Quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Khoa Kỹ thuật Hóa học
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm

-----------------------Tiểu luận Công nghệ lên men

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
ACID LACTIC

CBGD : Lê Văn Việt Mẫn
SVTH : Phạm Hoàng Tiến Đạt - 61200847
Lê Nguyễn Phương Nhi - 61202583
Dương Yến Nhi - 61202578
Phan Hồng Đức - 61200847

TP HCM – 10/2015


2


MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................................................3
A. NGUỒN NGUYÊN LIỆU VI SINH VẬT.....................................................................4
B. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ.........................................................................................12
1. Sơ đồ quy trình công nghệ..........................................................................................12
2. Giải thích quy trình.....................................................................................................13
II.1 Xử lý mật rỉ..........................................................................................................13
Pha loãng sơ bộ .............................................................................................................13
Xử lý dịch pha loãng......................................................................................................13

Ly tâm thu dịch trong: ...................................................................................................14
II.2 Chuẩn bị môi trường............................................................................................15
Nhu cầu dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy..............................................................15
Nhu cầu Cacbon ............................................................................................................16
Nhu cầu Nito..................................................................................................................16
Nhu cầu vitamin.............................................................................................................16
Nhu cầu về muối khoáng...............................................................................................16
Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:...............................................................................17
Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của Vi khuẩn lactic.....................17
Nhiệt độ: Vi khuẩn lactic có thể phát triển tốt trong nhiệt độ từ 15-30 độ C gồm ......17
II.3 Thanh trùng môi trường:......................................................................................18
II.4 Nhân giống...........................................................................................................19
2.5 Nuôi cấy...............................................................................................................20
2.6 Ly tâm...................................................................................................................23
2.7 Sấy thăng hoa........................................................................................................24
2.8 Đóng gói................................................................................................................26
2.9 Sản phẩm...............................................................................................................27
C. Ứng dụng........................................................................................................................27
D. TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................31


A. NGUỒN NGUYÊN LIỆU VI SINH VẬT
I. Nguyên liệu làm môi trường vi sinh vật
1. Vi khuẩn lactic
Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae. Mặc dù nhóm vi khuẩn
này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm vi khuẩn dạng que ngắn , que dài, vi khuẩn
hình cầu) song về mặt sinh lí chúng lại tương đối đồng nhất.
1.1 Đặc điểm:

-

Là những trực khuẩn, cầu khuẩn Gram dương , không tạo thành bào tử , hầu hết
không di động , hô hấp tuỳ tiện.Thu nhận năng lượng nhờ phân giải hidrat cacbon
và tiết ra acid lactic .

-

Vi khuẩn lactic là sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Do đó, trong thực tế khi nồng
độ oxygen thấp thì hoạt động sống được duy trì bình thường, nhưng điều này
không bắt buộc luôn phải như vậy.

-

Một số đặc điểm quan trọng của acid lactic là có nhu cầu về chất sinh trưởng phức
tạp . . Đa số trong chúng cần hàng lọat Vitamin( lactoflavin, tiamin, axit nicotinic,
acit folic, biotin) và các acid amin , peptone , khoáng chất, thậm chí là peptide
ngắn.

-

Không thể phát triển triển trên môi trường muối khóang thuần khiết chứa glucose
và ammonium(, NH4+)

-

Hoạt động phân giải protein kém.

-

Có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không thể lên

men các loại glucid phức tạp và tinh bột.

-

Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit pH từ 4,5 ÷ 6,8. Nhiệt độ
thích hợp cho quá trình lên men từ 10 ÷ 50 0C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng
nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80 0C vi khuẩn lactic bị tiêu
diệt hoàn toàn.

1.2 Phân lọai:
 Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình:
 Giống LACTOBALICILLUS: Là giống được sử dụng rộng rãi.
- Có dạng hình que thẳng hay hơi cong.
- Một số lên men hiếu khí chịu dưỡng và sử dụng oxy nhờ enzyme flavoprotein oxidase,
một số lại kị khí bắt buộc. Bào tử loài này kị khí tùy tiện, bộ phận còn lại thì lại kị khí bất
buộc. Chúng là phần chính của nhóm vi khuẩn acid lactic vì hầu hết thành viên của nó
làm biến đổi lactose và các đường khác thành acid lactic

4


-

-

Nhiệt độ phát triển thích hợp
o Loại ưa nóng: 40 đến 60 0C như Lactobacillus bulgaricus
o Loại ưa ấm: 28 đến 35 0C như Lactobacillus plantarum
Sinh trưởng ở pH = 4,5 và cấu tạo đòi hỏi nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp như amino
acids, peptides, nucleotide bases, vitamins, khoáng chất, acid béo, và carbohydrates.

Trong cơ thể người chúng sống cộng sinh ở ruột non góp một phần nhỏ vào sự phân giải
thực vật. Nhiều loài dễ thấy ở những nguyên liệu thực vật thối rữa.

Lactobacillus bulgaricum: được phân lập từ sữa chua của Bulgari vào năm 1905, do giáo sư
Grigorov phat hiện ra. Chủng loại này có kích thước tế bào 5.1 0.8-1µm. nhiệt độ phát triển 2050oC, nhiệt độ cực thuận là 40-42oC. Chúng có khả năng tích lũy 1.7% axit lactic. Chủng này
được sử dụng để sản xuất sữa chua xuất khẩu.
Lactobacterium plantarum : là loài vi khuẩn lactic đồng hình ưa ấm. Nhiệt độ thích hợp là 30 oC.
Chúng có khả năng phân hủy nhiều loại đường, có khi phân hủy cả tinh bột, casein. Chúng phân
bố rộng rãi trong tự nhiên, trên bề mặt các loại rau.
Lactobacterium casei: Đây là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự nhiên. Yếm khí tuỳ
tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 ÷ 1% axit lactic. Ở điều
kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10 đến 12 giờ. Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là
peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 10oC, tối ưu là 35oC và tối đa là 45oC, chúng
thuỷ phân cazein và gelatin rất yếu.

-

 Giống STREPTOCOCCUS:
Streptococcus là một giống vi khuẩn gram dương hình cầu, phát triển ở dạng song cầu

-

khuẩn hoặc song cầu khuẩn.
Nhiệt độ phát triển thường thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 25-30 oC. Không

-

sinh trưởng ở 10 oC nhưng lại sinh trưởng được ở 45 oC
Streptococcus được chia nhỏ thành Lactococcus, Enterococcus, Vagococcus, dựa trên
đặc tính sinh học cũng như cấu tạo phân tử.Trong quá khứ, người ta phân lọai

-

Streptococcus bằng cách phân tích huyết thanh.
Do sự ảnh hưởng to lớn của loài này đến công nghiệp, cả hai loài phụ của nó là lactis and

-

cremoris cũng được sử dụng rộng rãi.
 Giống PEDIOCOCCUS:
Pediococcus là giống vi khuẩn gram dương, chúng thường xuất hiện ở dạng song cầu
khuẩn hoặc dạng tứ cầu khuẩn được chia đối xứng qua một hoặc hai mặt phẳng. Đại diện
là

Pediococcus

acidilactici,

Pediococcus

damnosus,

Pediococcus parvulus và Pediococcus pentosaceu.

Pediococcus

dextrinicus,


Pediococcus pentosaceus: có thể chịu được môi trường acid, không thể tổng hợp pothyrins và sở

hữu cơ chế chuyển hóa thành men hoàn toàn với acid lactic như là sản phẩm chuyển hóa cuối
quan trọng.P. pentosaceus phát triển tại 40oC (50oC không phát triển), nồng độ pH dao động từ
4.5 đến 8, trong dung dịch NaCl 9-10%, thủy phân arginine, có thế sử dụng maltose và vài dòng
sản xuất ra “pseudo-catalase”.P.pentosaceus có thể được cô lập ra khỏi các nguyên liệu thực vật
và vi khuẩn tạo phômai. Sinh vật này được sử dụng như là chất sản sinh môi trường acid trong
sự lên men của xúc xích, dưa chuột và đậu xanh, đậu nành…
 Lên men dị hình
 Giống LEUCONOSTOC:
- Leuconostoc là một giống vi khuẩn gram dương thuộc họ Leuconostocaceae. Hầu hết
chúng có dạng chuỗi cầu, nhưng trong môi trường acid tế bào dài ra và nhọn hai đầu. Tất
cả loài vi khuẩn thuộc giống này đều lên men dị dưỡng (heterofermentative) và có thể
sản xuất dextran từ đường saccharose. Chúng thường có dạng nhớt. Leuconostoc là loại
vi khuẩn tồn tại nhiều trong tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công
-

nghiệp và lên men thực phẩm.
Leuconostoc mesenteroides là loài kị khí không bắt buộc, đòi hỏi các yếu tố sinh trưởng
phức tạp. Chúng tồn tại trong thiên nhiên ở chủ yếu ở dạng hình tròn, tồn tại riêng rẽ
hoặc từng cụm nhỏ, tuy nhiên hình dạng có thể thay đổi tùy theo điều kiện sinh trưởng,
trong môi trường chứa nhiều glucose thì hình dạng có thể bị kéo dài ra hoặc biến thành
hình que.

1.3 Phân bố
Ít gặp trong đất và nước,thường phát triển trong những môi trường có chứa nhiều chất hữu cơ
phức tạp như:
-

Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus
bulgarius,Lactobacillushelviticus,Lactobacilluscasei, Lactobacillus ferment,Lactobacillus
brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trường sữa vi khuẩn lactic tổng

-

hợp ATP từ cơ chất lactose.
Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus plantanium,
Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus

-

lactis...Chúng còn được tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây.
Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có Lactobacillus

acidophilus,

Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus
pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus.

6


2. Sinh khối của vi khuẩn lactic
2.1 Mục đích thu nhận sinh khối của vi khuẩn lactic
Trong thời gian trước đây mỗi cơ sở sản xuất có phương pháp và qui trình riêng để nhân giống
và bảo quản giống dùng cho sản xuất. Khi cần sử dụng người ta sẽ tiến hành nhân giống qua
nhiều giai đoạn theo nguyên tắc thu nhận một canh trường vi sinh vật thuần khiết. Hiện nay một
số nhà máy chế biến thực phẩm và những nhà máy sản xuất các sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh
vật vẫn đang sử dụng phương pháp này nên giống vi sinh vật được xem là độc quyền sở hữu của
mỗi nhà máy
Từ những năm 1980, trên thế giới phát triển mạnh một ngành công nghiệp mới, công nghiệp sản
xuất và cung cấp giống vi sinh vật. Các chế phẩm giống thương mại bao gồm đủ loại: vi khuẩn,

nấm men, nấm sợi… Vi khuẩn lactic cũng không ngoại lệ, sinh khối vi khuẩn lactic được thu
nhận, bảo quản và cung ứng cho ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa.
Chế phẩm giống thương mại có thể cấy trực tiếp vào môi trường lên men hoặc hoạt hoá chúng
trên một môi trường dinh dưỡng trong một khoảng thời gian nhất định trước khi cấy.
2.2 Các loại vi khuẩn lactic dùng trong sản xuất sinh khối
Quan trọng là sinh khối của vi khuẩn lactic lên men đồng hình: Streptococcus thermophiles;
Lactobacillus bulgaricus; Streptococus lactic; Streptococcus cremoris; Lactobacillus
acidophilus ; Nhóm vi khuẩn sinh hương
-

2.2.1 Lactobacillus acidophilus
Thuộc trực khuẩn, có kích thước : rộng 0.6-0.9 µm, dài 1.5-6 µm.
Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành những chuỗi ngắn, thuộc nhóm

-

vi khuẩn gram dương (+) và có khả năng chuyển động.
Có khả năng lên men glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose

-

để tạo acid lactic.
Không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, glycerol, mannitol, sorbitol,

-

dulcitol, inocitol.
Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của acid lactic.
Nhiệt độ phát triển tối ưu là 45C, pH 4-5.
2.2.2 Lactobacillus bulgaricus

Thuộc trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram (+).
Không có khả năng di chuyển.
Có khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose.
Không lên men được xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin.
Không có khả năng tạo initrit từ nitrate.
Nhiệt độ phát triển 40-50C, pH thích hợp 5.5-6.0.
2.2.3 Streptococcus thermophiles
Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 0.7-0.9 µm, không chuyển động, thường

-

kết thành chuỗi ngắn, gram (+).
Phát triển tốt ở 40-45C, pH 5.8-6.0.
Không phát triển được ở 53C và dưới 20C, sống được ở 65C trong 30 phút.

-


-

Không phát triển được trong môi trường sữa chứa 0.01% methylen blue, môi trường máu
chứa 10% mật.
Có khả năng lên men glucose, fructose,lactose, saccharose.
Nhạy cảm với các chất kháng sinh 0.01µg/ml tetracycline hay 0.1µg/ml chloremphen.
2.2.4 Streptococcus cremoris
Cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tạo thành từng chuỗi rất dài, gram (+).
Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30C.
Không phát triển được ở nồng độ NaCl 4%.
Khi lên men đường tạo ra acid acetic, CO2, diacetyl.
Có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn

2.2.5 Streptococcus lactic
Thuộc chuỗi cầu khuẩn, gram (+).
Nhiệt độ phát triển 10-45 độ C, tối thích ở 30-35 độ C.
Có khả năng chịu được nồng độ NaCl 4%.
Khi lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose,
mannitol, salicin tạo ra acid lactic, CO2, acid acetic, diacetyl.
Không có khả năng lên men được raffinose, insulin, glycerol, sorbitol
2.3 Yêu cầu cho các vi sinh vật dùng trong sản xuất

Cùng với chất lượng môi trường, điều kiện lên men, các phương pháp thu nhận và tinh chế sản
phẩm,giống vi sinh vật là khâu đầu tiên can phải quan tâm đặc biệt. Giống vi khuẩn lactic dùng
cho sản xuất phải đáp ứng các yêu cầu sau:
-

Thích ứng nhanh, phát triển mạnh
Khả năng sinh sản cao, chống chọi được với các điều kiện bất lợi.
Dễ dàng tách khỏi môi trường nuôi cấy
Khả năng dễ bảo quản và bảo tồn được đặc tính di truyền trong suốt thời gian bảo quản

-

và sử dụng.
Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao

3. Mật rỉ
3.1 Đặc điểm
Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đường từ cây mía hay củ cải đường. Trước đây mật rỉ
ít được sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau này người ta thấy mậy rỉ có rất nhiều ưu điểm để
tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật, đó là có hàm lượng đường cao; ngoài saccharose ra còn
chứa rất nhiều chất hưu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trưởng.

Tuy nhiên rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men cần phải xử
lý kĩ. Các đặc diểm đó gồm:
-

Màu nâu sẫm của rỉ đường khó bị phá hủy trong quá trình lên men. Sau lên men chúng
bám vào sinh khối và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm
thường rất tốn kém và khó khăn.

8


-

Hàm lượng đường khá cao (40%-50%) , chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men

-

phải pha loãng với nồng độ thích hợp.
Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ. Keo càng
nhiều, khả năng hòa tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng

-

kém. Do đó việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo này.
Rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển. Như vậy chất lượng mật rỉ cũng dễ thay đổi

-

theo thời gian bảo quản
3.2 Thành phần hóa học

Nước chiếm 15-20%, chất khô chiếm 80-85%. Trong đó, có 60% là đường ( 40%

-

saccharose, 20% là fructose và glucose và 40% còn lại là chất phi đường)
Trong thành phần phi đường có khoảng 30-32% hợp chát hữu cơ và 6-105 hợp chất vô
cơ. Trong hợp chất vô cơ có:
K2O: 3,5%
Fe2O3: 0,2%

-

MgO: 0,1%

Sulfat: 1,6%

CaO: 1,5%

SiO2: 0,5%
P2O5: 0,2%
Clorit: 0,4%
Trong những hợp chất hữu cơ gồm có các hợp chất chứ nitơ và không chứ nitơ ở dạng
amin như: acid aspactic, acid glutamic, leuin, izoleuxin. Nito tổng số chiếm khoảng 0,30,5% ( ít hơn so với so với lượng nitơ có trong rỉ đường củ cải)
Các chất thành phần

%

Saccarose

32

Chất hữu cơ phi đường

10

Chất tro: (gồm)

8

K20

3.5

CaO

1.5

MgO

0.1

SiO2

0.5

SO3

1.6

Cl2

0.4

Na2O, Fe2O3, Al2O3

0.2

P2O5

0.2

N-tổng

5-2.2

N-amin

0.2-0.5

Bảng1 : Thành phần các chất trong rỉ đường

Vitamin
Thiamin

mg%
0.5


Riboflavin

0.12

Pyridoxin

0.9

Nicotinamit

1.5

Acid pantotenic

7.0

Acid foleic

0.02

Biotin

0.15

Inozit

555.0

Bảng 2 : Thành phần vitamin trong rỉ đường mía

Các chất màu trong rỉ đường :
-

Caramel: xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại trừ nước và không
chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỷ lệ thuận với nhiệt

-

độ phản ứng.
Phức chất polyphenol-Fe2+: có màu vàng xanh, không bị loại hết trong giai đoạn làm

-

sạch và tồn tại trong mật rỉ
Melanodin: đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và acid amin mà chủ yếu là acid
aspartic. Sản phẩm ngưng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò quan trọng

-

làm tăng độ màu của rỉ đường.
Melanin: được hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acidamin thơm nhờ xúc tác của

-

enzym polyphenol oxydaza khi có mặt của oxy và Cu+2.
Các acid amin thơm thường bị oxy hóa là tiroxin và brenzcatechin. Các melanin thường
bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nước đường nên chỉ tìm thấy một lượng rất nhỏ trong rỉ

-

đường.
Chất keo: được hình thành bởi potein và pectin. Các chất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự

phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào, ngăn cản quá trình hấp
thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài. Ngoài ra
keo là nguyên nhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật,
giảm hiệu suất sử dụng thiết bị.

Các vi sinh vật:
Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía . Đa số chúng có từ nguyên liệu, một số nhỏ
từ không khí, nước, đất vào dịch đường. Loại nào chịu được tác dụng nhiệt hay tác dụng
của hoá chất thì tồn tại. Người ta chia rỉ đường thành 3 loại tuỳ theo số lượng vi sinh vật
tạp nhiễm.

10


Loại rỉ
đường

Số lượng VSV
trong 1 g đường

I

100000

II

100000- 1000000

III

1000000- 5000000

Đánh giá, xử lý
Rất tốt, không cần xử lý
Trung bình, cần thanh trùng
Nhiễm nặng, cần xử lý nghiêm ngặt

Bảng 3: Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm.


II.

Sản phẩm sinh khối
 Lên men đồng hình:

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm
hơn 90% tổng số sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic , aceton , diacetyl...
 Lên men dị hình:

Trong đó acid lactic chiếm 40%, acid succinic khỏang 20%, rượu ethylic và acid acetic
10%, các loại khí 20% ... và đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích lũy một
lượng ít acid foocmic.

B. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
1. Sơ đồ quy trình công nghệ

Hình 1: Sơ đồ quy trình
12

2. Giải thích quy trình
II.1Xử lý mật rỉ
 Pha loãng sơ bộ
-

Mục đích : chuẩn bị cho quá trình acid hóa

-

Biến đổi
o Hóa học : giảm nồng độ chất khô
o Vật lý: làm giảm độ nhớt
o Hóa lý: tăng độ hòa tan các chất

-

Cách thực hiện:
o Nguyên liệu sử dụng là mật rỉ đường vì rẻ tiền và dễ kiếm
o Pha loãng theo tỉ lệ nước : rỉ = 3:1, sau đó cho dung dịch này chạy qua than hoạt
tính. Than hoạt tính sẽ hấp thụ các chất màu và tạo các chất keo có trong mật rỉ,
khi đó mật rỉ sẽ mau sáng hơn.

 Xử lý dịch pha loãng

Acid hóa:
-

Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men, tiêu diệt vi sinh vật gây hại

-

Biến đổi:
o Hóa học: đường saccharose chuyển hóa thành đường glucose
o Hóa lý: phá vỡ hệ keo
o Vi sinh: nhiệt độ cao và pH thấp tiêu diệt vi sinh vật

-

Cách thực hiện: Làm loãng mật rỉ đến nồng độ 15% chất khô, acid hóa môi trường bằng
H2SO4 đậm đặc với hàm lượng 5% so với khối lượng dung dịch. H2S04 xem như một chất
điều hòa pH, làm phá vỡ hệ keo, chuyển hóa đường saccharose thành đường nghịch đảo
giúp quá trình lên men sau này diễn ra tốt hơn, sau đó đun dung dịch đến 90—95 độ C,
trong 6h,sau đó tiến hành ly tâm thu dung dịch trong .


-

Thiết bị

1-Ống nối để nạp chất tải nhiệt
2-Ống chảy tràn sản phẩm
3- Ống quá áp
4- Đầu nối ống nạp nguyên liệu
5- Cửa quan sát
6- Cửa thoát chất tải nhiệt;
7- Cửa vào của chất tải nhiệt;
8- Cửa ra của sản phẩm;
9- Cửa thoát chất tải nhiệt

Hình 2: Nồi phản ứng – máy trộn

Ly tâm thu dịch trong:
-

Mục đích : chuẩn bị cho quá trình lên men

-

Biến đổi:
o Vật lý: tách các chất bã , tạp chất giữ độ trong và giảm khối lượng riêng cho dung
dịch.
o Hóa học: các tạp chất bị loại bỏ, giữ lại các chất hòa tan cần thiết
o Hóa lý: tách pha rắn và pha lỏng riêng biệt

Thiết bị: Nạp huyền phù từ trên vào máy ly tâm lọc khi số vòng quay của rôto giảm, sau đó tăng
số vòng quay đến trị số lớn nhất, vắt, rửa và lại vắt chất lỏng.

14


o
HÌnh 3: Thiết bị ly tâm lọc

II.2Chuẩn bị môi trường
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này có nhiệm vụ duy trì thế
oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong môi trường. Khi chuẩn bị
môi trường nuôi cấy, cần chú ý các đặc điểm sau:
-

Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết : Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham
gia vào quá trình trao đổi chất nộibào.

-

Có độ pH thích hợp

-

Có độ nhớt nhất định

-

Không chứa các yếu tố độc hại

-

Tuyệt đối vô trùng

 Nhu cầu dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường nuôi cấy phải có :
-

Glucose + NH4+ ( thành phần chính)

-

Hàng loạt các vitamin ( thiamin, acid nicotinic, biotin, acid folic…)

-

Các acid amin

 Người ta thường nuôi cấy vi khuẩn lactic trên một môi trường phức tạp chứa một
lượng khá cao nấm men, cao thịt và nước chiết cà chua.


 Nhu cầu Cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit ( glucoza, fructoza,
manoza ), các disaccarit ( saccaroza, lactoza, maltoza ) cho đến các polysaccarit ( tinh bột,
dextrin ). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào
và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ.
Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các acid
amin như acid glutamic, arginine hay tyrosine làm nguồn cung cấp năng lượng.
Nguồn C tốt nhất là các loại đường có tính khử ở lượng nhỏ do khi nhân giống, nếu sử dụng một
loại đường hiếm khi được dùng làm nguồn C thì khi đưa vào sản xuất vi khuẩn lactic có thể phát
triển hiệu quả hơn trên loại đường đó mà không ảnh hưởng đến các nguồn cacbon thông thường.
 Nhu cầu Nito
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm
bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn ni tơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy
phân casein từ sữa, pepton,…
Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy
mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém.
 Nhu cầu vitamin
Đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào
môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây,
ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…
Các loại vitamin mà vi khuẩn lactic thường cần là : riboflavin, thiamin, acid pantothenic,
nicotinic, biotin…
 Nhu cầu về muối khoáng
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần
các hợp chất vô cơ như P,S,Mg,Ca,Zn, Fe,Na,Cl. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như

đồng, sắt, natri, kali,photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa
quátrình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.

16


Bảng 4: Nồng độ cần thiết về muối khoáng của vi sinh vật
 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữucơ khác cho sự phát
triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ
Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vikhuẩn lactic như axit
xitric, axit oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic làm
thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic.
Tương tự như hai axit hữu cơ trên, axit axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh
trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng axit axetic dưới dạng các muối axetic để làm
chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của Vi khuẩn lactic
Nhiệt độ: Vi khuẩn lactic có thể phát triển tốt trong nhiệt độ từ 15-30 độ C gồm
-

Nhóm ưa ẩm : phát triển ở nhiệt độ trung bình, nhiệt độ phát triển tối ưu là 25-35 độ C

-

Nhóm ưa nhiệt: thường phát triển ở nhiệt độ tương đối cao 37-45 độ C


pH: pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn lactic trong khoảng 5.5-6.5 và bị ức chế mạnh tại
pH < 4.5
Oxy: Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí, hàm lượng Oxy lớn là chất độc đối với chúng

Độ ẩm: Nước là môi trường cho các phản ứng diễn ra trong tế bào do đó độ ẩm là yếu tố quan
trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic
Áp suất thẩm thấu: Màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm. Khi nồng độ muối trong
môi trường nuôi cấy cao (<2%) sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic.
II.3Thanh trùng môi trường:
Sau khi được pha chế, môi trường sẽ qua thanh trùng để ức chế, tiêu diệt vi sinh vật ,enzyme
trong môi trường. tạo điều kiện tốt cho giống phát triển.
Trong thực tế, tùy thuộc vào giống Vi sinh vật , thành phần hóa học của môi trường, mức độ
nhiễm vi sinh vật trong các nguyên liệu pha chế môi trường mà các nhà sản xuất sẽ đề xuất chế
độ thanh trùng thích hợp, thường áp dụng chế độ thanh trùng trong khoảng 80-90 độ C trong 3060 phút.
Thiết bị: Ống lồng ống
Thông số công nghệ: nhiệt độ 85 – 90 độ C

Hình 4: Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống

18


II.4Nhân giống
Mục đích: tăng số lượng vi sinh vật , chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy
Yêu cầu
-

Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống được thuần khiết, điều này rất quan
trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vậtlạ thì trong quá trình lên men sẽ gây hư hỏng và

-

làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho người tiêu thụ.
Chọn môi trường với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật.

Chọn phương pháp và các điều kiện nuôi tối ưu (pH, nhiệt độ, sự cung cấp oxi,...) cho

-

quá trình tăng sinh khối của giống
Số lượng tế bào trong môi trường nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng thời gian ngắn

-

nhất, với những chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lượng.
Sinh khối thu được phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp càng tốt.

Tiến hành nhân giống

Nuôi và thu nhận giống
cấp 3 (1 l môi trường) 
cấp 4 (10 l)  cấp 5 
cấp 6

Cấy
Giống VSV được bảo
quản trên thạch
nghiên tại nhà máy

Nuôi và thu nhận
giống cấp 1 (10ml
môi trường)

Nuôi và thu nhận
giống cấp 2 (100ml

môi trường)

HÌnh 5: Sơ đồ tổng quát quá trình nhân giống
(Từ cấp 1 đến cấp 4 là giai đoạn nhân giống trong phòng thí nghiệp, cấp 5 trở về sau là trong quá
trình sản xuất công nghiệp)
Để cấy giống, một lượng canh trường vi khuẩn xác định được cho vào môi trường dinh dưỡng đã
được xử lý nhiệt sau khi điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp. Để ngăn chặn những bất thường
trong canh trường, điều quan trọng nhất là lượng giống cấy, nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi
cấy phải được giữ không đổi trong suốt tất cả các giai đoạn.
Trong PTN: Giống được nhân trong các bình cầu. khi nhiệt độ khỏang 37 – 40 oC, cho canh
trường lỏng vào, tỷ lệ 5% thể tích. Giữ ở 40 – 45oC, sau 8 -10h, giống đạt yêu cầu. có thể dùng
nhân giống tiếp tục ở các thể tích lớn hơn.
Trong phân xưởng: Vi khuẩn lactic đã được nuôi cấy riêng ở phân xưởng nhân giống. Khi
lượng giống đảm bảo về số lượng tế bào( khoảng x*106 tế bào/1ml), tiến hành lên men.


2.5 Nuôi cấy
Sau khi nhân giống, ta chuyển vào thùng lên men với tỷ lệ giống là 2.5- 3%. Trong sản xuất
lactic, thường sử dụng vi khuẩn lactic lactobacillus.
Đối với vi khuẩn này, thường duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men là 400o C , pH duy trì
ở 5-6, thời gian lên men 1-8 ngày. Môi trường được khuấy trộn liên tục trong quá trình lên men.
Nhiều trường hợp có thổi khí để acid lactic tạo ra nhiều hơn.
Sử dụng thiết bị lên men bề sâu, gián đoạn

Hình 6: Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt có sức chứa 63 m2
Mô tả thiết bị
-

Dạng thiết bị này là một xilanh đứng, bằng thép X18H10T hay kim loại kép có nắp và
đáy hình nón. Tỷ lệ chiều cao và đường kính 2,6 : 1.

20


-

-

-

-

-

-

Trên nắp có bộ dẫn động cho cơ cấu chuyển đảo và cho khử bọt cơ học; ống nối để nạp
môi trường dinh dưỡng, vật liệu cấy, chất khử bọt, nạp và thải không khí; các cửa quan
sát; cửa để đưa vòi rửa; van bảo hiểm và các khớp nối để cắm các dụng cụ kiểm tra.
Khớp xả 16 ở đáy của thiết bị dùng để tháo canh trường.
Các cơ cấu chuyển đảo được gắn chặt trên 6 trục xuyên suốt bên trong, bao gồm các
tuabin 8 đường kính 600 mm ÷1000 mm với các cánh rộng 150 ÷ 200 mm được định vị
ở 2 tầng, còn tuabin hở thứ ba được gắn chặt trên bộ sủi bọt 13 để phân tán các bọt không
khí.
Bộ sủi bọt có dạng hình thoi được làm bằng những ống đột lỗ. Ở phần trên của bộ sủi bọt
có khoảng 2000 ÷ 3000 lỗ theo kiểu bàn cờ.
Động cơ - bộ truyền động làm quay trục 6 và các cơ cấu đảo trộn 8, 12, 14. Sử dụng bộ
giảm tốc và bộ dẫn động có dòng điện không đổi để điều chỉnh vô cấp số vòng quay
trong giới hạn 110 ÷ 200 vòng/ phút.
Thiết bị lên men được trang bị áo 17, gồm từ 6 ÷ 8 ô. Mỗi ô có 8 rãnh được chế tạo bằng

thép góc có kích thước 120×60 mm. Diện tích làm việc của áo 60 m2.
Bề mặt làm việc bên trong 45 m2 gồm ống xoắn 9 có đường kính 600 mm với số vít 23
khi tổng chiều cao của ruột xoắn 2,4 m.
Hoạt động được dưới áp suất dư 0,25 MPa , chịu được nhiệt độ 90-950C (phục vụ quá
trình thanh trùng)
Trong quá trình nuôi cấy, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí tiệt trùng
đến 1 (m3/phút). Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5 ÷ 6 m khi chiều cao của thiết bị
hơn 8 m.
Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ được hơi), các trục của cơ cấu chuyển đảo
phải có vòng bít kín. Các vòng bít kín được tính toán để hoạt động ở áp suất 0,28 MPa và
áp suất dư không nhỏ hơn 2,7 kPa, nhiệt độ 30 ÷ 2500C và số vòng quay của trục đến
500 vòng/ phút. Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa được sự rò rỉ môi trường hay sự
xâm nhập không khí vào khoang thiết bị ở vị trí nhô ra của trục.
Vòng bít kín khi tiếp xúc với môi trường làm việc được chế tạo bằng thép X18H10T và
X17H13M2T, cũng như bằng titan BT-10. Thời gian hoạt động ổn định của các vòng này
không nhỏ hơn 2000 h khi tuổi thọ 8000 h. Độ đảo hướng kính cho phép của trục trong
vùng đệm kín không lớn hơn 0,25 mm, độ đảo chiều trục của trục không lớn hơn 0,250


Hình 7: Sơ đồ chỉ dẫn thao tác:

1- Hơi vào;
2- Không khí tiệt trùng vào;
3- Không khí tiệt trùng hay hơi vào vùng bít
kín;
4- Thoát hơi hay không khí tiệt trùng tới bộ sủi
bọt;
5- Hơi hay không khí tiệt trùng vào thiết bị ở
phần trên;
6- Thải hơi hay không khí tiệt trùng tới bộ lấy

mẫu thử nghiệm;
7- Thải hơi hay không khí tiệt trùng;
8- Cơ cấu ống nhánh có van điều chỉnh bằng khí
động học;
9- Nạp hơi hay không khí tiệt trùng vào thiết bị
ở phần dưới;
10- Tháo nước ngưng;
11- Ap kế;
12- Van;
13- Ống tháo;
14- Van khoá;
15- Van lấy mẫu;
16- Nạp hơi hay không khí tiệt trùng khi lấy
mẫu;
17- Đoạn ống để nối áp kế kiểm tra;
18, 25- Các áp kế;

19- Van để nạp vật liệu cấy;
20- Nạp canh trường;
21, 23- Nạp dung dịch chuẩn;
22- Thải hơi hay không khí từ vùng bít kín;
24- Ống nhánh để nạp dung dịch chuẩn;
26- Cung cấp khí thải từ thiết bị;
27- Cung cấp nước;
28- Van rót;
29- Van để rót nước từ áo;
30- Van để nạp nước lạnh;
31- Ống nhánh để nạp nước lạnh;
32- Lược; 33- Ap kế; 34- Van an toàn; 35- Cảm
biến nhiệt độ;

36, 37- Các dụng cụ thứ cấp để đo nhiệt độ và
độ pH; 38- Cảm biến pH met; 39- Thiết bị lên
men;
40- Cơ cấu để làm sạch không khí

22


Thông số công nghệ: pH 4.5 ; Nhiệt độ 30-32 o C
Các biến đổi trong quá trình nuôi cấy
 Sinh học:
Pha thích nghi:
-

Vi khuẩn chưa có sự thích nghi nhưng tang rõ rệt về thể tích và khối lượng tế bào
do quá trình tổng hợp chất diễn ra mạnh mẽ
Hình thành các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp cơ chất và các enzyme
nằm trong quá trình chuyển hóa cơ chất

Pha tăng trưởng:
-

Sinh khối và khối lượng tế bào tăng rất nhanh
Xảy ra hàng loạt các quá trình biến đổi quan trọng để tạo sinh khối: tổng hợp
enzyme, chuyển hóa các hợp chất carbonhydrate, các hợp chất nito

Pha ổn định:
-

Quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế

bào chết đi  sinh khối không tăng
Nồng độ cơ chất giảm  tốc độ sinh trưởng giảm

 Vật lý
- Sự trao đổi diễn ra lien tục nên có sự tăng nhiệt độ của canh trường nuôi cấy
- pH thay đổi do xuất hiện các sản phẩm trao đổi chất
 Hóa sinh
- Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường EMP do chúng
chứa các enzyme cần thiết (kể cả enzyme aldolaza)
- Các vi khuẩn lactic dị hình do thiếu các enzyme aldolaza và
trioxophotphatizomeraza nên giai đoạn đầu của phân giải glucose xảy ra theo con
đường PP. Mục đích của quá trình là tổng hợp vật chất tế bào và năng lượng cho vi
khuẩn lactic sinh trưởng

2.6 Ly tâm
Mục đích: tách thu sinh khối
Sinh khối vi sinh vậtnên thu nhận vào đầu pha ổn định. Canh trường sau khi nhân giống
được lọc và đưa vào thiết bị ly tâm.
Mô tả thiết bị


Hình 8: Thiết bị ly tâm
Thiết bị ly tâm có hai dòng thoát: hỗn hợp canh trường được nạp vào theo ống dẫn bên
dưới thiết bị. Thông qua hệ thống kênh dẫn được tạo thành từ các lỗ trên dĩa ly tâm, dòng
giàu vi sinh vật (có khối lượng riêng lớn hơn) sẽ chuyển động về phía bên ngoài thùng
quay và theo cửa bên hông thùng để thoát ra ngoài. Dòng chứa ít tế bào vi sinh vậtdo khối
lượng riêng thấp hơn sẽ chuyển động về phía trục quay rồi thoát ra khỏi thiết bị theo cửa
trên đỉnh thùng
2.7Sấy thăng hoa
-

Mục đích: thu hoạch (chế phẩm vi sinh vật dạng hạt), bảo quản.
Phương pháp thực hiện: sấy thăng hoa

Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm từ các sản phẩm bằng phương pháp lạnh đông và tiếp
theo là chuyển đá làm lạnh đông được tạo thành trong sản phẩm thành hơi, qua pha loãng
ngắn ngủi khi đun nóng sản phẩm trong chân không. Khi sấy thăng hoa, ẩm chuyển dời
trong sản phẩm ở dạng hơi không kéo theo nó những chất trích ly và những vi sinh vật.
Thường khi sấy thăng hoa các vật liệu vi sinh, áp suất dư 133,3Pa - 13,3 Pa, và nhiệt độ
của vật liệu bắt đầu sấy bằng -20o C tới -30o C. Khi độ ẩm của sản phẩm bị giảm xuống tối
thiểu, nhiệt độ của vật liệu tăng đến 30o C, 40o C. Điều kiện sấy như thế bảo đảm quá trình
oxy hoá tối thiểu của sản phẩm do hàm lượng oxy không đáng kể trong môi trường khí của
phòng sấy.
Mô tả thiết bị


Hình 9 : Thiết bị sấy thăng hoa tuần hoàn
-

-

-

-

-

Thiết bị này gồm phòng sấy hình trụ kín (nồi thăng hoa) (1), ở trong có giàn ống
rỗng 2, vật liệu sấy cho vào đây. Nồi thăng hoa làm việc một cách tuần hoàn như
một phòng lạnh. Ở chế độ làm lạnh, bơm 5 đẩy tác nhân lạnh ở bên trong ống rỗng

(2).
Sự làm lạnh của chất tải nhiệt được tiến hành trong bộ trao đổi nhiệt (3) có đính
ruột xoắn, chất làm nguội đi qua đó và vào thiết bị làm lạnh (4). Khi nồi thăng hoa
làm việc ở chế độ của máy sấy, chất tải nhiệt được đun nóng trong bộ trao đổi nhiệt
(7) và đẩy vào các ống rỗng nhờ bơm (6).
Sự ngưng tụ hơi được tạo ra khi sấy trong nồi thăng hoa được tiến hành trong nồi
ngưng tụ chống thăng hoa (10). Nó là một bộ trao đổi nhiệt, hỗn hợp hơi - không
khí từ nồi thăng hoa vào không gian giữa các ống của bộ trao đổi nhiệt.
Chất làm nguội (amoniac, freon) qua các ống (11) của nồi chống thăng hoa vào
thiết bị làm lạnh (9). Thường để làm lạnh bề mặt thăng hoa và ngưng tụ, người ta
sử dụng máy nén 2 hoặc 3 cấp có khả năng đảm bảo lạnh bề mặt đến nhiệt độ − 600
C, − 400 C.
Các khí chưa ngưng tụ được tách ra khỏi nồi chống thăng hoa bằng bơm chân
không (8). Hơi ngưng tụ được làm lạnh ở dạng lớp đá trên bề mặt các ống lạnh của
nồi chống thăng hoa. Vì trong quá trình làm việc của nồi chống thăng hoa, các ống
(11) bị phủ bởi một lớp đá đáng kể, nên cần làm tan băng một cách chu kỳ. Để thực
hiện điều đó, đẩy nước nóng từ bộ đun (7) vào các ống (11).

Thông số công nghệ
-

Độ ẩm 5-12%
Nhiệt độ chất tải nhiệt 130o C - nhiệt độ sản phẩm sấy ≤ 50o C
Thời gian có mặt của sản phẩm trong máy sấy từ 40 đến 110 phút, nhiệt độ cao nhất
của sản phẩm cuối quá trình sấy nhỏ hơn 27o C.