Nghiên cứu Alcaloid và một số tác dụng sinh học của cây hoàng liên ô rô mọc ở đèo Gió tỉnh Cao bằng

BỘ YTẼ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI
£0B0£Q e3G 8

PHẠM THỊ HỒNG NHUNG

NGHIỀN CỬU ALCALOID VÀ MỘT số TẤC DỤNG
SINH HỌC CỦA CẦY HOÀNG LIÊM 6 RÔ
MỌC ỏ t>ỀO GIÓ - TÌNH CAO BẰNG
( MAHONIA SP, J
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c sĩ KHOÁ 1997-2002

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

: TS. PHÙNG HOÀ BÌNH
PG S.TS.M AITẤTTỐ

NƠI THỰC HIỆN

: BỘ MÔN DƯỢC HỌC c ổ TRUYỀN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC

THỜI GIAN THƯC HIÊN

: 312002 - 512002

HÀ NỘI - 5 / 2002

Dược HÀ NỘI

M.9 QcM Ql
ầ /r O fH f q u ỏ
n h ón

tớ t o e 3JJ- q u c t t t u

s u (è ỡ

ừ

q u ớ

bỏu

t n

c a

Qlớtõit (ti/, l i M ớ

ờ tũ / t t H iò tle ft iới , t i t

tr ỡn h ih u e h iờ n

tỡn h

han

t ũ //

hố

c a
a

eỏe, th ờ

e ớ t , o ỏ i

n h t , U U f i

(h ỏ n .

t lốtup Uỳih tvottớ a luờớ t

sn t i eỏe t h y

ầJS. (J)IlĂjớớu '7f)ỳ (Bỡnh
M a i ầJõ't ầjờ
ih ớU v i u i tó tv ie t p

liờti d t

t ụ i th u a Ă lie n t i .

ầjối eiiiuj, ổtii trõn trSiớ, earn tt tỳ (ớ t l e A e eõ Im

mụn niùiựùe hỳe ớớ trun, Im ớiũti (T)ớt lý eỳe pitũU luin
hoti tiiỡũtớ eiini, toớới the han l), ớiới tlii tó tao (Tietớ

Izlởtt , ỡtớp (t, tũtớ an t i rỏ i nhiu tt'ỳớiớf li ớ gian qua .

'Tễ l ớiờỡy m yới 2 7 itiỏ tu 5 itớới 2 0 0 2

*Ktt / | tỡ!ớ)t!

( )Ii u m

l

ầ Jhi

Q U ớU ớtg ,


Mục lục
\7rnnif
Đặt vấn đề............................................................................................

1

Phần 1: Tổng quan.............................................................................

2

1 - Đặc điểm thực vật...........................................................................

2

2 - Phân bô.............................................................................................

2

3 - Thành phần hoá học........................................................................

4

4 - Định tính..........................................................................................

5

5 - Định lượng.......................................................................................

6

- Tác dụng và công dụng...................................................................

8

6

Phần 2: Thực nghiệm và kết quả.....................................................

11

1 - Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.......................................

11

2 - Kết quả thực nghiệm.......................................................................

17

2.1. Nghiên cứu về hoá học..................................................................

17

2.1.1. Định tính......................................................................................

17

2.1.2. Định lượng Berberin và Palmatin..............................................

20

2.2. Nghiên cứu về tác dụng sinh học................................................

23

2.2.1. Thử độc tính cấp.........................................................................

23

2.2.2. Thử tác dụng chống viêm cấptính...........................................

24

2.2.3. Thử tác dụng lợi mật..................................................................

26

2.2.4. Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan.................................................

28

3 - Bàn luận...........................................................................................

31

Phần 3: Kết luận và đề x u ấ t.............................................................

33

1 - Kết lu ận ...........................................................................................

33

2 - Đề x u ất............................................................................................

34


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CTHH :

Công thức hoá học

SKLM :

Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

:


ĐẶT VÂN ĐỂ
Hoàng liên ô rô là tên gọi của nhiều loài thuộc chi Mahonia, họ Hoàng
liên gai (Berberidaceae).
Các loài thuộc chi Mahonia được phát hiện ở nhiều vùng núi nước ta như
Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Lâm Đồng [6,11,14,16,17].
Theo kinh nghiệm dân gian, Hoàng liên ô rô được dùng để chữa các bệnh
đường tiêu hoá như kiết lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm gan, vàng da hoặc dùng
ngoài chữa viêm da, dị ứng, ngứa lở [6,14,16]
Trong số các loài thuộc chi Mahonia, loài M. aquifolium được nhiều nhà
khoa học trên thế giới quan tâm. Các kết quả nghiên cứu cho thấy loài này đặc
biệt có hiệu quả trong chữa trị các bệnh về da như vảy nến, eczema, da khô,
nấm ngoài da [18,20,21,22,23,25].
Theo tài liệu [5], nhiều loài thuộc chi Mahonia cho hàm lượng berberin
cao, là nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin.
Nguyễn Thu Hằng [8 ], khi nghiên cứu một loài Hoàng liên ô rô mọc ở
Đèo Gió - tỉnh Cao Bằng, thấy trong cây có chứa các hợp chất alcaloid,
saponin, đường khử, acid amin, sterol. Tác giả đã sơ bộ xác định các alcaloid
chính trong cây có cấu trúc khung protoberberin (berberin, palmatin...)
Để tiếp tục tìm hiểu sâu thêm về cây Hoàng liên ồ rô mọc ở Đèo Giótỉnh Cao Bằng, chúng tôi thực hiện đề tài này với các mục tiêu sau:
+ Xác định hàm lượng một số alcaloid chính trong cây: berberin,
palmatin.

+ Nghiên cứu một số tác dụng sinh học: độc tính cấp, tác dụng chống
viêm cấp tính, tác dụng lợi mật, tác dụng bảo vệ tế bào gan.

1


Phần 1:

TỔNG QUAN
Ở nước ta các loài thuộc chi Mahonia như M. japónica (Thunb) DC.;
M. bealei (Fort) Carr. ; M. nepalensis DC. có tên là Hoàng liên ô rô vì lá của
chúng giống lá cây Ô rô và công dụng lại gần giống vị Hoàng liên [14].
Nhân dân một số địa phương còn gọi là Hoàng bá gai, Thích hoàng liên,
Tồngphềnh (Hmông) [13].
1 - ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT:
Cây bụi hay cây gỗ nhỏ, cao 2- 6 m [6,11,14,15]. Thân cây có ruột màu
vàng. Cành không có gai. Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, có 2 gai nhỏ
phía cuống lá, gồm nhiều lá chét có răng cưa thưa và đầu nhọn sắc. Cụm hoa
tận cùng mọc thành bông, phân nhánh ở gốc, hoa màu vàng nhạt. Quả mọng,
hình cầu. Mùa hoa vào tháng 1-3, mùa quả vào tháng 4-5 [15].
2 - PHÂN BÔ
Cây mọc hoang ở vùng núi cao, lạnh, trên núi đá vôi, ở độ cao 1000m trở
lên [16].
M. aquifolium Push.; M. repens (Lindl) G. Don. có nhiều ở vùng tây bắc
Mỹ, Canada [21].
M. bealei (Fort) Carr.; M. nepalensis DC.; M. fortunei (Fort) Carr, có
nhiều ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam [5,6,14,16].
ở nước ta, năm 1967, cây Hoàng liên ô rô được phát hiện đầu tiên ở vùng
núi cao huyện Bát Xát (tỉnh Lào Cai). Sau đó, Hoàng liên ô rô còn được phát

2


hiện ở Hà Giang, Lai Châu, Cao nguyên Langbiang (Lâm Đồng), Cao Bằng
[8,14,16].
Viện dược liệu (Bộ Y tế) đã lấy và lưu mẫu 3 loài Mahonia
- M. bealei (Fort) Carr (N° 1541C) ngày 12/11/1969 ở Hà Giang, đỉnh
núi cao 1400m.
- M. japónica (Thunb) D c. (N° 2021A) ngày 26/10/1973 ở Sìn HồLai Châu.
- M. nepalensis D c (N° 2709) ngày 13/5/1980 ở Langbiang- Lạc
Dương-Lâm Đồng.
So sánh với các mẫu lưu tại Viện dược liệu, mẫu cây Hoàng liên ô rô
mọc ở Đèo Gió- tỉnh Cao Bằng (mẫu nghiên cứu) giống mẫu N° 202 1 AM.japonica [8 ].

Hình I: Mẫu nghiên cứu

Hình II: Mẫu N° 2021A

M. japónica (Thunb) D c.


3 - THÀNH PHẦN HOÁ HỌC:
Rễ, thân, lá Hoàng liên ô rô đều có chứa alcaloid, saponin, đường khử,
acid amin, sterol, lá có chứa tanin [8 ].
Hoàng liên ô rô chứa chủ yếu là các alcaloid có nhân Isoquinolin. Trong
đó, các alcaloid có khung protoberberin như berberin, palmatin, jatrorrhizin...
là thành phần chính [6,8,14,16]. Ngoài ra, còn có các alcaloid có khung
bisbenzyl isoquinolin như oxyacanthin, berbamin...[8,14,16].
CTHH

Isoquinolin

Protoberberin

4


Palmatin

Jatrorrhizin

OCH,

Berberin

4 - DINH TINH:
4.1. Dinh tinh bäng phän urng hoä hoc:
De dinh tinh cäc alcaloid trong Hoäng lien o rö, ngoäi cäc phän ting
chung cüa alcaloid ngiröi ta cön düng möt so phän ting däc hieu:
-

Phän ling däc hieu cho cäc alcaloid cö nhän protoberberin lä oxy ho

bang niroc Bröm hay Clo vöd sn cö mät cüa acid vö co manh (HCl, H2 S04).
Cho väo dung dich nirörc alcaloid protoberberin 1-2 giot niröc Brom hay Clo,

5


thêm vài giọt acid HC1 đặc (H2 S0 4 đặc), lớp tiếp xúc sẽ xuất hiện một vòng đỏ

bền vững [ 1 2 ].

Phản ứng kết tinh muối alcaloid bằng acid HC1 đặc và acid HNO

đặc [13].
+

1

giọt dịch chiết cồn, bốc hơi trên phiến kính, thêm

1

giọt acid

1

giọt acid

HC1 đặc, để yên 30 phút, soi kính thấy từng bó kết tinh màu vàng.
+

1

giọt dịch chiết cồn, bốc hơi trên phiến kính, thêm

HNO 3 đặc, để yên 30 phút, soi kính thấy tinh thể hình chấm vàng.
4.2. Phản ứng phát quang [13]
Bột dược liệu, dịch chiết cồn, tinh thể đều phát quang màu vàng dưới
ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 250- 350nm

4.3. Định tính bằng SKLM [13]
Các alcaloid trong Hoàng liên ô rô có thể định tính bằng SKLM có chất
chuẩn đối chứng (berberin, palmatin).
Một số hệ dung môi có khả năng tách tốt các alcaloid trong Hoàng liên ô
rô [8,12,13]:
n-Butanol: acid acetic: nước

[7:1:2]

n-Butanol: acid acetic: nước

[6:2:2]

n-Butanol: acid acetic: nước

[10:1:3]

5 - ĐỊNH LƯỢNG:
- Định lượng alcaloid toàn phần trong Hoàng liên ô rô theo phương pháp
cân, hàm lượng alcaloid toàn phần đã được xác định là 0,90% [8 ]
- Để định lượng riêng từng alcaloid trong cây có thể tham khảo một số
phương pháp định lượng berberin trong dược liệu dưới đây

6


5.1. Phương pháp cân:
- Theo Dược điển Việt Nam [3], nguyên tắc của phương pháp là chiết
kiệt dược liệu có protoberberin bằng cồn 90°, tủa alcaloid bằng KI, hoà tủa
vào nước nóng, kiềm hoá rồi thêm aceton để tạo tủa phức, lọc lấy tủa, sấy khô

đem cân.
+ lg tủa tương ứng với 898,2 mg berberin
+ lml dịch lọc bão hoà phức tương ứng với 0,0272 mg berberin.
- Kết tủa berberin với K[Co(N0 2 )4 (NH3 )2 ]. Rửa tủa bằng nựớc đá rồi làm
khô ở 60° rồi đem cân [9].
5.2. Phương pháp trung hoà, chuẩn độ berberin như là 1 base bậc 4 [9,12]
- Theo tài liệu Dược liệu học Hungari [12]: Bột dược liệu được kiềm hoá,
chiết kiệt bằng ether, lắc ether với nước acid H2 S0 4 loãng. Kiềm hoá dung
dịch acid H 2 S0 4 bằng NaOH rồi lắc với ether 2 lần. Thêm nước cất và thêm
chính xác dung dịch HC1 0,1N, đem bốc hơi hết mùi ether. Chuẩn độ acid HC1
0,1N thừa bằng NaOH 0,1N, chỉ thị màu là đỏ methyl.
lml HC1 0,1N tương ứng với 0,0353g berberin.
- Kết tủa berberin bằng acid silicolwolframic với chỉ thị đỏ congo hoặc
vàng metanil. Tủa sẽ chuyển màu tại điểm tương đương [9].
5.3. Phương pháp đo quang (so màu) [12]:
- Dịch chiết dược liệu có alcaloid protoberberin, thêm dung dịch NaOƠ
sẽ có màu đỏ xuất hiện, đem đo quang ở bước sóng 510nm. Cường độ màu
tuân theo định luật Lambert - Beer trong khoảng nồng độ 0,0004- 0,002%. Sai
số của phương pháp là 1,5% [12].

7


- Có thể sử dụng phản ứng tạo sản phẩm có màu giữa berberin với nước
Brom hoặc acid cromotropic trong môi trường acid để định lượng berberin
theo phương pháp này [9].
- Dược điển Việt nam III dựa trên cơ sở đo cường độ màu của dung dịch
berberin Sulfat ở bước sóng 420nm [4].
+Nguyên tắc: Bột dược liệu được kiềm hoá, chiết kiệt bằng ether, chiết
lại bằng acid H2 S0 4 2%. Lấy dịch chiết acid đo mật độ quang ở bước sóng

420nm. So sánh với dung dịch berberin Sulfat chuẩn để tính ra hàm lượng
berberin.
5.4. Phương pháp dùng sắc ký tách rồi đo quang [12]:
Những phương pháp định lượng trên (cân, trung hoà, so màu) đều cho kết
quả là hàm lượng protoberberin toàn phần tính theo berberin. Các phương
pháp này phù hợp với dược liệu chỉ có berberin hoặc berberin là alcaloid
chiếm tỉ lệ cao nhất. Đối với một số dược liệu, trong đó có Hoàng liên ô rô,
ngoài berberin còn chứa một lượng palmatin không ít. Để xác định chính xác
hàm lượng berberin trong dược liệu, người ta dùng SKLM để tách các
alcaloid, cạo lấy riêng phần chất hấp phụ có chứa berberin, phản hấp phụ bằng
dung môi thích hợp, sau đó đem đo quang.
6 - TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG:
6.1. Theo Y học cổ truyền:
+ Hoàng liên ô rô vị đắng, tính mát, vào phế, vị, can, thận, có tác dụng
thanh nhiệt, giải độc, tiêu viêm, làm se [16]
+ Rễ hoặc thân 4-15g (thuốc sắc hoặc thuốc bột) chữa kiết lỵ, ăn không
tiêu, tiêu chảy, viêm ruột, viêm gan, vàng da, đau mắt [14,16], quả có tác

8


dụng lợi tiểu [11]. Dùng ngoài, dược liệu nấu nước đặc rửa chữa viêm da, dị
ứng, ngứa lở [16]
+ Hoàng liên ô rô còn được dùng chữa ho lao, sốt cơn, khạc máu, lưng
gối yếu mỏi, chóng mặt, ù tai, mất ngủ [7].
6.2. Tác dụng của berberin và palmatin [2]:
+ Berberin có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn: Streptococcus
hemolyticus, Vitrio cholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus virideus,
Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis, Bacillus pneumoniae, Bacillus proteus,
Bacillus typhi, Bacillus coli.

+ Berberin với liều thấp làm tim hưng phấn, giãn động mạch, hạ huyết
áp, làm tăng mật, hạ sốt.
+ Berberin đem khử hoá cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần, làm
mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ.
+ Palmatin có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn ( Staphylococcus), liên cầu
khuẩn (Streptococcus), còn đối với các loại vi khuẩn khác (lỵ, thương hàn...)
không thấy có kết quả rõ rệt. Tác dụng ức chế vi khuẩn của palmatin kém các
loại kháng sinh thông thường.
+ Palmatin được dùng để điều chế dl- tetrahydropalmatin có tác dụng an
thần.
6.3. Tác dụng của một sô loài thuộc chi Mahonia:
Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đi sâu nghiên cứụ về loài M.
aquifolium, cho thấy nó có hiệu quả nổi bật trong điều trị bệnh vảy nến
[18,20,21,25]. Dịch chiết từ vỏ thân loài M. aquifolium có tác dụng ngăn chặn
sự phát triển của những tế bào hoá sừng [26]. Tại Đức, trong số 443 bệnh nhân

9

V


bị vảy nến được điều trị bằng M. aquifolium, 375 người đã khỏi hẳn sau 12
tuần điều trị hoặc sớm hơn [2 0 ].
Theo Muller K và Ziereis K, tác dụng ức chế sự phát triển các tế bào
hoá sừng của alcaloid chính trong cây- berberin- chỉ tương đương với tác dụng
của dịch chiết từ vỏ thân, trong khi đó những alcaloid có khung bisbenzyl
isoquinolin như berbamin, oxyacạnthin lại cho hiệu quả tốt hơn [26].
Bezakova L cùng một số tác giả khác đã công bố:

6

alcaloid có khung

bisbenzyl isoquinolin trong M. aquifolium là oxyacanthin, berbamin, armolin,
aquifolin, baluchistin, obamegin có hoạt tính chống oxy hoá, ngăn cản sự
peroxy hoá lipid. Trong đó, 2 alcaloid oxyacanthin, berbamin có tác dụng tốt
hơn cả. Các tác giả cho rằng sản phẩm oxy hoá trong chuyển hoá lipid là tác
nhân gây ra bệnh vảy nến. Cơ chế ngăn chặn quá trình oxy hoá lipid của các
alcaloid này có thể giải thích do sự ức chế trực tiếp các phản ứng peroxy hoá
hoặc sự thu dọn gốc tự do. Nhờ tác dụng này của các hợp chất alcaloid, dịch
chiết M. aquifolium có thể dùng trong chữa trị các bệnh mà tác nhân gây ra là
những sản phẩm của quá trình oxy hoá lipid, trong đó có bệnh vảy nến [19,24]

10


Phần 2:
THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
1 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
1.1. Nguyên liệu:
Thân phoi khô của cây Hoàng liên ô rô được thu hái ờ Đèo Gió- tỉnh Cao
Bằng.
1.2. Phương tiện:
* Hoá chất: Tiêu chuẩn phân tích, do phòng vật tư trường Đại học Dược
cung cấp.
- Berberin chuẩn: Do phòng Phân tích- tiêu chuẩn, Viện Dược liệu (Bộ
Y tế) cung cấp
- Palmatin chuẩn: Do Viện Kiểm nghiêm (Bộ Y tế) cung cấp.
- Bột Silicagen G do Viện Kiểm nghiệm (Bộ Y tế) cung cấp.
* Thiết bị:

- Máy xác định độ ẩm của dược liệu: Precisa PH- 60 (Thuỵ Sĩ)
- Đèn tử ngoại: Camag
- Máy đo quang phổ UV- VIS (Trung Quốc)
- Cân phân tích- Sartorius BP 121S
* Súc vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh, trọng lượng 18-20g/con, cả 2 giống,
chuột cái không có chửa, chủng Swiss, do Viện Vệ sinh dịch tễ TW cung cấp.
- Chuột cống trắng, khoẻ mạnh, trọng lượng 140-160g/con, do Viện
Quân y 103 cung cấp.

11


1.3. Phương pháp nghiên cứu:
1.3.1. Hoá học:
* Định tính:
- Định tính alcaloid bằng phản ứng chung và phản ứng đặc hiệu
[1,2,12,13].
- Định tính alcaloid nhân protoberberin bằng SKLM:
+ Bản mỏng Silicagen GF254
+ Hệ dung môi khai triển:
n- butanol: acid acetic: nước [7: 1: 2]
+ Đối chiếu với berberin và palmatin chuẩn.
* Định lượng berberin và palmatin bằng phương pháp đo quang.
- Nguyên tắc: dùng sắc ký lớp chế hoá tách riêng berberin và palmatin,
phản hấp phụ rồi đem đo quang.
Dịch chiết dược liệu được chấm lên các bản SKLM (kích thước
20x20cm). Khai triển bằng hệ dung môi n- butanol: acid acetic: nước [7: 1:2].
Soi đèn u v ở bước sóng 366nm, cạo riêng vết berberin và palmatin. Phản hấp
phụ bằng cồn 90°. Cô cạn. Hoà tan cắn trong acid H2 S0 4 2%.

+ Định lượng berberin: Dịch chiết acid H2 S0 4 2%, đem đo mật độ
quang ở bước sóng 420nm [4]. So sánh với dung dịch berberin Sulfat chuẩn để
tính ra hàm lượng berberin.
Hàm lượng berberin được tính theo công thức:
Z) X10
Voberberin = --------- (%)
D xa
c

12

(A)


Dt: Mật độ quang của dung dịch thử
Dc: Mật độ quang của dung dịch chuẩn.
a: Khối lượng dược liệu đem định lượng đã trừ độ ẩm (g)
+ Định lượng palmatin: Dịch chiết acid H2 S0 4 2%, đem đo mật độ
quang ở bước sóng 345nm. Xây dựng đường chuẩn của palmatin Sulfat ở
khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert- Beer. Dựa vào đường chuẩn để
tính hàm lượng palmatin.
Hàm lượng palmatin được tính theo công thức:

c xio 4

% palmatin = —------- (%)
a

(ß\

Ct: Nồng độ dung dịch thử (%)
a: Khối lượng dược liệu đem định lượng đã trừ độ ẩm (g)
1.3.2. Tác dụng sinh học:
* Thử độc tính cấp
- Nguyên tắc: cho chuột uống dịch sắc Hoàng liên ô rô ở liều cao cho
phép, theo dõi tình trạng chuột sau 72 giờ.
* Thử tác dụng chống viêm cấp tính [27]
- Nguyên tắc:
Thử thuốc trên chuột cống trắng theo đường uống. Sau đó, gây viêm
chân chuột bằng carrageenin. Mức độ viêm biểu hiện bằng độ phù. Đo thể tích
chân chuột tại các thời điểm trước và sau khi gây viêm 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 24, 30
giờ. Tính tỷ lệ phù chân chuột tại các thời điểm trên. Thuốc có tác dụng chống
viêm khi làm giảm tỷ lệ phù chân chuột ờ lô thử so với lô trắng tại các thời
điểm nghiên cứu với độ tin cậy 95% (P < 0,05).

13


Công thức tính tỷ lệ phù chân chuột:
V -V
X(%) = J
° X100(%)

(C)

o
X: Tỷ lệ phù chân chuột
V0: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm.

vt: Thể tích chân chuột ở thời điểm t sau khi gây viêm.

* Thử tác dụng lợi mật: Theo phương pháp mô tả bởi D. Dobrescu [27].
- Nguyên tắc:
Thử thuốc trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Mổ bụng thắt ống
mật chủ, sau đó lấy túi mật cân trọng lượng. So sánh trọng lượng mật của lô
thử với lô trắng. Thuốc có tác dụng khi làm tăng trọng lượng mật của lô thử so
với lô trắng ở độ tin cậy 95% (P < 0,05). Tính độ lợi mật theo công thức:
L(%) =

c

m —m
tg X100(%)
m_

(D)

L: Độ lợi mật.
mt: Trọng lượng mật trung bình của lô thử.
mc: Trọng lượng mật trung bình của lô chứng.
* Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan [27]
- Nguyên tắc:
Thử thuốc trên chuột cống trắng theo đường uống. Sau đó gây độc
tế bào gan chuột bằng CC14 10% trong dầu thực vật. Sau khi gây độc, tiêm
phúc mạc chuột dung dịch Thiopental. Khi tế bào gan chuột bị ngộ độc, tác
dụng của thuốc ngủ sẽ kéo dài. Xác định thời gian ngủ của chuột ởlô thử, lô

14


trắng, lô đối chứng. Thuốc có tác dụng bảo vệ tế bào gan khi rút ngắn thời

gian ngủ của chuột ở lô thử so với lô đối chứng với độ tin cậy 95%.
1.3.3. Phương pháp xử lý kết quả thực nghiệm:
Các kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê toán học [10]:
* Khoảng tin cậy: Vói mẫu nhỏ n < 30
- Tính:

1

XT

- Tìm khoảng tin cậy:

t

a xS

ta: tra bảng
- Biểu thị kết quả:

X ±£
*

Đánh giá tác dụng của thuốc bằng test Student- Fisher: so sánh

trị trung bình của lô thử thuốc với lô chứng ở độ tin cậy 95%.
- Công thức:

15

ỵ ( x AI- x Ar +ỵ ( x Bi- x eynA +nB - 2

t tn

nA X nB

x -

n A + n B

XA , XB: Trung bình cộng của lô thử và lô chứng.
nA, nB: Số súc vật thí nghiệm của lô thử và lô chứng.
S2a b: Phương sai chung của cả 2 mẫu
t0: tra bảng Student-Fisher (t) ở mức tự do n,+ n2- 2 và p < 0,05.
+ Nếu tm> t0 ở p < 0,05 thì 2 giá trị của lô thử và lô chứng khác nhau
có ý nghĩa thống kê. Kết luận này đáng tin cậy ở mức p < 0,05.
+ Nếu ttn < t0 ở p < 0,05 thì 2 giá trị của lô thử và lô chứng khác nhau
không có ý nghĩa thống kê. Kết luận này đáng tin cậy ở mức p < 0,05

16


2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM:
2.1. Nghiên cứu về hoá học:
2.1.1. Định tính:
*

Đinh tính các alcaloid bằng phản ứng chung và phản ứng đăc hiẽu:
Lấy khoảng lOg bột dược liệu, chiết kiệt hoạt chất bằng 50ml cồn 90°,

bốc hơi còn khoảng 15ml dịch chiết. Dịch chiết này được dùng làm các phản
ứng hóa học.
- Các phản ứng chung của alcaloid
+ lml dịch chiết + 1 -2 giọt TT Dragendorff. Phản ứng dương tính
khi xuất hiện tủa màu da cam.
+ lml dịch chiết +1-2 giọt TT Bouchardat. Phản ứng dương tính khi
xuất hiện tủa màu nâu.
+ lml dịch chiết +1-2 giọt TT Mayer. Phản ứng dương tính khi xuất
hiện tủa trắng.
- Xác định alcaloid có nhân protoberberin:
+ lml dịch chiết, thêm 0,5ml H2 S0 4 đặc, thêm dần vào thành ống
lml nước Brom. Phản ứng dương tính khi giữa hai lớp tiếp xúc xuất hiện vòng
đỏ.
+ 1 giọt dịch chiết bốc hơi trên phiến kính, thêm 1 giọt acid HC1
đặc, để yên trong 30 phút. Phản ứng dương tính khi soi kính hiển vi thấy từng
bó tinh thể kết tinh hình kim màu vàng.
+ 1 giọt dịch chiết bốc hơi trên phiến kính, thêm 1 giọt acid HNO3
đặc, để yên trong 30 phút. Phản ứng dương tính khi soi kính hiển vi thấy tinh
thể hình chấm vàng.
Kết quả định tính được ghi ở bảng 1

17


Bảng 1. Kết quả định tính alcaloid .
STT

Phản ứng định tính

Kết quả

1

TT Dragendorff

+++

2

TT Bouchardat

++

3

TT Mayer

++

nhân

4

Nước Brom

++

protoberberin

5

Phản ứng kết tinh muối

++

Kết luận

Có alcaloid

* Đinh tính các alcaloid nhân protoberberin bằng SK LM.
- Bản mỏng Silicagen GF254 kích thước

5x12cm được hoạt hoá ở 110°c

trong 30 phút.
- Dịch chấm sắc ký: dịch chiết cồn.
- Hệ dung môi khai triển: n- butanol: acid acetic: nước [7: 1:2]
- Thuốc thử hiện màu: Dragendorff
- Dung dịch berberin chuẩn, palmatin chuẩn: 0,5% trong cồn tuyệt đối.
- Soi đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng X = 366nm.
Kết quả phân tích alcaloid bằng SKLM được ghi ở bảng 2.
Bảng 2. Kết quả phân tích alcaloid bằng SKLM.
Vết số

Rf

Soi đèn

uv

(k =366nm)

Màu khi phun TT
Dragendoff

1

0,08

Vàng nhạt

2

0 ,1 2

Vàng nhạt

3

0,15

Vàng nhạt

4

0 ,2 0

Vàng nhạt

5

0,25

6

0,29

Xanh tím

7

0,39

Vàng tươi

Vàng cam

8

0,49

Vàng

Tím tro

Vàng cam

18

• Nhận xét: Trên bản SKLM có

8

vết, trong đó có 2 vết có Rf và màu

sắc tương ứng với Rf và màu sắc của vết berberin và palmatin chuẩn.

DC: Dịch chiết alcaloid
Bc: Berberin chuẩn
Pc: Palmatin chuẩn

Hình III. Sắc ký đồ phân tích alcaloid

19


2.1.2. Định lượng berberin và palmatin:
* Tiến hành:
- Cân chính xác khoảng 25g dược liệu, thấm ẩm bằng cồn 90°. Sau đó,
cho vào túi giấy lọc, chiết trong bình Soxhlet bằng cồn 90° trên nồi cách thuỷ
tới kiệt alcaloid (kiểm tra bằng TT Dragendorff). Cất thu hồi cồn tới cắn. Hoà
tan cắn trong cồn tuyệt đối (khoảng 15ml). Chuyển dung dịch này vào bình
định mức 25ml, thêm cồn tuyệt đối đến vạch, lắc đều (dung dịch thử).
- Chuẩn bị bản SKLM (kích thước 20x20 cm), tráng Silicagen G, hoạt
hoá ở

1 10

°c trong

1

giờ.

- Dùng micropipet ( 25|J,1 ) chấm 250 |il dịch thử lên bản SKLM đã
chuẩn bị ở trên thành dải. Chấm đồng thời 2 vết berberin, palmatin chuẩn để
đối chiếu.
- Khai triển sắc ký bằng hệ dung môi:
n- butanol: acid acetic: nước [7: 1 : 2 ]
Khi dung môi chạy gần hết bản mỏng, lấy ra để baỵ hết hơi dung
môi, sau đó đem soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm, đánh
dấu vết tương ứng berberin và palmatin. Cạo các vết berberin và palmatin vào
các cốc riêng.
- Dùng cồn tuyệt đối phản hấp phụ berberin và palmatin, lọc, rửa giấy
lọc bằng cồn tuyệt đối. Bốc hơi cồn thu được cắn.
+ Định lươn 2 be rbe rin:
Hoà tan cắn trong 15 ml dung dịch H2 S0 4 2%. Chuyển dung dịch
này vào bình định mức 25 ml. Bổ sung dung dịch H2 S0 4 2% đến vạch, lắc
đều. Đo mật độ qưang của dung dịch ở bước sóng 420nm.

20


Dung dịch chuẩn: Dung dịch berberin 0,1% trong dung dịch acid
sulfuric 2% (dung dịch A). Hút chính xác 1 ml dung dịch A (tương đương với
1 mg berberin chuẩn) cho vào bình định mức 25 ml, thêm dung dịch H2 S0 4
2% đến vạch, lắc đều. Đo mật độ quang ở bước sóng 420nm.
Mẫu trắng là acid sulfuric 2%.
Tính kết quả theo công thức (A) mục 1.3.1

Tiến hành định lượng 5 mẫu, kết quả được ghi ở bảng 3.
Bảng 3: Hàm lượng berberin trong thân Hoàng liên ô rô
Mẫu

a(g)

Dt

Hàm lượng

Dc

berberin (%)
1

21,8397

0,565

0,578

0,45

2

22,0095

0,570

0,578

0,45

3

22,0900

0,577

0,578

0,45

4

22,0900

0,585

0,578

0,46

5

22,0971

0,593

0,578

0,46

Trung bình

0,45 ±0,01

+ Đinh lươn2 Daìmatin:
Hoà tan cắn trong 50 ml dung dịch acid H2 S0 4 2%. Chuyển dung
dịch này vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch H2 S0 4 2% đến vạch, lắc
đều (dung dịch thử). Đo mật độ quang ở bước sóng 345nm.
Mẫu trắng là dung dịch acid H2 S0 4 2%.
• Xây dựng đường chuẩn của palmatin Sulfat:
Khảo sát khoảng nồng độ dung dịch palmatin Sulfat tuân theo
định luật Lambert- Beer tại bước sóng 345nm.

21