Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi trường chọn lọc thích hợp trong phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chuyên đề 3
Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi
trường chọn lọc thích hợp trong phân lập tác
nhân gây bệnh thối đen quả ca cao
Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước
Mã số: ĐTĐL.2011- G/63

Chủ trì đề tài: ThS. Nguyễn Hồng Tuyên

Hà nội, 2012


1. Đặt vấn đề
1.1. Tính cấp thiết của chuyên đề
Việt nam là một đất nước với hai vùng khí hậu khác biệt, vùng khí hậu cận nhiệt
đới thuộc phía Bắc của đèo Hải Vân với 4 mùa khác nhau rõ rệt, trong khi đó vùng khí
hậu nhiệt đới ở phía Nam chỉ có 2 mùa là mùa mưa và mùa khô. Những rặng núi ở
Miền Trung và Miền Bắc của Việt nam làm tăng thêm sự đa dạng của các vùng khí hậu
cho phép nhiều loài cây trồng khác nhau phát triển trên toàn quốc. Vùng khí hậu cận
nhiệt đới của phía Bắc tiếp giáp với các dãy núi cho phép sự tăng trưởng và phát triển
của cây trồng nhiệt đới và ôn đới ở các vùng lân cận. Các vùng khác nhau của Việt
Nam cũng đem lại nền khí hậu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các loài
Phytophthora, nấm Phytophthora là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế lớn cho rất nhiều
loại cây trồng khác nhau trên toàn quốc. Bệnh do Phytophthora được báo cáo là nguyên

nhân gây bệnh cháy lá, sùi thân, thối nõn, thối quả và thối rễ trên nhiều loại cây trồng
như cây ăn quả, rau, cây lấy gỗ và cây trồng nông nghiệp khác, gây sự giảm lớn về
năng suất và thiệt hại kinh tế đáng kể. Bệnh sương mai cà chua và khoai tây do nấm
Phytophthora infestans gây ra là bệnh chính của những cây trồng này ở vùng đồng bằng
sông Hồng. Tất các giống cà chua bị nhiễm bệnh này đều dẫn đến giảm 30% - 70%
năng suất.
Các nhà khoa học của Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn trong phân lập các bệnh
do nấm Phytophthora gây nên vì Phytophthora dễ bị cạnh tranh bởi nhiều loại nấm
khác trên mô bệnh và đặc điểm trên môi trường nhân tạo nấm Phytophthora mọc chậm
hơn so với các loại nấm khác, mà các hoá chất sử dụng cho môi trường chọn lọc khó
tìm để mua. Việc nghiên cứu sử dụng mồi bẫy và các môi trường thông dụng trong đó
có cho thêm chất kháng sinh, cũng như một số thuốc diệt nấm khác cạnh tranh trên môi
trường phân lập làm tăng khả năng phân lập đối với nấm Phytophthora. Tuy nhiên mỗi
loài nấm Phytophthora đều có đặc điểm riêng nên ở mỗi loài có phương pháp phân lập
khác nhau. Việc phân lập thành công sẽ tạo nguồn gen để nghiên cứu đặc điểm sinh
học, sinh thái và các nghiên cứu cơ bản khác đối với nấm Phytophthora từ đó làm cơ sở
cho nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả. Vì vậy, chúng tôi xin được
thực hiện chuyên đề: “Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi trường chọn lọc
thích hợp trong phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao”.


1.2. Tổng quan tài liệu trong, ngoài nước
1.2.1. Hoá chất chọn lọc được dùng trong môi trường phân lập
Một trong những nguyên lý cơ bản của sự phân lập chọn lọc là sử dụng một hoặc
nhiều hoá chất trong môi trường để ngăn cản sự phát triển của cả nấm và vi khuẩn tạp
nhiễm nhưng ít hoặc không ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm Phytophthora.
Trước năm 1960, các loại hoá chất chọn lọc khác nhau dùng trong môi trường
phân lập có rất ít để lựa chọn. Axít hoá một môi trường PDA có độ pH 4 với 25% axit
lactic (khoảng 3 giọt trên một đĩa môi trường) để diệt sự phát triển của vi khuẩn là
phương pháp thích hợp cho sự phân lập của nhiều loại nấm nhưng thường không có

hiệu quả để phân lập chọn lọc hầu hết các loại nấm Phytophthora, vì sự nảy mầm của
bào tử thường kém ở giá trị pH thấp. Môi trường không có kháng sinh chọn lọc như
môi trường nước agar (WA) là môi trường sử dụng có hiệu quả nhất để hạn chế sự phát
triển của vi khuẩn. Sử dụng một tế bào Van Tiegham, tế bào này buộc sợi nấm
Phytophthora mọc dưới bề mặt của agar, hướng tới giải phóng sợi nấm khỏi vi khuẩn
bởi vì vi khuẩn không thể phát triển nhanh khi chìm ngập sâu.
Trước năm 1960, phương pháp phân lập nấm Phytophthora bằng sử dụng vật
liệu bẫy (Các mô cây dễ nhiễm bệnh) để bẫy nấm từ mô cây bệnh hoặc từ đất trên môi
trường nước agar (WA) hoặc môi trường agar yếu còn hạn chế. Những sáng kiến mới
đem lại khi Eckert, J.W. đã thực hiện thử nghiệm liên tục hợp nhất nhiều loại hoá chất
chống lại nhiều hoặc một vài loại nấm khác. Ông ấy đã ghi nhận trên môi trường cho
những kháng sinh hiện có thì những loài Phytophthora và Pythium mọc tốt, ngược lại
một vài loại nấm đất khác không mọc.
1.2.1.1. Pimaricin
Việc khám phá ra những kháng sinh đặc hiệu có thể kháng được nhiều loại nấm
khác như: pimaricin, nystatin đã làm thay đổi trong phương pháp phân lập nấm
Phytophthora và khuyến khích nghiên cứu trên toàn thế giới về những môi trường chọn
lọc để phân lập nấm Phytophthora loại bỏ sự phát triển của vi khuẩn và các loại nấm
khác. Môi trường của Eckert và Tsao sử dụng là những môi trường nghèo dinh dưỡng
như: bột ngô agar (cornmeal agar) kết hợp với pimaricin (chất kháng nấm ) lượng
(100µg/ ml) và penicillin lượng (50µg/ml) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram
dương và polymyxin lượng (50µg/ml) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram âm.
Thông thường được gọi là môi trường 3P nhưng chỉ phân lập được đối với các mô bệnh
mới nhiễm, còn không phân lập được nấm từ đất và mô bệnh đã cũ. Còn có một vài tài
liệu cho rằng môi trường 3P không phải là môi trường chọn lọc vì với lượng pimaricin
(100µg/ ml) ức chế sự nảy mầm của bào tử.
Haas, 1964 đã phát hiện đầu tiên sử dụng môi trường với liều lượng pimaricin
thấp (2µg/ ml) có thể phân lập được nấm P. sojae (P. megasperma var. sojae) từ đất.
Tiếp theo báo cáo của Tsao, 1983 đã chỉ ra pimaricin 10 µg/ ml cho phép bào tử của
một vài loại nấm Phytophthora từ mẫu đất nảy mầm, ngược lại dùng với lượng

pimaricin cao 100 µg/ml sẽ ngăn cản bào tử nảy mầm. Theo Larkin et al., 1995 tỷ lệ
nảy mầm hậu bào tử của nấm P. parasitica và bào tử nang của P. palmivora trên môi
trường bột ngô agar kết hợp với pimaricin với các liều lượng 1,5 ; 3; 6 và 12 µg/ml thì


cao hơn trên môi trường bột ngô agar không kết hợp với pimaricin. Ở liều lượng 25 , 50
và 600 µg/ml giảm tỷ lệ nảy mầm 20 – 30% so với đối chứng. Trong điều kiện các mô
cây bệnh còn rất mới, ở liều lượng pimaricin lớn hơn 10µg/ ml sợi nấm không bị ức chế
phát triển. Các mô cây bệnh đã cũ hoặc nguồn từ đất, các nguồn này chủ yếu tồn tại
dưới dạng bào tử nang, bào tử hậu, du động bào tử, liều lượng pimaricin dùng để phân
lập phải thấp hơn hoặc bằng 10 µg/ml. Nhiều báo cáo cho rằng ở liều lượng 5 µg/ml thì
hiệu quả hơn 10 µg/ml.
1.2.1.2. Nystatin
Mặc dù pimaricin là kháng sinh chọn lọc, nystatin cũng là một kháng sinh đặc
hiệu, có hoạt động tương tự pimaricin nhưng kém hiệu quả hơn và có phạm vi hoạt
động hẹp (Tsao, 1983). Nystatin được sử dụng thay thế pimaricin trên một vài môi
trường, đặc biệt một vài khu vực trên thế giới nơi mà pimaricin không có sẵn. Cả hai
loại kháng sinh pimaricin và nystatin không hoạt động dưới ánh sáng vì vậy đĩa môi
trường phải được đặt trong điều kiện tối (Ploetz and Parrado, 1988).
1.2.1.3. PCNB (100 µg/ ml)
PCNB là một thuốc trừ nấm đất với độ tan trong nước thấp, được kết hợp với
môi trường của Tsao (Tsao và Ocana, 1969) vì nó là thuốc diệt được nhiều loại nấm
nhưng không diệt Phytophthora và Pythium. Đặc biệt PCNB được dùng để sử lý hạt
chống lại Rhizoctonia và như là môi trường chọn lọc để phân lập nấm Fusarium (Kerr,
1963). PCNB khử được sự phát triển của nhiều loại nấm nhưng không diệt
Phytophthora và Pythium. Ví dụ PCNB có hiệu quả cao trong phân lập nấm P.
parasitica var. nicotianae và P. cinnamomi từ đất (Jeffers và Martin, 1986).
1.2.1.4. Benomyl là một thuốc trừ nấm (Tên thương phẩm như là Benlat) có khả năng
thấm sâu và di chuyển lên trên cây, thường được sử dụng thay thế hoặc bổ sung cho
pimaricin, ở liều lượng 10 - 25 µg/ml (Follin, 1971; Schmitthenner, 1973; Papavizas et

al., 1981; George và Miholland, 1986b). Nó có thể khử được nhiều loại nấm đất (nhưng
không diệt Phytophthora). Nó có phổ hẹp hơn so với pimaricin. Ở liều lượng benomyl
10µg/ml bị ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm P. fragariae nhưng bị ức chế
mạnh ở liều lượng 100 µg/ml. Môi trường nước quả V8 kết hợp với benomyl có thể
phân lập được nấm P. cactorum nhờ ngăn cản các vi sinh vật khác (Harris và Bielenin,
1986). Benomyl là thuốc trừ nấm chọn lọc có khả năng diệt được nhiều loại nấm nhưng
không diệt được các loại nấm thuộc zygomycetes (Ví dụ như: Mortierella, Mucor,
Rhizopus) hoặc những loại của họ Porosporae thuộc nấm bất toàn như: Alternaria,
Bipolaris, Drechslera, Stemphylium hoặc một số loại khác (Bollen và Fuchs, 1970;
Edgington et al., 1971). Nó thì không kháng khuẩn. Benomyl ít hòa tan trong nước, nó
có thuận lợi không bị phân huỷ hoặc mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao, vì vậy
có thể cho cùng vào môi trường để hấp dưới dạng bột thấm nước hoặc trong dung dịch
bột thấm nước(Masago et al., 1977).
1.2.1.5. Iprodione là thuốc trừ nấm – ergosterol (C28H440), ở liều lượng 100 và 400
µg/ml có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Pythium proliferum, nấm này không
nhạy cảm với chất hymexazol, một thuốc trừ nấm tương đối độc với các loài Pythium


nhưng ít độc với các loài Phytophthora. Ví dụ: khi môi trường P10VPH hoặc P10 ARPH
(H là hymexazol liều lượng 50 µg/ml , R là rifampicin liều lượng 10 µg/ml và A là
ampicillin liều lượng 250 µg/ml) được cộng với iprodione sẽ làm tăng tỷ lệ phân lập
nấm P. cinnamomi từ cây bơ con bị bệnh (Solel và Pinká, 1984). Tuy nhiên ipodione sử
dụng không hiệu quả để phân lập một số loại nấm Phytophthora khác.
1.2.1.6. Vancomycin là môi trường chọn lọc (P 10VP) của Tsao và Ocana, 1969 được
thay thế cho polymyxin và penicillin vì phổ hoạt động của nó rộng có thể chống lại
được cả hai loại vi khuẩn nhuộm gram dương và gram âm. Môi trường đã được khử
trùng và làm nguội ở nhiệt độ 45 – 480C trước khi hoà lẫn hoá chất vào trong và đổ ra
đĩa sạch, vì nhiều loại kháng sinh bị hỏng khi hấp ở nhiệt độ 1210C.
1.2.1.7. Axít Gallic (425µg/ml) làm giảm kích thước khuẩn lạc của những nấm không
thuộc Pythiaceous mọc nhanh trên môi trường và được sử dụng để phân lập

Phytophthora (Flowers và Hendrix, 1969). Axít Gallic không ức chế sự nảy mầm của
du động bào tử nấm P. fragariae (George và Milholland, 1986b). Tuy nhiên axit Gallic
không được sử dụng rộng rãi và lâu dài (Tsao, 1983) khi mà trên thị trường có sẵn
P10VP (Tsao và Ocana, 1969) và P10 ARP (Kannwischer and Mitchell, 1978).
1.2.1.8. Một số chất kháng sinh (ampicillin, penicillin, rifampicin)
Sự lựa chọn kháng sinh thích hợp và liều lượng dùng là quan trọng trong sự
phân lập có chọn lọc. Tsao, 1983 đã đưa ra hầu hết các kháng sinh kháng khuẩn đều
phù hợp cho phân lập các loài Phytophthora như: ampicillin, penicillin, rifampicin
(hoạt động khống chế vi khuẩn gram âm) và vancomycin (hoạt động diệt cả vi khuẩn
gram dương và gram âm). Theo báo cáo đầu tiên của Masago et al., 1977 sử dụng
rifampicin (10 µg/ml) kết hợp ampicillin (500 µg/ml). Kannwischer và Mitchell (1978)
thay thế vancomycin trong môi trường của Tsao và Ocana (1969) bằng rifampicin
(10µg/ml) và ampicillin (250µg/ml) cho sự phân lập nấm P. parasitica var. nicotianae
từ đất. Jeffers và Martin, 1986; Pittis và Colhoun, 1984 trích dẫn rifampicin và
ampicillin hơn hẳn vancomycin. Việc có nên hoặc không nên thay thế vancomycin
bằng rifampicin và ampicillin là tốt nhất để phân lập tất cả Phytophthora từ đất vẫn còn
là câu hỏi có nhiều tranh cãi. Trong một vài nguồn từ đất thì vancomycin có hiệu quả
hơn (P.H. Tsao, unpublished). Rifampicin và ampicillin thì giá rẻ hơn vancomycin
(Jeffers và Martin, 1986).
Nghiên cứu tổng hợp của Jeffers và Martin, 1986 về ảnh hưởng của môi trường
bột ngô agar bổ sung với các kháng sinh khác nhau cho sự phân lập và phát triển của
một vài loài nấm Phytophthora từ nguồn đất trên đồng ruộng đã chỉ ra giảm liều lượng
pimaricin từ 10 xuống 5 µg/ml, cộng với hymexazol 50µg/ml và thay thế vancomycin
bằng ampicillin (250µg/ml ) và rifampicin (10µg/ml) đã tăng số lượng đơn vị khuẩn lạc
(cfu) của P. cinnamomi 8 lần và P. parasitica var.nicotianae 2,9 lần. Sự kết hợp
ampicillin và rifampicin thay thế cho vancomycin (200µg/ml) đã giảm số lượng khuẩn
lạc vi khuẩn tạp nhiễm từ 43 xuống 0 khi phân lập nguồn bệnh từ đất vườn quả.
Rifampicin (10µg/ml) giảm khoảng một nửa sự nảy mầm của du động bào tử và
sự phát triển của ống mầm nấm Phytophthora, nhưng là hợp chất ngăn cản hoàn toàn sự
tạp nhiễm của vi khuẩn (George và Milholland, 1986b).

Phân lập nấm P. infestans từ mô cây bệnh, đặc biệt là mô bệnh đã cũ luôn luôn
gặp khó khăn. Hohl (1991a) đã báo cáo có thể phân lập nấm P. infestans từ mô cây
bệnh trên môi trường lúa mạch đen (pH 5.5) chứa griseofulvin (20 µg/ml), nystatin (19
µg/ml), benlate (10µg/ml), methoxypurine (5µg/ml), penicillin G (48µg/ml), nalidixic
acid (5µg/ml), neomycine (30µg/ml) và 8-azoguanine (40 µg/ml) (Hohl 1991a). Môi
trường nuôi cấy này cho phép tỷ lệ mọc của 6 isolate nấm P.infestans là 42 -56% (So
sánh với môi trường lúa mạch đen không có kháng sinh) nhưng không mọc Mucor
mucedo, Trichoderma viridans, Trichoderma alba, Fusarium spp, Acremonium,
Byssochlamys nivea và các loài Pythium. Drenth et al. (1995) sử dụng môi trường lúa
mạch đen chứa ampicillin (200 µg/ml), fenpliclonil (10µg/ml), pimaricin (10 µg/ml) và
rifampicin (30 µg/ml).
1.2.1.9. Rose bengal (60µg/ml) được sử dụng trong môi trường phân lập để hạn chế sự
phát triển của vi khuẩn (Hendrix và Kuhlman, 1965). Mặc dù hỗn hợp này là chất
kháng khuẩn, nó cũng gây độc cho sự nảy mầm của bào tử nấm Phytophthora. Rose
bengal đặc biệt ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Phytophthora khi sử dụng kết hợp
với streptomycin. Theo Papavizas et al. (1981) độ độc của rose bengal lớn hơn khi sử
dụng kết hợp với benomyl hoặc hymexazol. Rose bengal có lợi thế sử dụng hơn so với
những chất kháng sinh có sẵn như: ampicillin, rifampicin và vancomycin (Donald
C.Erwin và Olaf K.Ribeiro, 1996).
Mặc dù các chất kháng sinh streptomycin, chlortetracycline, oxytetracycline,
tetracycline, neomycin và chloramphenicol thông thường được sử dụng trong nhiều môi
trường chọn lọc để phân lập nhiều loại nấm, chúng lại thường kìm hãm sự phát triển
của nhiều loại nấm Phytophthora hơn nhiều so với các loại nấm thích hợp nhất được đề
cập ở trên (Dhingra và Sinclair, 1985).
1.2.1.10. Streptomycin là kháng sinh phổ rộng kìm hãm sự phát triển của cả vi khuẩn
nhuộm gram âm và gram dương, nhưng nó gây độc hầu hết các loại nấm Phytophthora
(Tsao, 1983), vì vậy nó không là sự lựa chọn tốt cho môi trường chọn lọc. Streptomycin
kìm hãm phát triển của nấm P. trophthora và P. heveae nhưng chỉ kìm hãm một chút

đối với nấm P. capsici, P. cinnamomi và P. parasitica (Eckert và Tsao, 1962).
Streptomycin kìm hãm hoàn toàn sự phát triển của nấm P. infestans (Ersek, 1975) và
một vài loài nấm Phytophthora khác (Cohen và Perl, 1973). Streptomycin ở liều lượng
10 – 50 µg/ml trong môi trường dung dịch hạt lúa mì, hoàn toàn ức chế sự phát triển
của nấm P. infestans, tuy nhiên môi trường đó để sau 4 ngày mới sử dụng, sự mọc chỉ
giảm một nửa. Khi streptomycin được cộng vào để lây nhiễm bào tử nang hoặc du động
bào tử, nó sẽ ngăn cản sự hình thành vết bệnh trên lá khoai tây nhưng không tác động
sau khi đã xuất hiện sự nhiễm bệnh.
Streptomycin sẽ được sử dụng với sự thận trọng trong môi trường phân lập
(Cohen và Perl, 1973). Sợi nấm Phytophthora và nhiều thành viên khác của Oomycetes
bắt giữ streptomycin nhanh hơn các loại nấm khác. Sự hấp thu lớn hơn 2 - 9 lần ở
những loài nấm Phytophthora và Pythium hơn các thành viên của Mucorales,
Cuninghamella echinulata. Điều này là kết quả của hoạt động hấp thu của vách tế bào
không kitin trong Phytophthora (Voros, 1965).


1.2.1.11. Chloramphenicol
Mặc dù Chloramphenicol được báo cáo có hiệu quả trong một số môi trường,
nhưng có thể gây độc cho sự phát triển sợi của nhiều loài nấm Phytophthora (Tsao,
1983). Vì vậy, nó không là lựa chọn thích hợp cho môi trường chọn lọc.
Chloramphenicol ở liều lượng 1µg/ml trong môi trường nhân tạo làm giảm sự phát
triển của 28 isolate của nấm P. cinnamomi 11 – 75% so với đối chứng không có
chloramphenicol. Sự phát triển tia của 4 isolate đã bị ức chế hoàn toàn ở liều lượng 25
µg/ml và bị ức chế 70 – 80% ở 5 µg/ml (Leary et al. 1982). Tuy nhiên, một số báo cáo
lại cho thấy chloramphenical ở 10 µg/ml (Shew và Benson, 1982) hoặc ở 30 µg/ml
(Sneh và Katz, 1988) có chức năng như là môi trường chọn lọc có hiệu quả. Hollomon
(1965) sử dụng chloroamphenicol (50 µg/ml ) để phân lập nấm P. infestans từ lá khoai
tây. Rahimian và Mitchell (1988) đã sử dụng chloramphenicol để phân lập P. cactorum
từ đất. Theo báo cáo của Ersek (1975), chloramphenicol ở 100, 200 và 400 µg/ml làm
tăng độc tính đối với sự phát triển của sợi nấm nhưng không độc với sự nảy mầm của

bào tử nang hoặc du động bào tử của nấm P. infestans trên cả hai môi trường và lát
mỏng khoai tây.
1.2.1.12. Hymexazol ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm Pythium, những loài nấm
này tồn tại trong đất và vùng xung quanh rễ của hầu hết các cây. Chúng thường hạn chế
sự nảy mầm và gây chết cây con, trong một vài trường hợp gây chết cây trưởng thành.
Hợp chất kháng nấm pimaricin hoặc benomyl sử dụng trong môi trường phân lập nấm
Phytophthora đều không có khả năng ức chế được nấm Pythium, trong khi đó nấm
Pythium cũng là trở ngại lớn trong quá trình phân lập Phytophthora do khả năng mọc
của chúng trên môi trường nhanh hơn các loài Phytophthora. Kết quả, các khuẩn lạc
Phytophthora có thể bị mọc chùm lên và mờ bởi Pythium. Năm 1977, thuốc trừ nấm
hymexazol được thương mại hoá ở Tachigaren, được xác định có nhiều độc tính đối với
nhiều loài Pythium hơn một vài loài Phytophthora (Masago et al.1977).
Mặc dù hymexazol là hoá chất chọn lọc có hiệu quả cho sự phân lập của một số
loài Phytophthora, nó vẫn có độc tính cao với một số loài Phytophthora nhất định và
ngược lại không kìm hãm tất cả các loài Pythium. Ví dụ, hymexazol không ức chế được
sự phát triển của nấm Pythium proliferum (Solel và Pinkas, 1984) hoặc Pythium vexans
(Tsao và Guy, 1977). Chỉ có 6 trong 12 loại Pythium phân lập từ đất cây rừng là bị kìm
hãm bởi hymexazol (E.M.Hansen et al., 1979). E.M.Hansen et al., 1979 tiếp tục nghiên
cứu sử dụng hymexazol để phân lập từ đất rừng, kết quả cho thấy nó cũng kìm hãm sự
phát triển của nấm Phytophthora lateralis và Phytophthora cactorum và một số nấm
khác không phải là Phytophthora.
Hymexazol kìm hãm rất mạnh đối với sự phát triển của nấm P. infestans, P.
phaseoli, P. porri, P. syringae, làm chậm sự phát triển của nấm P. hibernalis và P.
lateralis, nhưng nhẹ đối với sự mọc của P. fragariae và P. ilicis và kìm hãm không
nhiều đối với nấm P. cactorum và P. pseudotsugae (Ho, 1987).


1.2.2. Một số môi trường đặc hiệu để phân lập nấm Phytophthora
1.2.2.1. Môi trường 3-P Medium
Môi trường Agar bột ngô (17g/lít) được hấp ở 121 0C và để nguội khoảng 450C

bổ sung với pimaricin (100ppm), penicillin (50ppm) và polymyxin (50 ppm). Đĩa được
bảo quản lạnh trong điều kiện tối vì pimaricin rất nhậy cảm với ánh sáng. Đây là môi
trường chọn lọc đầu tiên sử dụng pimaricin kháng nấm và có hiệu quả trong phân lập
mô cây bệnh còn mới chứa các loài Phytophthora tồn tại ở dạng sợi nấm, nhưng không
từ mẫu đất bệnh mới chứa nấm Phytophthora tồn tại ở dạng bào tử. Sử dụng pimaricin
(100ppm) ở liều lượng cao ức chế bào tử nảy mầm (Tsao, 1983).
1.2.2.2. Môi trường P10VP (Tsao và Ocana, 1969)
Môi trường Agar bột ngô (17g/lít) được hấp ở 121 0C và để nguội khoảng 450C
bổ sung với liều lượng thấp pimaricin (10ppm), vancomycin (200ppm) và
pentacholoronitrobenzene (100ppm) đĩa được giữ trong tối vì Pimaricin nhậy cảm với
ánh sáng. Môi trường này có hiệu quả phân lập mô bệnh từ đất và mô cây vì giảm liều
lượng pimaricin không ức chế sự nảy mầm của bào tử. Hymexazol (25-50mg/lit) được
cho vào sau khi hấp để diệt một vài loài Pythium (Masago et al.,1977; Tsao và Guy,
1977).
1.2.2.3. Môi trường sử dụng Hymexazol để phân lập Phytophthora loại bỏ Pythium
(Masago et al.,1977)
Môi trường PDA (1%agar) được cộng thêm benomyl (10ppm),
pentachloronitrobenzene (25ppm), nystatin (25ppm), ampicillin (500ppm), rifampicin
(10ppm), hymexazol (25-50 ppm). Hymexazol khử nhiều loài những không phải tất cả
các loài Pythium. Nhiều loài Pythium có khả năng kháng, nhưng một vài loài rất nhậy
cảm khi phân lập trên môt trường chứa hymexazol. Môi trường bột ngô hoặc V8 thì tốt
hơn môi trường PDA.
1.2.2.4. Môi trường P10ARP (Kannwischer và Mitchell, 1978) và P5ARP (Papavizas
et al., 1981; Jeffers và Martin, 1986)
Môi trường bột ngô sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ hạ xuống 45 0C được cộng
thêm với pimaricin (10ppm), ampicillin (250ppm), rifampicin (10ppm) và
pentachloronitrobenzene (100ppm). Jeffers và Martin (1986) đã sử đổi Môi trường
P10ARP bằng giảm pimaricin từ 10 ppm xuống 5 ppm để phân lập P. cactorum
(P5ARP). Thêm rifampicin để khử vi khuẩn gram dương trên môi trường chọn lọc
P10ARP và P5ARP để phân lập hầu hết các loài Phytophthora. Hymexazol có thể được

cộng 25 – 50 ppm sau khi hấp khử trùng để khử một vài loài Pythium (Masago et
al.,1977; Tsao và Guy, 1977) mà không ảnh hưởng đến các loài Phytophthora mục tiêu.
1.2.2.5. Môi trường sử dụng Benomyl (Sneh và Katz, 1988)
Benomyl diệt được nhiều loại nấm (Sneh, 1972a; McIntosh, 1975). Bổ sung
thành môi trường chọn lọc tổng hợp gồm: benomyl (25ppm), pentachloronitrobenzene
(30ppm), penicillin (60ppm), chloramphenicol (30ppm), penicillin (60ppm), polymyxin


(50ppm) và hymexazol (25ppm) để phân lập P. nicotianae và P. citrophthora từ đất cây
có múi. Chloramphenicol và polymyxin không là kháng sinh thích hợp.
George và Milholland (1986b), bổ sung vào môi trường đậu hà lan gồm benomyl
(10ppm), pimaricin (10ppm), rifampicin (10ppm) và hymexazol (50ppm) để phân lập
P. fragariae từ mô cây.
Papavizas et al. (1981), bổ sung vào môi trường bột ngô (Chuẩn pH 4.0) gồm
benomyl (25ppm), pimaricin (5ppm), vancomycin (200ppm), penicillin (100ppm),
pentachloronitrobenzene (100ppm) và hymexazol (20ppm) để phân lập P. capsici từ
đất.
1.2.2.6. Môi trường sử dụng Chloramphenicol
PBNC (Rahimian và Mitchell, 1988), môi trường nước quả V8 yếu (40ml/lít)
được đệm với CaCO3 (0,6g/lít) và bổ sung với yeast extract (0,2 g/lít), Sucrose (1,0
g/lít), cholesterol (0,01 trong 2 ml) N, N-dimethylformamide và agar (20g/lít) cộng
thêm benlate (50% benomyl) (20µg/ml), pentachloronitrobenzene (27µg/ml), neomycin
sulfate (100µg/ml) và chloramphenicol (10µg/ml) được dùng để phân lập một vài loài
Phytophthora. Chloramphenicol và neomycin có thể độc với một số loài Phytophthora,
còn có hiệu quả để phân lập hầu hết các loài Phytophthora.
Môi trường PCH (Shew và Benson, 1982), là một môi trường tổng hợp gồm
(g/lít) KH2PO4 (1,0g/lít), MgSO4 .7H2O (0,5g/lít), KCl (0,5g/lít), CaCl2 .H2O (0,01g/lít),
FeSO4 .H2O (0,02g/lít), thiamine-HCl (0,001g/lít), yeast extract (0,3g/lít), NaNO3
(1,0g/lít), glucose (15,0g/lít), pentachloronitrobenzene (35,0g/lít), chloramphenicol
(0,01 trong 2 ml của ethanol) và hymexazol (50,0g/lít), sử dụng để phân lập P.

cinnamomi.
1.2.3. Một số phương pháp phân lập sử dụng mồi bẫy nấm Phytophthora bằng sử
dụng các loại mồi bẫy khác nhau: lá cây ký chủ, vỏ quả…
Hầu hết các loài Phytophthora thường khó phân lập từ các mô đã bị thối rữa
hoặc từ đất, vì thế phương pháp bẫy được sử dụng trong gần nửa thế kỷ để hỗ trợ cho
việc phân lập.
Về nguyên tắc phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài
Phytophthora đối với mô ký chủ còn sống, các cây ký chủ này sẽ được coi là môi
trường chọn lọc, vết bệnh do nấm Phytophthora gây ra sẽ được phân lập trên môi
trường nhân tạo chọn lọc. Đặc điểm vết bệnh trên quả táo do nấm Phytophthora gây
nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, còn những vết hoại do Pythium và vi khuẩn gây nên
thường thối mềm, nhũn. Một số cây ký chủ được sử dụng để bẫy nấm Phytophthora:
quả táo, quả ca cao xanh, quả lê, quả bơ, quả chanh, cánh hoa cẩm chướng, lá thông,
mẩu lá đậu tương, cây đậu lupin ...
Kỹ thuật bẫy lợi dụng sự gây bệnh của những loài nấm Phytophthora trên cây ký
chủ hoặc mô cây ký chủ, sự sản sinh nhanh bào tử nang hoặc du động bào tử trong đất
hoặc trong mô cây bệnh, các du động bào tử sẽ bơi hướng tới nguồn dinh dưỡng như là
rễ hoặc mô cây. Du động bào tử sẽ di chuyển bám dính vào một vị trí hấp dẫn hoặc vị
trí đặc biệt trước khi chúng bọc bào nang. Khả năng bám dính lên trên bề mặt là đặc


điểm đặc trưng của nấm Phytophthora. Nấm Phytophthora phát triển nhanh trên mồi
bẫy và giúp tăng hiệu quả phân lập (Erwin, D.C. and Riberrio O.K,1996).
Phân tích nấm Phytophthora từ đất bệnh bằng cách pha loãng trong bình thuỷ
tinh hoặc cốc nhựa, sử dụng mồi bẫy là cây ký chủ, các loại quả được lát mỏng như tờ
giấy thả lên trên mặt nước. Tỷ lệ nước pha loãng đất lớn gấp 4 lần, mục đích để pha
loãng các tạp chất có trong đất như: phân bón, thuốc sinh học…những chất này có thể
gây độc cho nấm Phytophthora. Sử dụng 1/3 – 1/2 mồi bẫy được thả nổi trên mặt nước
vì đặc điểm của du động bào tử là bơi lên và cư trú trên bề mặt nước (Carlile, 1983).
Sau khi lưu giữ vài ngày, mồi bẫy thả nổi trên mặt nước thường biến màu nâu. Khử

trùng bề mặt mồi bẫy bằng chất tẩy hypochlorite natri hoặc 70% ethanol, cắt rìa mô bị
bệnh đặt trên môi trường chọn lọc hoặc nếu không có sẵn môi trường chọn lọc thì đặt
trên môi trường WA. Mặc dù phương pháp sử dụng mồi bẫy bằng mẩu quả hoặc lá cây
ký chủ đã được sử dụng rộng rãi, những báo cáo gần đây chỉ ra rằng sử dụng mồi bẫy
nấm P.parasitica bằng những cây con hoặc lá mầm cây táo thì có hiệu quả cao hơn so
với quả táo và quả lê (Jeffers và Aldwinckle, 1987).
Mặc dù nước tự do thích hợp cho sự hình thành bào tử nang, nhưng thiếu sự
thông khí trong nước làm hạn chế sự hình thành bào tử nang (Duniway, 1975).
Duniway đã đề xuất sự phân lập nấm Phytophthora từ dung dịch đất bệnh bằng sử dụng
mồi bẫy là các mô cây phải được thả nổi trên mặt nước, vì nếu mồi bẫy bị ngập trong
nước sẽ hạn chế sự hình thành bào tử nang và du động bào tử, mẫu đất có độ ẩm cao
hơn mức trung bình trước khi cho ngập nước trong cốc có thể làm tăng sự phân lập nấm
Phytophthora bằng phương pháp bẫy.
P.sojae sản sinh bào tử nang và du động bào tử sau khi đất thu về hong khô
trong không khí, được làm ẩm trở lại và đặt ở nhiệt độ phòng 1 – 2 tuần, cuối cùng đổ
ngập nước ít nhất 1 giờ. Phương pháp này làm tăng sự sản sinh các bào tử nang trong
đất ẩm và sau đó phân lập mẩu lá đậu tương được thả bẫy trong dung dịch đất. Khi mẩu
lá được thả nổi trên dung dịch đất trong khoảng thời gian ngắn (Khoảng 1 giờ) thì tỷ lệ
phân lập được nấm P.Sojae thường xuyên hơn so với loài Pythium, những nếu thả mồi
bẫy (mẩu lá đậu) lâu hơn trong dung dịch đất thì các loài Pythium cũng được tìm thấy
trên lá mồi bẫy (Canaday và Schmitthenner, 1982). Hầu hết các báo cáo khác đều
khuyến cáo đặt mẩu lá trong nước trong khoảng thời gian dài hơn (24 đến 48 giờ) trước
khi chuyển chúng lên môi trường đặc hiệu. Miếng lá cây bạch đàn được đặt trong dung
dịch đất 24 giờ trước khi chuyển chúng lên môi trường đặc hiệu để phân lập
P.cinnamomi (Erwin, D.C. and Riberrio O.K, 1996).
1.2.4. Phân lập nấm Phytophthora từ mô cây
Chuẩn bị cẩn thận giúp cho việc phân lập nấm Phytophthora từ mô cây bị bệnh
thành công. Tuy vậy nếu sử dụng môi trường chọn lọc thì việc khử trùng bề mặt có thể
không cần thiết. Đặt rễ, thân hoặc lá đã rửa sạch (Không khử trùng bề mặt) vào trong
một hố nông chứa nước ao, dung dịch muối khoáng, nước triết đất hoặc nước đã khử

trùng để xác định rõ hoặc phát hiện nấm Phytophthora. Nếu bào tử nang xuất hiện sau
24 – 48 giờ, chuyển lên môi trường đặc hiệu. Mặc dù triệu chứng không luôn luôn
đáng tin cậy, hầu hết tất cả các mô bệnh trên quả, vỏ cây hoặc lá có màu nâu, nâu tía
hoặc đen, phụ thuộc vào độ rộng của sắc tố trên mô cây chủ. Mô bị nhiễm bệnh thường


rắn và không mềm. Mô bệnh mềm thường bị gây hại bởi các loài vi khuẩn, Rhizopus
hoặc Pythium.
Môi trường P10VP và P10ARP là hai môi trường hiệu quả nhất dùng để phân lập
trực tiếp nấm Phytophthora bằng phương pháp đặt mô cây lên đĩa môi trường. Đĩa chứa
các môi trường này cần phải được bảo quản và ủ trong bóng tối vì Pimaricin bị phân
huỷ dưới ánh sáng (Andre Drenth and Barbara Sendall, 2004).
2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại mồi bẫy khác nhau
- Khả năng ức chế của một số thuốc hoá học đối với nấm phụ sinh trong phân
lập nấm Phytophthora
- Khả năng ức chế của một số thuốc kháng khuẩn đối với vi khuẩn tạp nhiễm
trong phân lập nấm Phytophthora
2.2. Phương pháp thí nghiệm
2.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
* Nước agar (WA):
+ agar: 20g
+ Nước: 1 l
* Môi trường PSM
- Thành phần: + Cà rốt
20g
+ Khoai tây
20g
+ Agar

12g
+ Nước cất
1000ml
Và các hoá chất: Pimaricin(10ppm), Rifampicin(50ppm),
Hymexazol(50ppm)
- Cách nấu môi trường:
+ Đun khoai tây và cà rốt đến khi nhừ sau đó chiết lấy dịch nước, cho thạch vào
khuấy đều, đem hấp khử trùng. Sau khi hấp xong để môi trường nguội đến khoảng
55oC, cho dung dịch hoá chất sau vào
+ Pimaricin 0,4ml hoà vào hộp nhựa nhỏ chứa 6,7ml nước cất vô trùng, hộp nhựa
này cần được bọc kín( vì khi hoá chất này tiếp xúc với ánh sáng sẽ bị phân huỷ và
mất hiệu lực)
+ Rifampicin 0,05g hoà vào hộp nhựa chứa 6,7ml nước cất vô trùng
+ Hymexazol 0,05g hoà vào hộp nhựa chứa 6,7ml nước cất vô trùng
Sau khi đổ môi trường xong , giữ các đĩa môi trường trong điều kiện tối và để trong tủ
lạnh.
* Môi trường PDA(Potato Dextrose Agar)
- Thành phần: +Khoai tây
200g
+Đường Glucose
20g
+Agar
20g
+Nước cất
1000ml
Cách làm: khoai tây rửa sạch, thái mỏng, đem đun sôi trong 700 – 800ml nước trong
khoảng 20- 25 phút. Dùng vải màn lọc để loại bỏ cặn bã, sau đó cho đủ nước(1000ml).


Cho đủ lượng đường khuấy nhẹ cho tan, sau đó cho thạch vào khuấy đều bằng đũa thuỷ

tinh cho đến khi tan hết. Môi trường được cho vào bình tam giác hoặc lọ có bọc giấy
bạc đem hấp vô trùng ở nồi hấp1210C trong 30 phút. Để môi trường nguội 60-650C đem
rót vào đĩa petri (dầy 5mm)
* Môi trường CMA(Corn Meal Agar)
- Thành phần: +Bột ngô
30g
+Agar
17g
+Nước cất
1000ml
Cách làm như môi trường PDA.
* Môi trường PCA(Potato Carrot Agar)
- Thành phần: +Khoai tây
20g
+ Cà rốt
20g
+Agar
20g
+ Nước cất
1000ml
Cách làm như môi trường PDA
* Môi trường CA(Cà rốt Agar)
- Thành phần:
+ Cà rốt
+ Agar
+ Nước cất

200g
20g
1000ml

* Môi trường V8Juice- Agar
- Thành phần: + V8Juice
200ml
+ CaCO3
3g
+ Agar
15g
+ Nước cất
1000ml
Thành phần của V8juice trong lon 330 ml gồm nước cà chua cô đặc, hỗn hợp cô đặc cuả
các loại rau: cà rốt, rau diếp, mùi tây, cần tây, củ cải, ngũ cốc, muối, vi ta min C, các
hương liệu khác.
- Cách làm: cho 200ml V8Juice vào cốc(1000ml) sau đó cho thêm nước vào để
đủ 1000ml. Cho vào cốc 3g CaCO 3, sau đó khuấy bằng máy khuấy từ trong 10 phút.
Cho thạch vào khuấy đều cho tới khi tan hết. Môi trường được cho vào bình tam giác
hoặc lọ có bọc nút kín đem hấp vô trùng trong nồi hấp 121 0C trong thời gian 30 phút,
để môi trường nguội đến 60 –650C, đem rót vào đĩa petri.
2.2.2. Phương pháp phân lập Phytophthora trực tiếp từ mẫu cây bệnh
- Rửa mẫu bệnh dưới vòi nước
- Lựa chọn các mô bệnh điển hình, còn tươi, mới, bệnh nhẹ
- Cắt mô bệnh thành những miếng có kích thước 1x1cm. Miếng cắt phải có cả mô
bệnh và mô khoẻ. Khử trùng bề mặt bằng cồn 70 0 trong 15 - 20 giây, sau đó rửa sạch
bằng nước cất vô trùng
- Thấm khô miếng cắt bằng giấy thấm vô trùng, dùng dao đã khử trùng cắt vết bệnh
thành các miếng nhỏ 5x5mm


- Đặt các mảnh mô cây vào môi trường nghèo dinh dưỡng (WA, CA).
- Khi nấm đã phát triển dài ra, cách mô bệnh 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy

truyền sang môi trường thích hợp như PDA, CMA, CA
2.2.3. Phương pháp phân lập Phytophthora từ bộ phận của cây bị nhiễm bệnh bằng
sử dụng mồi bẫy vỏ quả (Một số loại quả như: đu đủ, cacao, táo, lê …thường phải
xanh)
+ Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ.
+ Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc 0,5% sodium hypochlorite khoảng
30 – 60 giây. Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng.
+ Cắt mô thành miếng nhỏ (< 5 mm).
+ Thanh trùng bề mặt quả trái cây, rạch quả và chèn mô bệnh đã thanh trùng
vào.
+ Bọc trái mồi bẫy vào trong túi ni lon để trong nhiệt độ phòng.
+ Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2, 3 ngày thấy vết thương biến màu nâu lan rộng
chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora
+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn
2.2.4. Ảnh hưởng của các loại mồi bẫy khác nhau đến khả năng phân lập
TT
1
2
3
4

Công thức thí nghiệm
Quả ca cao xanh
Quả táo tây
Quả đu đủ xanh
Quả lê xanh

2.2.5. Khả năng ức chế của một số thuốc hoá học đối với nấm phụ sinh trong phân
lập nấm Phytophthora
2.2.5.1. Khả năng ức chế của thuốc Ben lat 80WP

- Công thức thí nghiệm:
1
Ben lat 80WP liều lượng 40µg/ml
2
Ben lat 80WP liều lượng 30µg/ml
3
Ben lat 80WP liều lượng 20 µg/ml
4
Ben lat 80WP liều lượng 10µg/ml
5
MT V8 (không có thuốc)
- Phương pháp tiến hành: Môi trường V8 được nấu, để nguội môi trường khoảng 45 –
500C, cho thuốc Ben lat 80WP ở các liều lượng khác nhau vào môi trường, sau đó đổ ra
hộp petri. Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora đã được
cấy thuần truyền sang hộp petri.
- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập được
2.2.5.2. Khả năng ức chế của thuốc Tachigaren 30L (Hymexazol 30%)
- Công thức thí nghiệm:
1

Tachigaren 30L liều lượng 0.5 µl/ml


2
Tachigaren 30L liều lượng 0.4 µl/ml
3
Tachigaren 30L liều lượng 0.3 µl/ml
4
Tachigaren 30L liều lượng 0.2 µl/ml
5

MT V8(không có thuốc)
- Phương pháp tiến hành: Môi trường V8 được nấu, để nguội môi trường khoảng 45 –
500C, cho thuốc Tachigaren 30L ở các liều lượng khác nhau vào môi trường, sau đó đổ
ra hộp petri. Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora đã
được cấy thuần truyền sang hộp petri.
- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập được
2.2.6. Khả năng ức chế của một số thuốc kháng khuẩn đối với vi khuẩn tạp nhiễm
trong phân lập nấm Phytophthora
Thuốc kháng sinh RH (hoạt chất Rifampicin 150mg)
- Công thức thí nghiệm:
1
Thuốc RH liều lượng 50 µg/ml
2
Thuốc RH liều lượng 40 µg/ml
3
Thuốc RH liều lượng 30 µg/ml
4
Thuốc RH liều lượng 20 µg/ml
5
Thuốc RH liều lượng 10 µg/ml
6
Đối chứng (MT V8 không thuốc)
- Phương pháp tiến hành: Môi trường V8 được nấu, để nguội môi trường khoảng 45 –
500C, cho thuốc RH ở các liều lượng khác nhau vào môi trường, sau đó đổ ra hộp petri.
Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora đã được cấy thuần
truyền sang hộp petri.
- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập được
3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao
3.1.1. Ảnh hưởng của các loại mồi bẫy khác nhau đến khả năng phân lập

Nấm Phytophthora thường mọc chậm trên môi trường, do vậy dễ bị cạnh tranh
bởi các loài nấm khác. Khả năng phân lập trực tiếp từ mô bệnh rất khó thành công. Áp
dụng biện pháp dùng mồi bẫy để xác định được mẫu bệnh có xuất hiện nấm
Phytophthora và mồi bẫy sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để phân lập.
Nghiên cứu vật liệu bẫy thích hợp đối với nấm Phytophthora gây thối đen quả ca
cao, các loại mồi bẫy là quả ca cao xanh, quả đu đủ xanh, quả táo tây, quả lê xanh được
sử dụng trong thí nghiệm. Kết quả ghi nhận ở bảng 1.


Bảng 1. Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả năng phân lập nấm Phytophthora
gây thối đen quả ca cao (Viện BVTV - 2012)
TT

Vật liệu bẫy

Tỷ lệ mồi bẫy được nấm
Phytophthora(%)

Tỷ lệ mồi bẫy phân lập
được Phytophthora (%)

1

Quả ca cao xanh

78,0

26,0

2

Quả táo tây

24,0

10,0

3

Quả đu đủ xanh

22,0

8,0

4

Quả lê xanh

14,0

4,0

Sử dụng mồi bẫy quả ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp. cao nhất
là 78%, cho tỷ lệ phân lập cao nhất là 26%. Các loại quả khác cũng bẫy được nấm
Phytophthora sp. nhưng cho tỷ lệ thấp hơn nhiều.
Phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài Phytophthora đối với
mô ký chủ còn sống, các cây ký chủ này sẽ được coi là môi trường chọn lọc, vết bệnh
do nấm Phytophthora gây ra sẽ được phân lập trên môi trường nhân tạo chọn lọc. Đặc
điểm vết bệnh trên vật liệu bẫy (các loại quả) do nấm Phytophthora gây nên thường

rắn, cứng dễ nhận biết, còn những vết hoại do Pythium và vi khuẩn gây nên thường thối
mềm, nhũn.
3.1.2. Khả năng ức chế của một số thuốc hoá học đối với nấm phụ sinh trên mô
bệnh
a. Khả năng ức chế của thuốc Ben lat 80WP
Theo Papavizas et al. (1981); George và Miholland (1986b) cho thấy: Benomyl
là một thuốc trừ nấm có thể khử được nhiều loại nấm đất (nhưng không diệt
Phytophthora), tuy nhiên đối với các loài nấm Phytophthora khác nhau, các liều lượng
dùng có ảnh hưởng đến khả năng phát triển của chúng tùy theo từng loài.
Việc tìm hiểu nồng độ của thuốc là bao nhiêu cho phù hợp để vừa không ức chế
được sự phát triển của nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả cao cao, lại có hiệu
quả ức chế các loại nấm khác là rất quan trọng. Thuốc Benlat 80WP có hoạt chất
Benomyl 95% với 5 nồng độ khác nhau được sử dụng trong thí nghiệm. Trong các công
thức đều có sử dụng thuốc kháng sinh Rifampicin 30µg/ml trong môi trường V8.


Bảng 2. Ảnh hưởng của thuốc Benlat 80WP đến khả năng phân lập nấm
Phytophthora sp. gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện BVTV - 2012)
TT

1
2
3
4
5
6

Công thức thí nghiệm

Ben lat 80WP liều lượng

40µg/ml
Ben lat 80WP liều lượng
30µg/ml
Ben lat 80WP liều lượng 20
µg/ml
Ben lat 80WP liều lượng
10µg/ml
MT V8 (không có thuốc)
CV (%)

Tỷ lệ phân lập được (%)
Phytophthora
Fusarium sp.
Nấm khác
sp.
0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

45,0

40,0

20,0

40,0

15,0

53,3

31,7

0,0

68,3

31,7

28,7

18,8

16,3

Kết quả (bảng 2) cho thấy thuốc Ben lat 80WP có khả năng ức chế một số nấm
phụ sinh trên mô bệnh, đặc biệt là nấm Fusarium sp., tạo điều kiện cho nấm
Phytophthora có khả năng mọc trên môi trường cao hơn. Ben lat 80WP liều lượng
20µg/ml cho tỷ lệ phân lập đạt cao nhất là 40,0 %. Liều lượng Ben lat 80WP liều lượng
quá cao 30 – 40 µg/ml, thuốc ức chế sự phát triển của nấm Fusarium đồng thời cũng ức
chế sự phát triển của nấm Phytophthora. Ở liều lượng 10µg/ml có khả năng ức chế thấp
đối với nấm Fusarium, số lượng mẫu bị tạp nấm Fusarium nhiều, khả năng phân lập
được nấm Phytophthora thấp hơn chỉ đạt 15,0%. Trong điều kiện phân lập trực tiếp từ
mô cây bệnh có thể sử dụng thuốc Ben lat 80WP kết hợp với một số hoá chất khác sẽ

tăng hiệu quả phân lập cao hơn.
b. Khả năng ức chế của thuốc Tachigaren 30L (Hymexazol 30%)
Thuốc Tachigaren 30L (hoạt chất Hymexazol 30%) của công ty Sankyo Agroco
với giá thành rẻ và dễ tìm kiếm được tiến hành thí nghiệm khả năng phân lập nấm
Phytophthora gây bệnh mất mủ cao su. Thuốc Tachigaren 30L với 4 nồng độ khác nhau
được sử dụng trong thí nghiệm, trong các công thức đều có sử dụng thuốc kháng sinh
Rifampicin 30µg/ml trong môi trường V8.
Tachigaren 30L có khả năng ức chế được một số vi sinh vật tạp nhiễm (bảng
12), đặc biệt là nấm Pythium sp. trên mô bệnh. Tuy nhiên đối với quả ca cao bị thối đen
khả năng tạp nhiễm nấm Pythium thấp. Thuốc Tachigaren 30L liều lượng 0.3 µl/ml cho
tỷ lệ phân lập được nấm Phytophthora sp. là 18,3%, Tachigaren 30L liều lượng 0.5
µl/ml không có khả năng phân lập được nấm Phytophthora, do ở liều lượng cao ức chế
hoàn toàn nấm Pythium, đồng thời sợi nấm Phytophthora cũng bị ức chế hoàn toàn nên


không mọc. Tachigaren 30L liều lượng 0.2 µl/ml hơi thấp nên số mẫu bị tạp nhiễm
nhiều, số mẫu phân lập được nấm Phytophthora chỉ là 5,0%.
Bảng 3. Ảnh hưởng của thuốc Tachigaren 30L đến khả năng phân lập nấm
Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao (Viện BVTV - 2012)
TT
1
2
3
4
5

Công thức thí nghiệm
Tachigaren 30L liều lượng
0,5 µl/ml
Tachigaren 30L liều lượng

0,4 µl/ml
Tachigaren 30L liều lượng
0,3 µl/ml
Tachigaren 30L liều lượng
0,2 µl/ml

Tỷ lệ phân lập được (%)
Phytophthora sp.
Pythium sp.
Nấm khác
0,0

0,0

0,0

10,0

0,0

31,7

18,3

0,0

50,0

5,0

10,0

85,0

11,7
29,8

88,3
5,7

MT V8(không có thuốc)
0,0
CV(%)
19,4
Ghi chú: Tachigaren 30L với hoạt chất Hymexazol 30%.

3.2.3. Khả năng ức chế của thuốc kháng sinh RH đối với vi khuẩn tạp nhiễm trong
phân lập nấm Phytophthora
Một trong những khó khăn lớn nhất trong phân lập là do sự tạp nhiễm của vi
khuẩn trên mô bệnh và môi trường, việc nghiên cứu một số môi trường có chứa các loại
chất kháng sinh hạn chế sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm là rất cần thiết. Một số kết
quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã khẳng định sự lựa chọn kháng sinh thích
hợp và liều lượng dùng là quan trọng trong sự phân lập nấm Phytophthora có chọn lọc.
Tsao, 1983 đã đưa ra hầu hết các kháng sinh kháng khuẩn đều có thể phân lập các loài
Phytophthora như: streptomycin, rifampicin, vancomycin…., tuy nhiên mỗi một loài
phù hợp với mỗi loại kháng sinh và liều lượng khác nhau.
Theo Masago et al. (1977), Rifampicin là kháng sinh có khả năng ức chế được vi
khuẩn tạp nhiễm. Hiện nay môi trường PSM là môi trường chọn lọc cho phân lập nấm
Phytophthora có chứa chất kháng sinh Rifampicin kết hợp với thuốc diệt nấm
Hymexazol và Pimaricin.

Thuốc kháng lao RH dạng viên nén có chứa hoạt chất Rifampicin 150mg của
công ty dược phẩm Minh Tiến, được sử dụng để tìm hiểu khả năng ức chế của thuốc
với vi khuẩn tạp nhiễm trong quá trình phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen
quả ca cao. Thí nghiệm được tiến hành với 5 liều lượng khác nhau trên môi trường
phân lập V8.
Bảng 4. Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh RH đến khả năng phân lập nấm
Phytophthora gây thối đen quả ca cao (Viện BVTV - 2012)


TT
1
2
3
4
5
6

Công thức thí nghiệm
Thuốc RH liều lượng 50 µg/ml
Thuốc RH liều lượng 40 µg/ml
Thuốc RH liều lượng 30 µg/ml
Thuốc RH liều lượng 20 µg/ml
Thuốc RH liều lượng 10 µg/ml
Đối chứng (MT V8 không thuốc)
CV (%)

Tỷ lệ phân lập được (%)
13,3
35,0
71,7

41,7
6,7
0,0
8,4

Kết quả (bảng 4) cho thấy thuốc RH có khả năng ức chế được vi khuẩn tạp
nhiễm trên môi trường và cho khả năng phân lập được nấm Phytophthora cao. Tuy
nhiên khả năng phân lập được nấm Phytophthora ở liều lượng khác nhau. Thuốc RH
liều lượng 40 - 50 µg/ml có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, nhưng cũng
ức chế một phần sự phát triển của sợi nấm Phytophthora nên cho khả năng phân lập
được mẫu bệnh thấp (13,3 – 35,0%). Thuốc RH liều lượng 20 - 30 µg/ml có khả năng
ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, số mồi bẫy phân lập được đạt cao nhất: 41,7 –
71,7%, ở liều lượng này sợi nấm Phytophthora phát triển rất tốt. Thuốc RH liều lượng
10 µg/ml không ức chế được hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, vì vậy số mồi bẫy bị vi
khuẩn mọc lấn át chiếm tỷ lệ cao, khả năng phân lập được thấp hơn rất nhiều (6,7%).
4. Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận
Sử dụng mồi bẫy quả ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp. cao nhất
là 78%, cho tỷ lệ phân lập cao nhất là 26,0%.
Ben lat 80WP liều lượng 20µg/ml cho tỷ lệ phân lập nấm Phytophthora đạt cao
nhất là 40,0 %.
Thuốc Tachigaren 30L liều lượng 0,3 µl/ml cho tỷ lệ phân lập được nấm
Phytophthora sp. cao nhất là 18,3%.
Thuốc RH liều lượng 20 - 30 µg/ml có khả năng ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp
nhiễm, số mồi bẫy phân lập được đạt cao nhất: 41,7 – 71,7%.
4.2. Đề nghị
Phương pháp nghiên cứu trên có thể được tham khảo cho nghiên cứu phân lập
nấm Phytophthora gây hại các bộ phận trên mặt đất của các loại cây trồng khác.
Người viết báo cáo

Chủ nhiệm đề tài

TS. Phạm Ngọc Dung

ThS. Nguyễn Hồng Tuyên