử dụng trong xử lý sinh học có thể
là quần thể có sẵn tại điểm ô nhiễm hoặc những quần thể được đưa vào từ nơi nguồn
khác.
Bởi vì biện pháp xử lý sinh học có những ưu điểm vượt trội so với các phương
pháp truyền thống khác như giá thành rẻ hơn, thân thiện với môi trường nên được sự
quan tâm của rất nhiều nhà khoa học. Năm 1975, Dick Raymond đã nhận bằng sáng
chế cho biện pháp xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm nhiễm gas. Phương
pháp này bao gồm sự kích thích sự phát triển vi khuẩn tại chỗ bằng cách bổ sung chất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

dinh dưỡng. Rõ ràng qua hơn 50 năm, xử lý sinh học tại chỗ đối với mạch nước ngầm
đã cho thấy những thành công và hiểu biết hơn về xử lý ô nhiễm, đặc biệt đối với ô
nhiễm dầu mỏ (petroleum). Trong những năm gần đây, ứng dụng của biện pháp xử lý
sinh học được phát triển ở lĩnh vực xử lý dung môi, hydrocarbon thơm đa vòng, dioxin
và kim loại (Hazen, 2010). Thật vậy, biện pháp sinh học đã được áp dụng trên nhiều
địa điểm trên khắp thế giới bao gồm Châu Âu với mức độ thành công khác nhau

(Zeyaullah et al., 2009) nhưng cũng đã cho thấy tiềm lực của biện pháp xử lý này.
2.3.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự phân hủy sinh học của dung môi hữu cơ
Theo nghiên cứu của Atlas (1981), sự phân hủy của vi sinh vật đóng vai trò
chính trong quá trình phong hóa của hỗn hợp petroleum hydrocarbon. Sự phân hủy
petroleum trong hệ sinh thái tự nhiên rất phức tạp. Sự thay đổi của hợp chất
hydrocarbon dựa vào bản chất của các hydrocarbon, quần thể vi khuẩn và các nhân tố
môi trường ảnh hưởng đến hoạt động của vi sinh vật.
Những n-alkanes nhìn chung được đánh giá là hợp chất dễ phân hủy nhất trong
hỗn hợp dầu mỏ (Atlas, 1981). Qua bảng 2 ta có thể biết được những chất ô nhiễm phù
hợp với biện pháp xử lý sinh học. Trong đó, các dung môi hữu cơ trichloroethylene,
perchloroethylene, benzene, toluene, etthylbenzene cũng nằm trong số đó.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Bảng 2: Những chất ô nhiễm có tiềm năng áp dụng biện pháp xử lý sinh học

Nhóm

Ví dụ

Dung môi có có chứa clo

Trichloroethylene
Perchloroethylene

Hiếu khí

Kỵ khí

Nguồn

+

Chất tẩy rửa khô
Sản xuất hóa chất

4-Chlorobiphenyl
4,4Dichlorobiphenyl

+

Sản xuất điện
Trạm xăng dầu
Đường ray tàu lửa

Chlorinated phenol

Pentachlorophenol

+

Hợp chất thơm

Benzene
Toluene
Ethylbenzene
Xylene

+

Xử lý gỗ
Đất
Sản xuất và tồn trữ dầu
Sân bay
Sản xuất sơn
Sản xuất hóa chất…

Hợp chất thơm đa vòng

Naphthalene
Antracene
Fluorene
Pyrene
Benzo(a)pyrene
Atrazine
Carbaryl
Carbofuran
Coumphos
Diazinon
Glycophosphate
Parathion

Propham
2,4-D

+

Polychlorinated biphenyls

Thuốc trừ sâu

+

+

Sản xuất và tồn trữ dầu
Nhà máy nước ngọt
Đất
Trạm xăng dầu
+

Nông nghiệp
Nhà máy xử lý gỗ
Sản xuất thuốc trừ sâu
Đất

(*Nguồn: Vidali, 2001)
(Ghi chú: *: (+) nằm trong nhóm vi khuẩn)

Đối với quần thể vi sinh vật cho quá trình xử lý sinh học, ta có thể chia thành 4
nhóm bao gồm quần thể hiếu khí, kỵ khí, nấm ligninolytic và methylotrohps (Vidali,
2001).

Yếu tố môi trường cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân hủy của
hydrocarbon. Để đạt được điều kiện phân hủy tốt nhất, môi trường cần đảm bảo ở
trạng thái đầy đủ dinh dưỡng với độ ẩm, pH, nhiệt độ thích hợp. Bảng 3 cho ta thấy
những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự phân hủy của hydrocarbon.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Bảng 3: Điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự phân hủy
Giá trị tối ƣu cho sự phân hủy
dầu
30-90%
6,5-8,0
10-40%

Dinh dưỡng
Nhiệt độ (oC)

Điều kiện cần cho hoạt động của vi
sinh vật
khả năng giữ nước 25-28%
5,5-8,8

Hiếu khí, tối thiểu diện tích các lỗ khí
đạt 10%
N và p cho sự phát triển của vi sinh vật
15-45

Chất ô nhiễm

Không quá độc hại

Hydrocarbon chiếm 5-10%
trọng lượng khô của đất
700 ppm

Chỉ số
Độ ẩm đất
pH của đất
Oxy

Kim loại nặng

Tổng cộng 2000 ppm

C:N:P= 100:10:1
20-30

(*Nguồn: Vidali, 2001)

2.4. Cơ chế phân hủy dung môi hữu cơ
Bởi vì bản chất của các dung môi hữu cơ chính là những hợp chất hữu cơ nên ta
có thể dựa vào cơ chế chung của phân hủy hợp chất hữu cơ (hydrocarbon) để biết được

quá trình phân hủy của dung môi hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có thể được phân hủy
bằng con đường hiếu khí hoặc kỵ khí.
2.4.1. Phân hủy hiếu khí
Sự phân hủy hydrocarbon chủ yếu xảy ra bằng con đường hiếu khí (Fristcher,
2000). Dưới sự có mặt của oxy, liên kết C-H được hoạt hóa bởi oxygenase bao gồm sự
có mặt của vi sinh vật sử dụng oxy trong phản ứng tỏa nhiệt (Boll, 2010). Vi khuẩn và
nấm là những sinh vật có khả năng tham gia biến đổi các chất hydrocarbon. Để bắt đầu
chuỗi phản ứng, vi sinh vật cần oxy như một đồng cơ chất. Đối với alkane, enzyme
đầu tiên là monooxygenase trong khi hydrocarbon thơm có thể bị tấn công bởi cả
monooxygenase hoặc dioxygenase. Những enzyme này giúp gắn nhóm hydroxyl có
nguốn gốc từ phân tử oxy vào chuỗi aliphatic hoặc vòng thơm. Sau đó, rượu tạo thành
từ hợp chất aliphatic sẽ được oxy hóa thành acid tương ứng; hợp chất phenolic tạo ra
từ hydrocarbon vòng thơm sẽ là tiền chất cho phản ứng cắt vòng nối tiếp (Heider,
1999). Rất nhiều enzyme oxygenase của hợp chất vòng thơm có thể xúc tác ở phổ rộng
từ aliphatic cho tới hợp chất chloroaliphatic (Leahy, 2003). Cơ chế chính của quá trình
phân hủy hiếu khí được mô tả khá chi tiết bởi Fristcher (2000) (Hình 1).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

Hình 1: Nguyên tắc chính của quá trình phân hủy hiếu khí
hydrocarbon gắn với quá trình tăng trƣởng (Nguồn: Fristcher, 2000)

2.4.2. Phân hủy kỵ khí
Mặc dù, phân hủy hiếu khí được xem như là con đường chủ yếu trong phân hủy
hydrocarbon. Khả năng phân hủy hydrocarbon theo con đường kỵ khí của vi khuẩn
cũng là một mảng nghiên cứu đầy hứa hẹn vì ngày càng nhiều hợp chất hydrocarbon
được chứng minh là có thể được phân hủy bởi những vi sinh vật hiếu khí (Heider,
1999). Thay vì, sử dụng enzyme oxygenases như trong quá trình phân hủy hiếu khí,
các vi khuẩn phân hủy hiếu khí sử dụng một số phản ứng enzyme khác để thay thế.
Quy trình hoạt hóa liên kết C-H bao gồm: thủy phân với nước bằng enzyme có chứa
cofactor là molybdenum, thêm fumarate bằng enzyme có tâm là glycyl, sử dụng
methyl-coenzyme M reductase để đảo ngược quá trình methanogenesis, methyl hóa,
carboxyl hóa (Boll, 2010). Con đường sinh hóa của quá trình phân hủy alkylbenzenes,
toluenes và ethylbenzene đã được làm rõ (Heider, 1999).
Quá trình phân hủy của Toluene bắt đầu bởi phản ứng cộng của toluene methyl
vào nối đôi của fumarate để tạo thành benzylsuccinate nhờ vào enzyme có tâm là
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

glycyl. Sau đó, quá trình tổng hợp của benzylsuccinate thành benzoyl-CoA và
succinyl-CoA được thực hiện nhờ vào sự oxy hóa.
2.5. Tình hình nghiên cứu
2.5.1. Ngoài nƣớc
Vào năm 1989, nhiều dòng của chủng vi khuẩn Pseudomonas putida đã được

phát hiện có khả năng phát triển ở trong môi trường nuôi cấy chứa hơn 50% (v/v)
toluene hoặc nồng độ cao của cyclohexane, xylene, styrene và heptanol (Inoue, 1989).
Với tiền đề đó, nghiên cứu sâu hơn mặt di truyền của Pseudomonas putida trong quá
trình phân hủy toluene cũng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy TOL plasmid đã
được chứng minh là có vai trò trong việc điều khiển sự phân hủy của m- and p-toluate,
m-and p-xylene (Burlage, 1989). Tiếp theo đó vào năm 1992, Aono et al. cũng đã công
bố về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cũng có khả năng kháng toluene. Ogino et al.
(1994) đã nêu lên khả năng tạo ra lipolytic enzyme của Pseudomonas aeruginosa.
Ngoài P. putida, P. aeruginosa, Bacillus pumilus cũng có khả năng phân hủy dung
môi hữu cơ (In-Young et al., 1998). Sarren and Mishant (2008) đã tinh sạch được
enzyme protease có khả năng kháng dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa từ dòng vi khuẩn
Bacillus licheniformis. Các nghiên cứu tiếp theo cũng chứng tỏ Pseudomonas chiếm
ưu thế trong quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ (Isken et al.,
1999). Gần đây, Marchant và Banat (2010) đã chứng minh khả năng phân hủy
hydrocarbon, cụ thể là alkane bởi nhóm Geobacillus. Kết quả cho thấy, tất cả các loài
Geobacillus đều có khả năng phân hủy alkane chỉ trừ G. thermoglucosidasius, G.
tepidamans, G. pallidus và G. lituanicus.
Trong những năm gần đây, hướng nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới
tập trung vào cơ chế phân hủy những hợp chất hydrocarbon độc hại. Cơ chế phân hủy
alkane đã được làm rõ qua các nghiên cứu của van Beilen et al. (2001).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

2.5.2. Trong nƣớc
Các nghiên cứu về phân hủy dung môi hữu cơ của nước ta hiện nay vẫn chưa
nhiều. Chỉ có một số nghiên cứu về khả năng kháng dung môi hữu cơ của vi khuẩn, ví
dụ như khả năng kháng benzene (Vũ Thành Công, 2010). Những đặc tính và hiệu quả
của quá trình phân hủy dung môi hữu cơ cần được nghiên cứu sâu hơn.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 3.
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dung cụ thí nghiệm
- Đĩa Petri
- Ống nghiệm
- Bình tam giác 100, 250, 500 ml
- Chai lọ thủy tinh
- Đầu col xanh, vàng, trắng
- Các loại ống tuýp 1,5ml; 2,5 ml

- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Bộ Micropipet Gibson P10, P200, P1000 (Đức)
- Eppendoft
- Đèn cồn
- Que cấy
- Một số dụng cụ khác như: lam kính, lamen, dao, kéo, kẹp…
Thiết bị thí nghiệm
- Tủ cấy vi sinh vật.
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111
- Cân điện tử Sartorius
- Kính hiển vi Olympus CHT
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international
- Máy lắc mẫu GFL 3005.
- Tủ lạnh 4oC để trữ vi sinh vật

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học