khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn bacillus cereus k13

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM
CỦA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS K13

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

SINH VIÊN THỰC HIỆN
DƢƠNG TRỌNG TÍN
MSSV: 309 2445
LỚP: CNSH K35

Cần Thơ, Tháng 5/2013


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(ký tên)

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Bùi Thị Minh Diệu

Dương Trọng Tín

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian học tập tại trường tôi đã nhận được sự quan tâm hướng dẫn của
thầy cố vấn học tập Trần Vũ Phương cùng sự chỉ dạy tận tình của các thầy cô ở Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Khoa Nông Nghiệp, Khoa Khoa Học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn và giúp
tôi hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
các anh chị và các bạn sinh viên thuộc phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật đã
quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn đến tất cả sự quan tâm và giúp đỡ quý báu!
Tác giả

Dƣơng Trọng Tín

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƢỢC
Lông gia cầm là phế phẩm được sinh ra với khối lượng lớn từ hoạt động chăn
nuôi và giết mổ. Với thành phần chính là keratin, lông gia cầm khó bị phân hủy và gây
ảnh hưởng xấu đến môi trường. Sử dụng vi sinh vật để phân hủy nguồn chất thải này
đang là hướng đi mới vừa có thể giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường lại có thể sử

dụng sản phẩm tạo thành bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Kết quả thực hiện đề tài
“Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm
của vi khuẩn Bacillus cereus K13” cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu cho dòng vi
khuẩn này là 3 ngày. Tại mức nhiệt độ 37°C và pH 7,5 vi khuẩn có mật số và khả năng
phân hủy bột lông cao nhất so với các nghiệm thức còn lại. Hoạt động của vi khuẩn bị
ức chế khi môi trường nuôi cấy có bổ sung glucose (1% w/v). Trong môi trường có bổ
sung rỉ đường (1% w/v), mật số vi khuẩn tăng lên nhưng khả năng phân hủy bột lông
bị giảm đi. Ngoài bột đậu nành giúp làm tăng mật số vi khuẩn, các nguồn nitơ khác
khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy đều làm giảm sự phát triển cũng như khả năng
phân hủy bột lông của vi khuẩn so với môi trường chỉ chứa bột lông là nguồn dinh
dưỡng duy nhất.
Từ khóa: lông gia cầm, keratin, Bacillus cereus .

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ..................................................................................................... i
LỜI CẢM TẠ............................................................................................................. ii
TÓM LƢỢC.............................................................................................................. iii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iv

DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... vii
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................... viii
TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................................... ix
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 2
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về lông gia súc – gia cầm ................................................................ 3
2.2. Keratin ............................................................................................................. 4
2.3. Enzyme keratinase ........................................................................................... 5
2.4. Sơ lƣợc về vi sinh vật phân hủy keratin.......................................................... 6
2.4.1. Vi khuẩn Bacillus....................................................................................... 6
2.4.2. Các nhóm vi sinh vật khác ........................................................................ 7
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .................................................... 8
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ............................................................. 8
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở nƣớc ngoài .......................................................... 8
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 11
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................. 11
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu................................................................................. 11
3.2.1. Giống vi khuẩn ........................................................................................ 11
3.2.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................. 11
3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn................................................................. 11
3.2.4. Hóa chất ................................................................................................... 12
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

3.2.5. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................... 12
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 13
3.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn giống ......................................................................... 13
3.3.2. Chuẩn bị nguồn cơ chất .......................................................................... 13
3.3.3. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian ....... 14
3.3.4. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát
triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn............................ 14
3.3.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa
carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi
khuẩn ................................................................................................................. 15
3.3.6. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa
nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn 16
3.3.7. Phƣơng pháp xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy .................................. 16
3.3.8. Phƣơng pháp xác định mật số vi khuẩn ................................................. 17
3.3.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................... 17
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 18
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian ............. 18
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và
khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn ............................................. 19
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa carbon
đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn ........................ 23
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa nitơ
đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn ........................ 26
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 29
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 29
5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 30

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

PHỤ LỤC............................................................................................................
PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................
Bảng 6. Kết quả thí nghiệm 1 ............................................................................
Bảng 7. Kết quả thí nghiệm 2 ............................................................................
Bảng 8. Kết quả thí nghiệm 3 ............................................................................
Bảng 9. Kết quả thí nghiệm 4 ............................................................................
PHỤ LỤC 2 .............................................................................................................
Kết quả thống kê thí nghiệm 1 ..........................................................................
Kết quả thống kê thí nghiệm 2 ..........................................................................
Kết quả thống kê thí nghiệm 3 ..........................................................................
Kết quả thống kê thí nghiệm 4 ..........................................................................

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ .......................................... 3
Bảng 2. Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ rắn .......................................... 11
Bảng 3. Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ lỏng ........................................ 12
Bảng 4. Thành phần hóa chất môi trường BSM ......................................................... 12
Bảng 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột
lông gia cầm .............................................................................................................. 20
Bảng 6. Kết quả thí nghiệm 1.........................................................................................
Bảng 7. Kết quả thí nghiệm 2.........................................................................................
Bảng 8. Kết quả thí nghiệm 3.........................................................................................
Bảng 9. Kết quả thí nghiệm 4.........................................................................................

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc α-keratin và β-keratin .......................................................................... 5
Hình 2. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus cereus ................................................................... 7
Hình 3. Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian.......................................... 18
Hình 4. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến mật số vi
khuẩn ........................................................................................................................... 23
Hình 5. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến khả năng phân
hủy bột lông của vi khuẩn ............................................................................................ 24
Hình 6. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số vi khuẩn. 26
Hình 7. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến khả năng phân
hủy bột lông của vi khuẩn ............................................................................................ 27

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

viii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

TỪ VIẾT TẮT

B.

Bacillus

BSM

Basal salt medium

CFU

colony-forming unit

EDTA

Ethylene Diamin Tetra Aceticacid

PMSF

phenylmethanesulfonyl fluoride

PTN

Phòng thí nghiệm

rpm

Rotation per minute

rRNA

Ribosomal ribonucleotide acid

w/v

Weight/volume

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ix

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Theo số liệu từ Tổng cục thống kê, năm 2011, đàn gia cầm cả nước có 322,6
triệu con và đàn gia súc là khoảng 28 triệu con, trong đó đàn lợn chiếm 27,1 triệu
con. Sự phát triển mạnh của ngành chăn nuôi là một phần quan trọng để giải quyết vấn
đề lương thực cho hơn 85 triệu dân ở nước ta. Tuy nhiên, việc phát triển ngành chăn
nuôi lại gây ra nhiều ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống, đòi hỏi con người phải
tìm ra biện pháp xử lý thích hợp. Trong số các loại chất thải tạo ra trong quá trình chăn
nuôi và giết mổ gia súc – gia cầm thì phế phẩm lông là khó xử lý nhất do thành phần
chính của chúng là keratin, một loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân
hủy cao, cần thời gian rất lâu để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên.
Chất thải lông gia súc – gia cầm thường được xử lý bằng cách chôn lấp hoặc đốt
cháy và thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi
trường đất, nước và không khí, cho nên đòi hỏi cần phải có biện pháp xử lý mới tốt
hơn cho các loại phế phẩm này; mục tiêu là vừa có khả năng phân hủy chúng và không
gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. Công nghệ sinh học mà cụ thể là công nghệ vi
sinh vật chính là chìa khóa quan trọng để giải quyết vấn đề này. Do bản chất của lông

là protein nên vi khuẩn hoàn toàn có khả năng phân hủy được chúng thông qua hoạt
động của hệ enzyme keratinase. Bên cạnh đó, nếu được xử lý thích hợp thì phế phẩm
lông có thể trở thành một nguồn protein bổ sung hiệu quả vào thức ăn chăn nuôi thay
thế cho các nguồn protein đắt tiền khác, vừa có thể giải quyết vấn đề môi trường lại có
thể tận dụng nguồn phế phẩm này đem lại hiệu quả cao về kinh tế.
Dòng vi khuẩn K13 được tuyển chọn ra từ 19 dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất
và nước lấy từ lò giết mổ gia súc tại huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre. Đây là dòng vi
khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc và gia cầm cao nhất trong số các dòng vi
khuẩn phân lập được. Đoạn gene 16S rRNA được xác định cho kết quả tương đồng với
dòng vi khuẩn Bacillus cereus PRM2 ở mức 99%. Do môi trường nuôi cấy có ảnh
hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn, nên để có thể ứng dụng dòng vi khuẩn vào
thực tiễn cần tiến hành các nghiên cứu khảo sát nhằm chọn ra điều kiện môi trường tối
ưu cho sự phát triển của vi khuẩn, nâng cao khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin và
chọn ra hướng ứng dụng phù hợp cho dòng vi khuẩn này.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

1.2. Mục tiêu đề tài
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, nguồn nitơ, nguồn carbon đến
sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của dòng vi khuẩn Bacillus cereus K13.
Qua đó, xác định các điều kiện môi trường thích hợp để ứng dụng dòng vi khuẩn này

vào việc xử lý và chế biến phế phẩm lông vào thực tiễn.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về lông gia súc – gia cầm
Lông là một phế phẩm sinh ra với số lượng lớn tại các cơ sở giết mổ gia súc – gia
cầm và nhà máy chế biến thực phẩm, khối lượng lên đến hàng triệu tấn mỗi năm trên
toàn thế giới (Manczinger et al., 2003). Tùy thuộc vào giống vật nuôi và độ tuổi mà tỉ
lệ lông trên trọng lượng cơ thể có sự khác nhau. Đối với gia súc lớn như lợn, lông
chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng lượng cơ thể, đối với gà trưởng thành tỉ lệ này đạt từ 5 –
7%.
Bảng 1. Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ
Hàm lƣợng (g/kg)

Protein và các acid amin
Protein

922,0

Alanine

28,8

Glycine

51,8

Isoleucine

39,4

Leucine

56,9

Valine

53,0

Phenylalanine

34,6

Arginine

67,6

Histidine

2,3

Lysine

15,4

Aspartic acid

41,8

Glutamic acid

82,2

Serine

87,3

Threonine

34,5

Proline

73,9

Cystine

65,8

Methionine

7,1

(Nguồn: Latshaw et al., 1994)
Bởi vì thành phần chính của lông là keratin (chiếm hơn 92%), nên chất thải lông
được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn protein đắt tiền
khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi. Để có thể trở thành thức ăn chăn
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

nuôi, chất thải lông cần trãi qua nhiều giai đoạn xử lý bằng các phương pháp vật lý và
hóa học khác nhau. Tại các cơ sở chế biến hiện đại, lông vũ được nấu dưới áp suất cao,
sử dụng hơi nước trực tiếp thủy phân một phần protein, phá hủy các cầu nối bền trong
cấu trúc keratin. Sau đó, bột lông vũ đã thủy phân sẽ được xử lý bằng men pepsin tạo
ra một sản phẩm có tính ngon miệng cao và dễ tiêu hóa đối với nhiều loài vật nuôi.
Đặc biệt đây là nguồn dồi dào các acid amin như Leucin, Arginine, Cystein. Tuy nhiên
những quá trình này đòi hỏi rất nhiều năng lượng và chi phí đầu tư sản xuất cũng rất
lớn. Bên cạnh đó, quá trình gia nhiệt và xử lý hóa học cũng làm phá hủy một số acid
amin nhạy cảm bởi nhiệt có trong thành phần lông như Methionine, Lysine,
Tryptophan (Papadoulos, Ketelaars, 1986) và tạo ra một số acid amin như Lanthionine
và Lysinoalanine làm giảm sút đáng kể giá trị dinh dưỡng của sản phẩm tạo thành.
Công nghệ vi sinh vật phát triển đã mở ra một hướng đi mới, phân hủy chất thải

lông bằng biện pháp sinh học nhờ hoạt động của vi khuẩn nhằm tạo ra một nguồn
protein có tỉ lệ dinh dưỡng cân bằng hơn, cải thiện giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, bổ
sung vào thức ăn chăn nuôi thay thế các nguồn protein đắt tiền khác, và đồng thời còn
giúp hổ trợ xử lý các nguồn rác thải có chứa nhiều cơ chất keratin để giải quyết vấn đề
ô nhiễm môi trường.
2.2. Keratin
Keratin là nhóm protein có cấu trúc dạng sợi, hiện diện rất phong phú trong tế
bào biểu mô của động vật có xương sống và là thành phần chủ yếu cấu tạo nên các
phần phụ như móng, tóc, lông,… Keratin ở các loài động vật có xương sống khác nhau
có trình tự acid amin và cấu trúc cơ bản tương tự nhau. Trình tự acid amin quyết định
cấu trúc phân tử và tính chất của những cấu trúc bậc cao hơn, cũng như ảnh hưởng đến
các liên kết trong phân tử keratin. Các chuỗi acid amin này được cuộn chặt, ở dạng
xoắn α (α-keratin) hoặc ở dạng phiến β (β-keratin) và gấp nếp tạo thành cấu trúc ba
chiều. Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ vào những cầu nối disulfide, liên kết hydro và
tương tác kị nước làm cho keratin có khả năng kháng lại tác động của các tác nhân
phân hủy vật lý, hóa học và sinh học. Keratin không tan trong nước, acid loãng, kiềm
và dung môi hữu cơ, cũng như không bị phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein
như pepsin, trypsin, papain (Veslava et al., 2009); tuy nhiên chúng có thể bị phân hủy
bởi các chất gây biến tính như thioglycollate, dithiothreitol, mercaptoethanol do các
cầu nối disulfide bền bị cắt đứt. Keratin được phân thành hai nhóm chính dựa theo
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

hàm lượng lưu huỳnh. Keratin cứng hiện diện nhiều ở tóc, móng guốc,… với hàm
lượng cầu nối disulfide cao; trong khi keratin mềm với các cầu nối disulfide ít hơn tìm
thấy chủ yếu ở da và mô.

Hình 1. Cấu trúc α-keratin và β-keratin
(Nguồn: Trần Tố,2008)
2.3. Enzyme keratinase
Keratinase là loại enzyme có khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin trong tự
nhiên và được phân loại là protease với mã số là EC 3.4.21/24/99.11 (Gupta,
Rammani, 2006). Keratinase được định nghĩa là serine protease do nó tương đồng
trình tự 97% với protease kiềm và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế tương tự chất
ức chế serine protein (Bressollier et al., 1999, Wang et al., 2003).
Tuy keratin là một dạng protein khó bị phân hủy, nhưng thực tế ngoài tự nhiên
các dạng cơ chất chứa keratin như lông, móng, sừng,… vẫn bị phân hủy. Điều này có
được là do hoạt động của các vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng
sinh ra keratinase. Tuy nhiên, khả năng tạo ra keratinase của vi sinh vật phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và cả điều kiện của môi trường. Đây
được xem như một nguồn enzyme quan trọng có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh
vực khác nhau như công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,…
Phần lớn keratin bị phân hủy do tác động của keratinase tiết ra từ tế bào vi khuẩn,
tuy nhiên theo nhiều báo cáo nghiên cứu, các tế bào vi khuẩn cũng giữ một vai trò
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

quan trọng trong quá trình phân hủy cơ chất chứa keratin. Những thành phần disulfide
reductases, sulfite, thiosulfate và keratinase có trong tế bào giúp bẻ gãy các cầu nối
disulfide hỗ trợ cho quá trình phân hủy của enzyme ngoại bào được tốt hơn. Như vậy,
có thể nói rằng, quá trình phân hủy keratin bao gồm hai bước là phá hủy các cầu nối
disulfide và phân hủy dây protein (Gupta, Rammani, 2006).
Keratinase từ vi sinh vật có pH tối ưu nằm trong khoảng từ trung tính đến kiềm
(6 đến 9), và nhiệt độ tối ưu từ 30°C đến 80°C, có khi đạt tới 100°C như ở chủng vi
khuẩn Fervidobacterium islandicum AW-1 (Nam et al. 2002).
Keratinase được kích thích khi môi trường có chứa các ion hóa trị hai như Ca2+,
Mg2+ và Mn2+. Trong khi đó, hoạt tính keratinase bị ức chế bởi các ion kim loại Cu2+,
Zn2+, Ag+, Pb+,… và các hợp chất như phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF),
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1,10-o-phenanthroline.
2.4. Sơ lƣợc về vi sinh vật phân hủy keratin
2.4.1. Vi khuẩn Bacillus
Theo kết luận của Ghosh et al. (2007) thì phần lớn các vi sinh vật có khả năng
phân hủy cơ chất chứa keratin cao thường là vi khuẩn, đa số thuộc chi Bacillus.
Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia
tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme
ngoại bào. Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc
kỵ khí không bắt buộc và hình thành nội bào tử. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn
thuộc chi Bacillus rất đa dạng. Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám.
Trong số các chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được
mô tả có khả năng phân hủy keratin tốt (Manczinger et al., 2003). Bacillus
licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất, nhiệt độ tăng
trưởng tối ưu khoảng 30°C, sinh enzyme tối đa ở 37°C và có khả năng sinh bào tử ở
môi trường khắc nghiệt.
Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí tùy tiện, sinh nội bào tử,

kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,8 – 3µm. Khi gặp điều kiện bất lợi B. subtilis có khả năng
hình thành bào tử, bào tử tồn tại rất lâu trong tự nhiên và có thể phát triển lại thành tế
bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. B. subtilis là một trong những

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp bao gồm sản xuất amylase,
protease, inosine ribosides, pullulanase, chitinase, và các acid amin.
Bacillus cereus là trực khuẩn, Gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5 –
1,5µm x 2 – 4µm. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động. B. cereus
là vi khuẩn hiếu khí và kị khí không bắt buộc, có thể tồn tại ở nhiệt độ 5 – 50°C , tối
ưu là 35 – 40°C; pH tồn tại trong khoảng 4,5 – 9,3, thích hợp nhất ở 7 – 7,2.

Hình 2. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus cereus
(Nguồn:, 25/12/2012)
2.4.2. Các nhóm vi sinh vật khác
Nhóm vi khuẩn : nhóm vi khuẩn Gram dương có khả năng phân hủy keratin bao
gồm Lysobacter, Nesternokia, Kocurica và Microbacterium và một vài dòng Gram âm
như Vibrio, Xanthomonas, Stenotrophomonas, Chryseobacterium (Sangali, Brandelli,
2000; De Toni et al., 2002).
Nhóm xạ khuẩn : chủ yếu là nhóm Streptomyces bao gồm S. fradiae (Novel and

Nickerson, 1959), S. sp. A11 (Mukhopadhyay, Chandra, 1990), S. pactum (Bockle et
al., 1995), S. albidoflavus (Letourneau et al., 1998), S. thermoviolaceus SD8 (Chitte et
al., 1999).
Nhóm nấm: Chrysosporium, Aspergillus, Alternaria, Trichurus, Curvularia,
Cladosporium,

Fusarium,

Geomyces,

Gleomastis,

Monodictys,

Myrothecium,

Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium,
Doratomyces (Gradisar et al., 2000).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin ở trong nước còn rất
hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu về phân lập vi sinh vật phân hủy lông vũ ở miền
Bắc và vẫn chưa có nghiên cứu ứng dụng vào thực tế.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) đã phân lập một số dòng vi khuẩn (Bacillus sp.
Đ.NĐ 1.2, Bacillus sp. Đ.HY 1.1, chủng L.HY 2.6 và L.TO 2.1) có khả năng phân hủy
lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản. Điều kiện thích hợp cho các chủng
vi khuẩn này là ở 30°C đến 40°C và có khả năng phân hủy lông vũ đạt từ 75% đến
90% sau một tuần nuôi cấy.
Nguyễn Thu Hiền et al. (2010), Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, đã phân
lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân hủy lông vũ.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở nƣớc ngoài
S. Sangali và A. Brandelli (2000) đã phân lập được một dòng vi khuẩn thuộc họ
Vibrionaceae từ vùng nuôi gia cầm công nghiệp ở Brazil. Vi khuẩn được phân lập trên
môi trường chứa lông gia cầm được sử dụng như là nguồn năng lượng, carbon và nitơ
duy nhất. Trong nghiên cứu này vi khuẩn phát triển thuận lợi nhất ở 30oC và hoạt tính
enzyme thu được tối đa ở nhiệt độ 55°C và pH 8,0.
S. Riessen và G. Antranikian (2001) đã phân lập được dòng vi khuẩn
Thermoanaerobacter keratinophilus có khả năng chịu nhiệt cao, điều kiện tối ưu cho
sự phát triển của dòng vi khuẩn này là 70°C, pH 7,0 và 0,5% NaCl; chúng có khả năng
phân hủy đến 60% lông cừu sau sáu ngày ủ trong điều kiện yếm khí.
Riffel et al. (2003) nghiên cứu thấy rằng dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp.
Kr6 có khả năng phân hủy lông vũ rất cao, phát triển tốt nhất ở 30°C và pH 8. Đồng
thời nghiên cứu cũng cho thấy tác động ức chế hoạt tính keratinase của EDTA, Hg2+,
Cu2+ và khả năng kích thích bởi Ca2+.
Geun-Tae Park et al. (2006) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện
môi trường đến khả năng phân hủy lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn
Bacillus megaterium F7-1. Dòng vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng
7 ngày. Nhiệt độ tối ưu 25 – 40oC, và pH tối ưu từ 7 – 11. Việc bổ sung các nguồn nitơ

khác nhau có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính keratinase; các nguồn nitơ hữu cơ như yeast
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

extract, casein, tryptone làm tăng đáng kể hoạt tính enzyme trong khi urê, các nguồn
nitơ vô cơ như NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4 và các nguồn carbon như glycerol
và manitol lại làm giảm khả năng phân hủy lông cũng như hoạt tính keratinase.
R. Gupta và P. Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi
khuẩn và ứng dụng của enzyme này. Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều
kiện môi trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế
phản ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân
protein. Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm
sạch và làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp.
Mohammad et al. (2007) nghiên cứu sự phát triển và hoạt tính keratinase của
dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 phân lập từ chất thải gia cầm. Dòng vi
khuẩn này phát triển và sinh enzyme tốt nhất ở điều kiện pH 8,0 và nhiệt độ 40°C. Khả
năng phân hủy keratin tăng 12% trong môi trường có bổ sung NH4Cl vởi tỉ lệ 0,1%
(w/v) và tăng 30% khi bổ sung rỉ đường với tỉ lệ 1% (w/v).
Radhika Tatineni et al. (2007) nghiên cứu hoạt tính keratinase thu được từ
Streptomyces sp. cao nhất ở nhiệt độ 45°C và pH 11. Đồng thời nhận thấy môi trường
bổ sung ion Ca2+, Mg2+ có hoạt tính keratinase cao hơn, trong khi ion Zn2+ làm ức chế
hoạt động của keratinase.

A. Ghosh et al. (2008) nghiên cứu khả năng phân hủy lông vũ của dòng vi khuẩn
Bacillus cereus DCUW cho khả năng phân hủy cao nhất ở 50oC và pH 8,5. Đồng thời
nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của enzyme trên nhiều loại cơ chất khác nhau gồm
keratin, casein, collagen, fibrin, gelatin và khả năng ức chế hoàn toàn hoạt tính
keratinase bởi PMSF.
Bo Xu et al. (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là
Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90oC) và pH rộng (6 – 10).
Nhiệt độ tối ưu là 60oC và pH tối ưu từ 7,5 – 8.
Veslava et al. (2009) đã chọn ra các dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis 511, B.
subtilis 11, B. subtilis 717, B. subtilis 103 phân lập từ nước thải tại khu chế biến gia
cầm để khảo sát khả năng phân hủy lông gia cầm. Các dòng vi khuẩn được phân lập
trên môi trường có bổ sung bột lông vũ : (NaCl 0,5 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, K2HPO4 0,3
g/L, bột lông vũ 10 g/L và agar 15 g/L). Đối với dòng B. subtilis 103 thì hàm lượng
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

keratinase tối đa là 153 U/ml sau 24 giờ nuôi cấy, trong khi các dòng khác từ 148 –
292 U/ml sau 48 giờ nuôi cấy.
Onuoha et al. (2011) đã chọn ra dòng vi khuẩn Bacillus sp. D4 có khả năng phân
hủy lông vũ cao, pH tối ưu của dòng vi khuẩn này là 10,0 và phát triển tốt nhất ở nồng
độ bột lông từ 6 – 7% (w/v).
Sabrina et al. (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả

năng phân hủy lông gà và hoạt tính enzyme của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis SLC.
Lượng keratinase sinh ra cao nhất trong môi trường có bổ sung 1% (w/v) lông gà ở
nhiệt độ 60oC và pH 10,0.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại PTN Sinh học phân tử thực vật và PTN
Sinh hóa, thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
Học Cần Thơ.
 Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 5/2013.

3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn Bacillus cereus K13 được Đinh Thị Bé Hiền (2012) phân lập từ
mẫu đất và nước thu tại lò giết mổ gia súc ở huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre. Giống
vi khuẩn ròng được giữ lạnh trong ống nghiệm trữ tại PTN Sinh học phân tử thực vật
thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2.2. Vật liệu thí nghiệm

-

Bột lông gia cầm.

-

Rỉ đường mía.

-

Bột đậu nành.

3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 2. Thành phần hóa chất môi trƣờng bột lông vũ rắn
Nồng độ (g/l)

Hóa chất
MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

Bột lông gia cầm

10

Agar

20

(Bo Xu et al., 2009)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

Bảng 3. Thành phần hóa chất môi trƣờng bột lông vũ lỏng
Nồng độ (g/l)

Hóa chất
MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

Bột lông gia cầm

10

Bảng 4. Thành phần hóa chất môi trƣờng BSM
Nồng độ (g/l)

Hóa chất
MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

3.2.4. Hóa chất
 Hoá chất dùng để nuôi cấy các dòng vi khuẩn:
K2PO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, Glucose, Sucrose, NH4Cl, Yeast extract.
 Hóa chất điều chỉnh pH:
NaOH 0,1N, HCl 0,1N.
3.2.5. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
 Thiết bị:
- Bộ micropipette Gibson P10, P20, P200, P1000 - Đức
- Cân điện tử Sartorius - Đức
- Kính hiển vi Olympus CHT - Nhật
- Máy lắc mẫu GFL 3005 - Đức
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international - Đức
- Tủ cấy vi sinh vật - Pháp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

- Tủ lạnh trữ mẫu Akira - Việt Nam
- Tủ sấy EHRET - Đức
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 - Đức
- Máy đo pH
- Máy vortex
- Máy vi tính lưu trữ và xử lý số liệu.
 Dụng cụ
- Đĩa Petri
- Ống nghiệm
- Bình tam giác 250 ml
- Chai thủy tinh 250, 500, 1000 ml
- Ống đong 100, 500, 1000 ml
- Đầu cone xanh, vàng, trắng.
- Bình hút ẩm
- Eppendoft
- Que cấy, que trãi tam giác, đèn cồn, ống nhỏ giọt
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn giống
Giống vi khuẩn ròng trữ lạnh trong ống nghiệm được cấy chuyển sang đĩa petri
chứa môi trường bột lông vũ rắn, ủ ở 37oC trong hai ngày. Sau đó cấy vào bình chứa
100ml môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 20 phút, nuôi
tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở 37oC trong 48 giờ. Rút 1ml dịch nuôi cấy tiến
hành đếm mật số vi khuẩn. Mật số cần đạt khoảng 107 CFU/ml. Trữ lạnh bình nuôi
tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4oC.
3.3.2. Chuẩn bị nguồn cơ chất
-

Bột lông vũ được sấy khô ở 80oC trong hai đến năm ngày, bảo quản trong bình

hút ẩm cho đến khi sử dụng

-

Dịch rỉ đường được lọc qua vải lọc, loại bỏ các phần xác bã mía, bảo quản trong
bình thủy tinh ở nơi khô mát.

-

Bột đậu nành được nghiền mịn, sấy khô ở 80°C từ hai đến năm ngày, bảo quản
trong ống nghiệm.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

3.3.3. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian
 Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời
gian nuôi cấy tối ưu của dòng vi khuẩn B.cereus K13.
 Bố trí thí nghiệm:
-

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian.

-

Số lần lặp lại: ba lần.

-

Số nghiệm thức: bảy nghiệm thức.

-

Số đơn vị thí nghiệm: 21

 Chỉ tiêu theo dõi:
-

Mật số của vi khuẩn.

 Các bước thực hiện:
 Chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng.


Dùng giấy bạc đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.

 Chủng vào bình tam giác 2,5ml dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn, ủ trên máy
lắc (120 rpm) với nhiệt độ 37ºC.
 Mỗi ngày rút 1ml trong mỗi bình tiến hành pha loãng đếm mật số vi khuẩn.
Thực hiện liên tục đến ngày thứ bảy.
3.3.4. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và
khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Chọn ra điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn B. cereus K13.
 Bố trí thí nghiệm:
-

Thí nghiệm được bố trí theo thừa số với hai nhân tố, năm mức pH ( 6, 7, 7,5, 8,
9) và bốn mức nhiệt độ ( 32ºC, 37ºC, 45ºC, 50ºC).

-

Số lần lặp lại: ba lần.

-

Tổng số nghiệm thức: 20 nghiệm thức.

-

Số đơn vị thí nghiệm: 60.

 Chỉ tiêu theo dõi:
-

Mật số của vi khuẩn.

-

Khả năng phân hủy bột lông.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 35 – 2013

Trường ĐHCT

 Các bước thực hiện:
 Chuẩn bị 15 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng. Lần
lượt điều chỉnh pH như bố trí thí nghiệm, mỗi mức pH có ba bình tam giác.
Dùng giấy bạc đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 20 phút.
 Chủng vào mỗi bình tam giác 2,5ml dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn
bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
 Mỗi nghiệm thức chuẩn bị một bình tam giác không chủng vi khuẩn để làm
mẫu đối chứng âm.
 Ủ trên máy lắc (120 rpm) với nhiệt độ 37ºC.
 Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.
 Sau chín ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm.
 Lặp lại thí nghiệm tương tự cho các mức nhiệt độ khác như bố trí thí nghiệm.
 Nghiệm thức có tỉ lệ phần trăm lông gia cầm bị phân hủy cao nhất được sử
dụng cho các thí nghiệm sau.
3.3.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa carbon
đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn
 Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát
triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn.
 Bố trí thí nghiệm:
-

Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ và pH tối ưu chọn ra từ thí nghiệm 2.

-

Các nghiệm thức lần lượt là bổ sung dịch rỉ đường, sucrose, glucose với nồng
độ 1% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng carbon.

-

Số lần lặp lại: ba lần.

-

Tổng số nghiệm thức: bốn nghiệm thức.

-

Số đơn vị thí nghiệm: 12 đơn vị thí nghiệm.

 Chỉ tiêu theo dõi:
-

Mật số của vi khuẩn.

-

Khả năng phân hủy lông gia cầm

 Các bước thực hiện:

 Chuẩn bị 9 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng; lần
lượt bổ sung vào các bình tam giác các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học