Đánh giá đa dạng di truyền một số giống đậu tương kháng bệnh phấn trắng bằng chỉ thị phân tử SSR
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.1 MB, 65 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-----------------------------
NGUYỄN ðÌNH DUY
ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN
MỘT SỐ GIỐNG ðẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH
PHẤN TRẮNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-----------------------------
NGUYỄN ðÌNH DUY
ðÁNH GIÁ ðA DẠNG DI TRUYỀN
MỘT SỐ GIỐNG ðẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH
PHẤN TRẮNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.02.01
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ
Hà Nội 2013
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận văn
là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị khác.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này ñã
ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn
gốc.
Tác giả
Nguyễn ðình Duy
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà ñã tận tình
giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài, cũng như trong suốt
quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Lê Văn Sơn, KS. Hồ Mạnh
Tường, các cán bộ phòng Công nghệ ADN ứng dụng và phòng Công nghệ Tế
bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm ñề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học,
trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là thầy PGS.TS. Phan Hữu Tôn và
thầy cô trong Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Sinh học ứng dụng, ñã có
nhiều ý kiến ñóng góp quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các bạn bè, gia ñình và người thân ñã
nhiệt tình giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn
chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2013
Nguyễn ðình Duy
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN ...................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ii
MỤC LỤC.............................................................................................................iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................vi
DANH MỤC BẢNG...........................................................................................viii
DANH MỤC HÌNH ..............................................................................................ix
Chương 1.
MỞ ðẦU.......................................................................................... 1
1.1. ðặt vấn ñề .................................................................................................... 1
1.2. Mục ñích và yêu cầu.................................................................................... 3
1.2.1. Mục ñích................................................................................................ 3
1.2.2. Yêu cầu.................................................................................................. 3
Chương 2.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
2.1. Tổng quan về cây ñậu tương ....................................................................... 4
2.1.1. Nguồn gốc phân loại ............................................................................. 4
2.1.2. ðặc ñiểm nông học................................................................................ 4
2.1.3. ðặc ñiểm di truyền ................................................................................ 5
2.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñậu tương tại Việt Nam và trên thế giới6
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ñậu tương trên thế giới ...................................... 6
2.2.2. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới ........................................... 8
2.2.3. Tình hình nghiên cứu ñậu tương tại Việt Nam ..................................... 9
2.2.4. Tình hình sản xuất ñậu tương tại Việt Nam.......................................... 9
2.3. Bệnh phấn trắng và tình hình nghiên cứu bệnh phấn trắng trên ñậu tương
.......................................................................................................................... 11
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii
2.3.1. Triệu chứng và thời gian gây hại của bệnh phấn trắng....................... 11
2.3.2. Nghiên cứu về bệnh phấn trắng trên cây ñậu tương ........................... 12
2.4. Các phương pháp ñánh giá ña dạng di truyền ........................................... 13
2.4.1. RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism - ña hình ñộ dài
các ñoạn cắt giới hạn).................................................................................... 13
2.4.2. RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA - ña hình các ñoạn
DNA nhân bản ngẫu nhiên)........................................................................... 14
2.4.3. AFLP (Amplified Fragment Lengthe Polymorphism - ña hình các ñộ
dài các ñoạn ñược nhân chọn lọc)................................................................. 15
2.4.4. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại ñơn giản) 16
2.4.4.1. Các bước tiến hành lập chỉ thị SSR .............................................. 17
2.4.4.2. Ứng dụng của kỹ thuật SSR ......................................................... 18
Chương 3.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
3.1. Vật liệu....................................................................................................... 21
3.1.1. Vật liệu thực vật và nấm bệnh............................................................. 21
3.1.2. Hoá chất............................................................................................... 23
3.1.3. Máy móc và thiết bị............................................................................. 23
3.1.4. Mồi của phản ứng SSR ....................................................................... 23
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 25
3.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo trong khu cách biệt ..................... 25
3.2.2. Phương pháp tách chiết và ño nồng ñộ DNA tổng số......................... 27
3.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số .......................................... 27
3.2.2.2. Phương pháp ño OD bằng máy Nano Drop ................................. 28
3.2.3. Phương pháp PCR-SSR ...................................................................... 28
3.2.4. Phương pháp ñiện di DNA.................................................................. 29
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv
3.2.4.1. ðiện di DNA trên gel agarose ...................................................... 30
3.2.4.2. ðiện di DNA trên gel polyacrylamide.......................................... 30
3.2.5. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................ 32
Chương 4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 33
4.1. Kết quả ñánh giá ña dạng di truyền của 34 giống ñậu tương .................... 33
4.1.1. Kết quả tách DNA tổng số .................................................................. 33
4.1.2. Kết quả PCR- SSR trên ñiện di polyacrylamide................................. 36
4.1.3. Kết quả lập cây phân loại .................................................................... 39
4.2. Kết quả ñánh giá 5 giống ñậu tương nghiên cứu....................................... 43
4.2.1. Khả năng kháng bệnh phấn trắng của 5 giống ñậu tương................... 43
4.2.2. Kết quả chọn cặp lai............................................................................ 45
Chương 5.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 48
5.1. Kết luận...................................................................................................... 48
5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 49
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP
Amplified fragment length polymorphism - ða dạng chiều dài các
phân ñoạn ñược nhân bản
APS
Ammonium persulfate
ARN
Acid ribonucleic
ASET
Avrdc Soybean Evaluation Trial - Hệ thống ñánh giá ñậu tương
AVRDC
Asian Vegetable Research Devlopment Center - Trung tâm phát
triển rau màu Châu Á, ðài Loan
BAC
Bacterial Artificial Chromosomes
Bp
Base pair
CTAB
Cetylmethylammonium bromide
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Deoxynucleotide Triphosphates
EDTA
Ethylendiamine tetra acetic acid
EtBr
Ethidium bromide
IITA
Intenational Institute of Tropical Agriculture - Viện Nông nghiệp
nhiệt ñới Quốc tế ở Nigeria
INTSOY
International Soybean Program - Chương trình nghiên cứu ñậu
tương Quốc tế, Hoa Kỳ
IRRI
International Rice Research Institute - Viện nghiên cứu lúa quốc tế,
Philippin
Kb
Kilo base
MAS
Marker Assisted Selection - Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị
phân tử
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi
OD
Optical Density - Mật ñộ quang học
PCA
Principal Coordinate Analysis
QTL
Quantitative Trait Loci - Các locus tính trạng số lượng
RAPD
Ramdom amplified polymorphism DNA - DNA ña hình ñược nhân
bản ngẫu nhiên
RFLP
Restriction fragment length polymorphism - ña hình về chiều dài
phân ñoạn cắt hạn chế
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SSR
Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại ñơn giản
TAE
Tris acetate EDTA
TCA
Trichloracetic acid
TEMED
N, N, N, N’ Tetramethylethylenediamine
UPGMA
Phương pháp phân nhóm
YAC
Yeast Artificial Chromosomes
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới ........................................... 8
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ñậu tương Việt Nam trong những năm gần ñây ... 10
Bảng 3.1. Danh sách các giống ñậu tương nghiên cứu........................................ 21
Bảng 3.2. Tên 15 mồi sử dụng cho phản ứng SSR-PCR ..................................... 24
Bảng 3.3. Thang ñiểm nhiễm bệnh của ñậu tương .............................................. 26
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng SSR -PCR ........................................................ 29
Bảng 3.5. Thành phần gel polyacrylamide .......................................................... 31
Bảng 4.1. Hàm lượng và ñộ tinh sạch DNA của 34 giống ñậu tương nghiên cứu
..............................................................................................................................35
Bảng 4.2. Kết quả phân tích sự ña hình của các chỉ thị SSR............................... 38
Bảng 4.3. Phản ứng của 5 giống ñậu tương ñối với bệnh phấn trắng..................44
Bảng 4.4. Khoảng cách di truyền của 5 giống ñậu tương.................................... 46
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Bệnh phấn trắng trên cây ñậu tương .................................................... 11
Hình 4.1. Hình ảnh ñiện di DNA tổng số của các giống ñậu tương .................... 34
Hình 4.2. Phổ ñiện di sản phẩm PCR của một số cặp mồi SSR ..........................37
Hình 4.3. Sơ ñồ cây phân loại của 34 giống ñậu tương....................................... 40
Hình 4.4. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên phân tích tọa ñộ PCA
.............................................................................................................................. 43
Hình 4.5. Hình ảnh lá ñậu tương nhiễm bệnh phấn trắng.................................... 45
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ix
Chương 1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
ðậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, ñược
thuần hoá từ ñậu tương hoang dại Glycine và Zucc ở ðông Á. ðậu tương là một
trong 4 cây trồng chính (lúa mì, lúa nước, ngô, ñậu tương) phát triển rộng khắp trên
các châu lục vì sự giàu có ñặc biệt, chất lượng ñộc ñáo về thành phần sinh hoá
trong hạt và dinh dưỡng của nó. Chế phẩm ñậu tương ñược sử dụng rộng rãi cho
nhiều mục ñích như làm thức ăn, chất dinh dưỡng, nguyên liệu cho y học và công
nghiệp. Hàm lượng protein trong hạt ñậu tương 25 - 52% với các thành phần rất
gần với protein của trứng gà và có ñầy ñủ 6 loại axit amin thiết yếu như
methionine, histidine, lysine, tryptophan... Hàm lượng lipit chiếm 12 - 25%, trong
ñó có chứa nhiều axit béo dễ ñồng hoá cho cơ thể người và ñộng vật. Hàm lượng
gluxit chiếm 20% khối lượng khô của hạt. Ngoài ra, trong hạt ñậu tương còn có
nhiều vitamin như A, B1, B2, C, E, K... Do ñó, ñậu tương là nguồn dinh dưỡng lý
tưởng cho con người, ñặc biệt là cho trẻ em. Khô dầu của ñậu tương là nguồn thức
ăn giàu ñạm và chất khoáng cho gia súc. ðậu tương là cây thuộc họ ñậu, có khả
năng cố ñịnh ñạm không khí nhờ vi khuẩn Rhizobium japonicum sống cộng sinh
trên bộ rễ tạo thành các nốt sần. Do vậy, việc trồng ñậu tương không những mang
lại hiệu quả kinh tế mà còn có tác dụng cải tạo ñất.
Nước ta nằm trong vùng nhiệt ñới, ñộ ẩm cao, sâu bệnh hoành hành nhiều,
nhất là các loại nấm gây bệnh cho cây trồng. Bệnh nấm phấn trắng do nấm
Microphaera diffusa Cook & Peck gây ra, là một trong những bệnh chính ở cây ñậu
tương và gây thiệt hại nặng nề ñến năng suất cây trồng. Bệnh nấm phấn trắng của
ñậu tương lần ñầu tiên ñược thông báo tại Mỹ vào năm 1947 [28]. Loại bệnh này
phát triển rất tốt trong ñiều kiện nhiệt ñộ thấp (18 - 24oC). Ở Việt Nam, bệnh phấn
trắng hại ñậu tương phát triển rất mạnh ở giai ñoạn cuối của vụ thu ñông (gây hại từ
giai ñoạn chắc của quả ñến thu hoạch), vụ ñông và ñông xuân (có thể gây hại qua
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1
tất cả các thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây) hoặc vụ xuân (gây hại bắt ñầu từ
khi mọc ñến vào chắc). Việc nghiên cứu sưu tầm ñánh giá cũng như chọn tạo ñược
những giống ñậu tương kháng bệnh nấm trở nên rất cấp thiết.
Hiện nay, việc nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và ñậu tương
nói riêng nhờ chỉ thị phân tử ñã và ñang ñược áp dụng rộng rãi. Các nhà khoa học
ñã sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, RFLP, SSR…ñể
xác ñịnh quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác
chọn tạo giống cây trồng. Chỉ thị phân tử trở thành công cụ mới làm tiết kiệm thời
gian và kinh phí trong chọn tạo giống cây trồng. Trong ñó, chỉ thị SSR (Simple
Sequence Repeat - trình tự lặp lại ñơn giản) ñược sử dụng rộng rãi ñể phân tích và
chọn lọc những tính trạng quý dùng cho lai tạo và chọn giống. Chỉ thị SSR cho
ñộ ña hình cao nên ñược sử dụng ñể nghiên cứu ña dạng sinh học, sự liên kết giữa
các tính trạng số lượng, ñánh giá sự sai khác hệ gen của các dòng chọn lọc ứng
dụng trong chọn tạo giống cây trồng.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu sự ña dạng di truyền ở mức DNA là cơ sở
khoa học ñể ñề xuất việc chọn những giống ñậu tương có khả năng kháng bệnh nói
chung và bệnh phấn trắng nói riêng góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen cây ñậu
tương, tuyển chọn giống ñậu tương thích hợp làm vật liệu chọn giống. Trong ñó,
việc ñánh giá ña dạng di truyền của các giống ñậu tương kháng bệnh phấn trắng
bằng chỉ thị phân tử SSR lần ñầu tiên ñựơc thực hiện tại nước ta sẽ ñóng vai trò
quan trọng trong chọn giống ñậu tương kháng bệnh phấn trắng nói riêng và chọn
tạo các giống cây nông nghiệp năng suất cao kháng bệnh nói chung.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành ñề tài: "ðánh giá ña dạng
di truyền của một số giống ñậu tương kháng bệnh phấn trắng bằng chỉ thị phân
tử SSR " làm cơ sở cho việc tuyển chọn một số giống ñậu tương cũng như phát
hiện các chỉ thị phân tử phục vụ chọn tạo giống sau này.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Xác ñịnh sự ña dạng di truyền ở mức DNA của các giống ñậu tương có khả
năng kháng bệnh phấn trắng khác nhau.
ðánh giá khả năng kháng bệnh phấn trắng của một số giống ñậu tương cần
nghiên cứu.
Xác ñịnh cặp lai giữa giống kháng bệnh phấn trắng và giống mẫn cảm với
bệnh phấn trắng.
1.2.2. Yêu cầu
Xác ñịnh ña dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của các giống ñậu
tương nghiên cứu.
Xác ñịnh khả năng kháng bệnh phấn trắng của một số giống ñậu tương.
Chọn ñược cặp lai giữa các giống kháng bệnh phấn trắng và giống mẫn cảm
với bệnh phấn trắng.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây ñậu tương
2.1.1. Nguồn gốc phân loại
ðậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ ñậu (Fabaceae). Chi
Glycine có hai chi phụ là Glycine và Soja. Chi phụ Soja có hai loài là G.max (L.)
Merrill và G. soja. Glycine soja là dạng mọc leo hoang dại, hạt nhỏ, cứng và sản
lượng thấp nên không ñược sử dụng trong nông nghiệp còn Glycine max thì không
thấy mọc hoang dại.
ðậu tương có nguồn gốc từ ðông Á, có thể bắt nguồn từ G. soja vốn mọc
hoang dại từ thung lũng sông Dương Tử, các tỉnh phía Bắc và ðông Bắc Trung
Quốc, các vùng kế cận của Cộng hoà liên bang Nga, Triều Tiên và Nhật Bản. Hầu
hết các giống ñậu tương ñịa phương ñang trồng tại nước ta ñều du nhập từ Trung
Quốc [7].
Về thời gian sinh trưởng của ñậu tương ñược chia làm 3 loại: chín sớm: thời
gian sinh trưởng từ 75 - 78 ngày; chín trung bình: thời gian sinh trưởng từ 80 - 100
ngày, chín muộn: thời gian sinh trưởng từ 110 - 120 ngày. Thời gian sinh trưởng là
yếu tố rất quan trọng ñể lựa chọn cây trồng luân canh, xen vụ.
2.1.2. ðặc ñiểm nông học
Cây ñậu tương là cây thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ. Thân
khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc
của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này. Nếu thân lúc
còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn non thân có màu tím thì hoa có
màu tím ñỏ. Lá ñậu tương bao gồm ba loại: Lá mầm, lá nguyên và lá kép
Lá mầm (lá tử diệp): Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp
xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4
Lá nguyên (lá ñơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày, mọc
phía trên lá mầm và lá ñơn mọc ñối xứng nhau.
Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá kép mọc so le, lá kép
thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu.
Hoa ñậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của hoa
thay ñổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. ða phần các giống
có hoa màu tím và màu trắng. Hoa ñậu tương thuộc loại hoa ñồng chu lưỡng tính trong
hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá ñài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy.
Số quả của ñậu tương biến ñộng từ 2 ñến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể
ñạt tới 400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống
quả thường từ 2 ñến 3 hạt. Quả ñậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2 tới
7cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến ñộng từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc
ñen. Lúc quả non có màu xanh nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục)
khi chín có màu nâu. Hoa ñậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ ñậu quả thấp 20-30%.
Hạt ñậu tương có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn
dẹt ... Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, 2 lá tử ñiệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng
khối lượng hạt. Hạt to nhỏ khác nhau tuỳ theo giống, khối lượng một nghìn hạt
(M1000 hạt) thay ñổi từ 20-400g trung bình từ l00g-200g.
Rễ ñậu tương bao gồm rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-5m và
có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung
nhiều ở tầng ñất 7-8cm rộng 30-40 cm2[4].
2.1.3. ðặc ñiểm di truyền
ðậu tương Glycine max có bộ nhiễm sắc thể (NST) lưỡng bội 2n = 40, cây
ñậu tương là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo. Những nghiên cứu về
genome ñậu tương cho thấy, bộ gen ñậu tương có khoảng 109 bp cho bộ ñơn bội.
Trong số ñó có khoảng 40 - 65% các trình tự lặp lại (những trình tự này có kích
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5
thước nhỏ hơn 0,3 - 0,4kb), các trình tự không lặp lại chiếm khoảng 35 - 60% (có
chiều dài 1,1 - 1,4kb) ñược xếp xen kẽ với trình tự lặp lại [38].
Hệ gen của ñậu tương ñã ñược nghiên cứu từ nhiều năm nay theo nhiều hướng
và thu ñược nguồn số liệu ñáng kể. ðó là các trình tự EST, các bản ñồ di truyền, các
thư viện BAC (bacterial artificial chromosomes), YAC (Yeast artificial
chromosomes), DNA microarray, Idiogram và số liệu proteomic. ðến năm 2010, toàn
bộ hệ gen ñã ñược xác ñịnh trình tự. Thành tựu này ñã mở ra cơ hội nghiên cứu sâu ñể
phát hiện các chỉ thị phân tử, các gen và nhiều nghiên cứu cơ bản khác [52], [53].
2.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñậu tương tại Việt Nam và trên thế giới
2.2.1. Tình hình nghiên cứu ñậu tương trên thế giới
Nhằm phát triển cây ñậu tương một cách mạnh mẽ, hàng loạt các tổ chức,
mạng lưới nghiên cứu, cải tạo ñậu tương quốc tế ñược thành lập: Chương trình
nghiên cứu ñậu tương Quốc tế ở Hoa Kỳ (INTSOY - International Soybean
Program), Viện Nông nghiệp nhiệt ñới Quốc tế ở Nigeria (IITA – International
Institute of Tropical Agriculture), Trung tâm phát triển rau màu Châu Á (AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center) ở ðài Loan, Viện nghiên cứu lúa
quốc tế ở Philippin (IRRI - International Rice Research Institute). Trong ñó, Trung
tâm phát triển rau màu Châu Á là nơi nghiên cứu và ñánh giá tập ñoàn gen ñậu
tương sớm nhất thế giới. Tại ñây ñã thiết lập hệ thống ñánh giá ñậu tương (ASET Avrdc Soybean Evaluation Trial), kết quả ñã chọn lọc thành công 24 giống ñậu
tương có năng suất cao, có khả năng chống bệnh gỉ sắt và thích ứng với ñiều kiện
trồng trọt và sinh thái của nhiều quốc gia. Công tác nghiên cứu giống ñậu tương
trên thế giới hướng tới những mục ñích sau:
- Nhập nội giống sau ñó chọn lọc, thử nghiệm với ñiều kiện của các vùng
sinh thái khác nhau.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6
- Khảo nghiệm các giống ở các vùng sinh thái khác nhau ñể tìm ra khả năng
thích ứng của ñậu tương ở các vùng sinh thái ñó.
- Tạo tính trạng mới bằng lai hữu tính và dùng các tác nhân vật lý, hoá học,
chọn lọc ra những dòng, giống tốt nhất phục vụ cho sản xuất.
- Xác ñịnh nguồn ñịa bàn trồng ñậu tương trên thế giới và các nước trồng ñậu
tương ñạt năng suất và sản lượng cao.
Với những mục ñích trên, công tác này ñược tiến hành theo hai hướng chính:
Thứ nhất: Thu nhập nguồn gen ñậu tương làm nguyên liệu cho thuần hóa và lai tạo:
tại Hoa Kỳ, các nhà nghiên cứu ñã thu thập ñược tập ñoàn giống ñậu tương với số
lượng trên 100.000 giống từ nhiều nước khác nhau như: Australia, Brazil, Trung
Quốc, ðức, Nhật Bản, ấn ðộ, Thuỵ ðiển, Nga… Tại Nhật Bản, từ năm 1960 một số
giống ñậu tương ñã ñược lai tạo thành công từ hai giống bố mẹ. Ví dụ như, giống
ñậu tương Norin - 59 có chất lượng tốt, chống chịu ñược tuyến trùng, chống ñổ tốt,
năng suất cao ñã ñược lai tạo từ hai giống bố mẹ là Naugumitacodater và Tokokal. Ở
Indonesia, các nhà nghiên cứu ñã phân lập ñược một số giống có thời gian sinh
trưởng ngắn từ 70 - 80 ngày như giống Kerinei, Rinani, MLg 254, B3334... Các
giống này có thể trồng luân canh trên ñất sau cây lúa trong ñiều kiện làm ñất tối thiểu
hoặc không làm ñất vẫn ñạt năng suất từ 1,5 - 1,7 tấn/ha. Ngoài ra, họ cũng ñã chọn
ñược các giống cứng cây, chống ñổ tốt và chọn lọc thành công một số giống như
Will ñang ñược trồng phổ biến ở Indonesia [38].
Thứ hai: nghiên cứu lập bản ñồ gen ñậu tương ñịnh vị hầu hết các tính trạng nông
sinh học quan trọng: chương trình ñậu tương lớn nhất tại Hoa Kỳ - Soybase ñã thông kê
37 bản ñồ gen phân tử (molecular genetic maps) và bản ñồ gen cổ ñiển (genetic classical
maps) ñã ñược thiết lập. Các bản ñồ gen này ñịnh vị ñược 3073 chỉ thị (chỉ thị kiểu hình,
chỉ thị hoá sinh, chỉ thị phân tử), 428 mẫu dò (probe) RFLP locus, trên 1000 chỉ thị SSR
và 1174 tính trạng di truyền số lượng (QTL) ñiển hình [49].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7
2.2.2. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới
ðậu tương là một trong những cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới
và là cây trồng ñứng vị trí thứ tư trong các cây làm lương thực thực phẩm sau lúa
mỳ, lúa nước và ngô. Vì vậy sản xuất ñậu tương trên thế giới tăng rất nhanh cả về
diện tích, năng suất và sản lượng ñược thể hiện qua bảng 2.1.
Về diện tích: Năm 2008 diện tích trồng ñậu tương trên thế giới ñạt 96,87
triệu ha, diện tích tăng dần theo từng năm v à ñến năm 2013 sau 5 năm diện tích
trồng ñã ñạt 106,62 triệu ha tăng 9,75 triệu ha.
Về năng suất: Năm 2008 năng suất ñậu tương thế giới ñạt 23,84 tạ/ha, năm
2009 năng suất giảm còn 22,55 tạ/ha và ñạt cao nhất vào năm 2010 là 25,83 tạ/ha.
Sau ñó năng suất lại giảm dần, ñến năm 2012 năng suất ñậu tương thế giới chỉ còn
23,74 tạ/ha giảm 2,09 tạ/ha so với năm 2010.
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới
Diện tích
Năng suất
Sản lượng
( triệu ha)
(tạ/ha)
( triệu tấn)
2008
96,87
23,84
230,95
2009
99,01
22,55
223,26
2010
102,62
25,83
265,05
2011
103,60
25,29
262,04
2012
106,62
23,74
253,14
Năm
(Nguồn FAO Statistic Database, 2013 [50])
Về sản lượng: Cùng với sự tăng lên về diện tích và năng suất, sản lượng ñậu
tương của thế giới cũng ñược tăng lên qua các năm. Năm 2008 sản lượng ñậu
tương thế giới ñạt 230,95 triệu tấn thì ñến năm 2010 tăng lên cao nhất ñạt
265,05 triệu tấn. ðến năm 2011 sản lượng ñậu tương thế giới giảm xuống
còn 262,04 triệu tấn và ñến năm 2012 sản lượng ñậu tương thế giới giảm chỉ
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8
còn 253,14 triệu tấn, giảm 11,91 triệu tấn so với năm 2010.
2.2.3. Tình hình nghiên cứu ñậu tương tại Việt Nam
Hiện nay, ở Việt Nam cây ñậu tương có vị trí, vai trò rất quan trọng trong
sản xuất nông nghiệp, ñặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, có nền kinh tế
chưa phát triển. Ngoài việc cung cấp nguyên liệu chế biến làm thực phẩm cho con
người, nguyên liệu cho xuất khẩu, cây ñậu tương còn là nguồn cung cấp thức ăn
cho chăn nuôi rất tốt. Có thể khẳng ñịnh rằng cây ñậu tương là một trong những
cây ñang phát triển rất mạnh ở Việt Nam và ngày càng có vị trí quan trọng trong
nền kinh tế quốc dân.
Nước ta năm 2010 tăng diện tích ñậu tương toàn quốc lên con số khoảng
500.000- 600.000 ha, năng suất ñạt trung bình 20-22 tạ/ha, sản lượng ñạt 1,0- 1,5
triệu tấn [6]. Mục tiêu trên thực hiện ñồng hành cùng việc chú ý ñến công tác chọn
giống, ñồng thời kết hợp với các biện pháp kỹ thuật thâm canh tiên tiến ở các ñịa
phương nhất là các tỉnh trung du và miền núi. Tuy nhiên, qua kiểm nghiệm thực tế
cho thấy: ñậu tương là một cây trồng bị nhiều sâu bệnh phá hoại. Cụ thể là, có trên
70 loại sâu hại và 17 loại bệnh, trong ñó có 12 - 14 loại sâu và từ 4 - 5 loại bệnh
phổ biến nhất. Do ñó, việc nghiên cứu phát triển các chỉ thị phân tử ñể phục vụ cho
chọn giống ñậu tương là rất cần thiết và ñang ñược tiến hành [2].
2.2.4. Tình hình sản xuất ñậu tương tại Việt Nam
Trong những năm gần ñây, cây ñậu tương ñã ñược phát triển khá nhanh cả
về diện tích và năng suất. Tình hình sản xuất ñậu tương của nước ta trong
những năm gần ñây ñược trình bày qua bảng 2.2.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất ñậu tương Việt Nam trong những năm gần ñây
Diện tích
Năng suất
Sản lượng
(nghìn ha)
(tấn/ha)
(nghìn tấn)
2008
192,1
1,39
267,6
2009
146,2
1,46
213,6
2010
197,8
1,51
298,6
2011
181,1
1,47
266,9
2012
120,8
1,45
175,3
2013*
180
1,5
270
2014*
200
1,5
300
Năm
(Nguồn: Tổng cục thống kê *Số liệu dự báo của USDA [51])
Bảng 2.2 cho thấy diện tích trồng ñậu tương của nước ta năm 2008 là
192,1 nghìn ha, ñạt cao nhất vào năm 2010 là 197,8 nghìn ha, sau ñó diện tích
trồng ñậu tương giảm xuống còn 181,1 nghìn ha năm 2011, ñến năm 2012 diện
tích ñậu tương chỉ ñạt 120,8 nghìn ha. Theo dự báo của USDA ñến năm 2014 diện
tích trồng ñậu tương của nước ta sẽ vào khoảng 200 nghìn ha.
Về năng suất: Năm 2008 năng suất bình quân cả nước ñạt 1,39 tấn/ha, tăng
liên tục qua các năm ñến năm 2010 ñạt 1,51 tấn/ha, giảm nhẹ vào năm 2011 và
thấp nhất vào năm 2012 là 1,45 tấn/ha. Theo dự báo của USDA ñến năm 2014
năng suất bình quân cả nước ước ñạt 1,5 tấn/ha.
Về sản lượng: Do có sự tăng giảm về diện tích và năng suất nên sản lượng
luôn có sự tăng giảm qua các năm. Năm 2008 tổng sản lượng ñậu tương cả nước
là 267,6 nghìn tấn. ðến năm 2010 tăng lên ñạt 298,6 nghìn tấn, ñến năm 2012
giảm xuống còn 292,7 nghìn tấn.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10
2.3. Bệnh phấn trắng và tình hình nghiên cứu bệnh phấn trắng trên ñậu tương
2.3.1. Triệu chứng và thời gian gây hại của bệnh phấn trắng
Bệnh phấn trắng là một trong những bệnh nấm hại chính trên cây ñậu tương.
Bệnh phấn trắng xuất hiện gây hại ở hầu hết các bộ phận trên thân của cây ñậu
tương: ñỉnh sinh trưởng, thân, cả 2 mặt của lá và quả xanh. Biểu hiện của bệnh là
những ñốm trắng do nấm Microphaera diffusa gây ra. Nấm phát triển rất tốt trong
ñiều kiện nhiệt ñộ từ 18-24oC. Nấm sẽ tấn công các tế bào diệp lục, làm cho lá, quả
và thân xanh của cây trở thành màu vàng. Nếu bị gây hại ở mức ñộ nặng, lá sẽ bị
rụng, quả lép, hạn chế sự sinh trưởng phát triển của thân cây.
Hình 2.1. Bệnh phấn trắng trên cây ñậu tương
Bệnh phấn trắng hại ñậu tương gây hại năng suất từ 10-50%. Nấm phấn
trắng hại ñậu tương là loài nấm kí sinh chuyên tính riêng của cây ñậu tương trồng
và ñậu tương dại. Nấm phấn trắng hại ñậu tương ở Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Việt
Nam có 2 loài là: Eryshiphe glycines và Odium sp. Nấm phấn trắng hại ñậu tương ở
Việt nam là gọi chung là Odium sp theo phương thức sinh sản vô tính và ñã xác
ñịnh ñược Eryshiphe glycines và Microphaera diffusa chính là một loài [1].
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11
2.3.2. Nghiên cứu về bệnh phấn trắng trên cây ñậu tương
Trên thế giới
Những nghiên cứu về gen kháng bệnh phấn trắng: Một số kết quả nghiên cứu
Lohnes và Bernard, (1992) cho thấy phản ứng của ñậu tương với bệnh phấn trắng
dưới sự ñiều khiển bởi cặp gen trội (Rmd, rmd) [31]. Trong ñó, Rmd phản ứng
kháng và rmd có phản ứng nhiễm với M.diffusa. Nghiên cứu trên việc xây dựng
bản ñồ gen ñối với gen kháng bệnh phấn trắng của giống ñậu tương PI243540,
Kang (2010b) [25] thông báo rằng ñơn gen kiểm soát tính trạng kháng bệnh phấn
trắng của ñậu tương nằm gần trên nhiễm sắc thể số 16 (nhóm liên kết J). Theo
thông báo của Lohnes (1992) [32], Naohiro (2004) và Kang (2010) [25] tính trạng
kháng bệnh phấn trắng của ñậu tương ñược kiểm soát bởi ñơn gene trội. Thêm vào
ñó, gen kháng bệnh phấn trắng có liên kết chặt chẽ với gen kháng bệnh thối rễ và
ngọn của ñậu tương (Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann). Mối liên kết
chặt chẽ của 2 cặp gene này ñã ñược kiểm chứng bằng nghiên cứu trên bản ñồ liên
kết gene sử dụng mẫu dò RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism - ña
hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn) [37].
Theo Grau và Laurence (1975) [20], Mignucci và Lim (1980) [34] ñã chỉ ra:
ñánh giá tính kháng bệnh ở ñiều kiện ñồng ruộng cho thấy có 3 phản ứng: mẫn
cảm, kháng và kháng hoàn toàn. Mignucci and Lim (1980) nghiên cứu về tính
nhiễm bệnh phấn trắng cho thấy: lá của cây ở giai ñoạn sinh trưởng V1 là mẫn cảm
hơn cây ở giai ñoạn V3 và những lá ở tầng dưới mẫn cảm hơn những lá ở tầng trên.
Nghiên cứu của Yorinori (1997) [47] xác ñịnh việc ñánh giá bệnh phấn trắng
theo thang từ ñiểm 0 ñến 5 và tương ứng với tỷ lệ lá bị bệnh gây hại từ 0 ñến trên
75%. Kết quả nghiên cứu chọn giống kháng bệnh phấn trắng của ñậu tương trên thế
giới chưa phong phú. Những nghiên cứu chủ yếu tập chung về di truyền tính kháng,
khả năng lây nhiễm bệnh.. Nghiên cứu của Kang (2010) [25], cho thấy rất khó có
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12
thể chọn tạo ñược các giống kháng bệnh nấm phấn trắng ở trên ñiều kiện ñồng
ruộng, do sự xuất hiện bệnh rất khó quan sát trên các giống ở ngoài ñồng ruộng. Ví
dụ, ở Wisconsin của Mỹ, chu kỳ biểu hiện của bệnh phấn trắng từ 10-15 năm
(Grau, 2006) [23]. Mặc dù, ñiều kiện thuận lợi cho bệnh phấn trắng phát triển nhiều
ở Mỹ chưa nhiều nhưng bệnh ñã xuất hiện. Và tiềm ẩn dịch bệnh rất lớn cho các
vùng chuyên canh ñậu tương. Do vậy, các nhà chọn giống xúc tiến nghiên cứu
nghiên cứu và ñể tìm ra phương án phòng trừ khi xảy ra dịch hại một cách tích
cực.
Tại Việt Nam
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bình và cs (2004) [1] cho thấy:
trong ñiều kiện tự nhiên bệnh phấn trắng xuất hiện trong vụ ñông và xuân. Thời
gian từ tháng 1 ñến ñầu tháng 5 và tháng 11, 12 trong năm. Trong phòng thí
nghiệm với ẩm ñộ là 100 %, nhiệt ñộ từ 16 – 24oC thích hợp cho bào tử nẩy mầm.
Những kết quả nghiên cứu về bệnh phấn trắng hại ñậu tương ở Việt Nam còn
rất hạn chế và việc ứng dụng công nghệ sinh học vào chọn giống kháng bệnh phấn
trắng còn ít. Trong khi bệnh hại này ñã xuất hiện, tồn tại trên ñồng ruộng với thời
gian ngày một kéo dài và gây hại với cây trồng các tỉnh phía Bắc.
2.4. Các phương pháp ñánh giá ña dạng di truyền
2.4.1. RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism - ña hình ñộ dài
các ñoạn cắt giới hạn)
Kỹ thuật RFLP do Bostein và cs xây dựng năm 1980 [18] ñể lập bản ñồ di
truyền người. Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò ñặc
hiệu (một trình tự DNA ñã biết) ñể xác ñịnh sự thay ñổi trong locus ñặc hiệu ñó
ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu. Kỹ thuật RFLP ñược tiến hành như sau:
các endonuclease cắt giới hạn ñược sử dụng ñể cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận
biết ñặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân ñoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Số
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13
lượng các phân ñoạn này phụ thuộc vào ñiểm nhận biết trong bộ gen. Sản phẩm
của quá trình cắt sẽ ñược ñiện di, sau ñó ñược chuyển nguyên vị và cố ñịnh trên
màng lai. ða hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn sẽ ñược phát hiện bằng sự kết
hợp giữa mẫu dò ñã ñược ñánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phương pháp hoá
học) và các ñoạn DNA của mẫu cần phân tích (ñược tạo ra từ cùng một locus
theo nguyên tắc bổ sung).
Theo lý thuyết, sự ña hình trong phân tích RFLP có thể ñược ghi nhận như
sự có mặt hay vắng mặt của một băng riêng biệt trên gel. ðó chính là những biến
ñổi về cặp bazơ nitơ có thể xuất hiện hoặc do biến ñổi chuỗi DNA trên phạm vi
rộng lớn như là kết quả của sự ñảo ñoạn, chuyển ñoạn, khuyết ñoạn.... Có một số
cách xác ñịnh biến dị của chuỗi DNA, ñó là xác ñịnh trình tự DNA và so sánh từng
ñoạn; sử dụng enzym cắt hạn chế ñể cắt DNA thành những phân ñoạn có chiều dài
khác nhau.
RFLP là chỉ thị ñồng trội mà nhờ ñó các ñoạn DNA từ tất cả các NST ñồng
dạng ñều ñược phát hiện. Do vậy, chúng có thể xác ñịnh một ñặc ñiểm liên kết ở
trạng thái ñồng hợp hoặc dị hợp của một cá thể và rất ñáng tin cậy trong phân tích
tài liệu liên kết và chọn giống ñậu tương. Kỹ thuật này có nhược ñiểm là tốn kém
và mất thời gian. Kỹ thuật này ñòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 - 200 ng từ
mỗi cá thể) [8].
Bằng kỹ thuật RFLP, Young và cs (1992) ñã thành công trong việc lập bản
ñồ gen kháng mọt ở ñậu xanh [48].Với kỹ thuật RFLP và RAPD, Lambrides và cs
ñã lập ñược bản ñồ gen của ñậu xanh [27].
2.4.2. RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA - ña hình các ñoạn
DNA nhân bản ngẫu nhiên).
Nguyên tắc của chỉ thị này như sau: Chỉ thị RAPD sử dụng kỹ thuật PCR với
các ñoạn mồi ngẫu nhiên. ðoạn mồi có thể bám vào bất kỳ vị trí bổ sung nào trên
mạch DNA khuôn, có thể ở nhiều locus khác nhau. 10 base chứa khoảng hơn 60%
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14
