Bài tiểu luận tìm hiểu quy trình lên men glucozo

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Mục lục
Lời nói đầu..............................................................................................................................................1
Tài liệu tham khảo................................................................................................................................10

Lời nói đầu

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức độ
công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được là các
chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công
nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học. Nhật là
một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20 công ty sản xuất chế
phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase, 8906 tấn protease, 2200
tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác … Ở các nước phát
triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất
enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh.
Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi
nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế tác
dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại α –
amylase, β – amylase, γ – amylase hay glucosamylase, oligo – 1,6 – glucosidase,
transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp
thực phẩm.
Hiện nay Glucoamylase là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất
công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm.
Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là α –
glucose, nên Glucoamylase được sử dụng trong quy trình sản xuất α – glucose.
Glucose có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho
1

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng
Glucoamylase trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các
loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất
và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn
malt nguyên liệu như Việt Nam.

I.
1.

Tổng quan về nguyên liệu
Enzyme glucoamylase
Giới thiệu chung

Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ
Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó được tìm thấy ở
Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh vật
khác cũng như ở mô động vật.
Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao
động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme. Các
glucoamylase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng
thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Glucoamylase I tự hấp
thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại glucoamylase II không có cả
hai tính chất này.
1.1

Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase

Glucoamylase I và glucoamylase II. Cả hai dạng glucoamylase đều là những
chuổi
glyco – protein, trong phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D –
galactose, thành phần carbonhydrate trong phân tử glucoamylase I chiếm khoảng
18%, còn với phân tử glucoamylase II là 10%.
Phân tử carbonhydrate tham gia trong thành phần cấu tạo enzyme
glucoamylase đóng vai trò giúp ổn định cấu trúc enzyme. Ngoài ra chúng còn giúp
tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide giúp cho vùng xúc tác trên
enzym gần với cơ chất hơn, do đó quá trình thủy phân của enzyme thuận lợi hơn.
Thành phần acid amine tham gia tạo thành chuổi polypeptid trong phân tử
glucoamylase cũng khác nhau khi enzyme glucoamylase được thu nhận từ các
nguồn khác nhau
2


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Số lượng acid amine tham gia vào chuổi polypeptid cấu tạo nên phân tử
glucoamylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus awamori
khoảng 650 – 700 acid amin.
Các acid amin chính tham gia trong trung tâm hoạt động của enzyme
glucoamylase bao gồm acid glutamic, tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic,
lysin, serin. Trong đó acid glutamic ở vị trí thứ 179 và 400 đóng vai trò chính trong
việc xúc tác thủy phân liên kết O – glucozit của cơ chất.

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase
1.2.

Cấu trúc không gian enzym glucoamylase

Trong không gian, phân tử glucoamylase được chia làm ba vùng với chức
năng riêng biệt:
-

Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích thước khoảng 30 A 0.
Giữ chức năng liên kết với phân tử cơ chất.
Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A 0, giữ chức năng xúc tác
phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit.
Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng trên lại với nhau.

3


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase
1.3
Các tính chất của glucoamylase
• Enzym glucoamylase có mã số EC: 3.2.1.3
• Tên khoa học: glucan 1,4 – α – glucohydrolase

Ngoài ra enzym glucoamylase còn có các tên gọi khác như:
amyloglucosidase;

γ – amylase; lysosomal α – glucosidase; acid maltase;
exo – 1,4 – α – glucoside; glucose amylase; γ – 1.4 – glucan glucohydrolase.
Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên
kết
1,4 – 1,6 o – glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu
không khử của chuỗi polysaccharide.
Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và tách tuần tự
từng gốc glucose từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Gốc gluco từ đầu
không khử được gọi là glycone, còn chuổi oligosaccharide sau khi gluco được tách
ra thì được gọi là Alglycone.
Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit là do hoạt động chủ yếu của
một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất,
acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton
hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucozit). Acid glutamic ở vị
trí thứ 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo
liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ
tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucozit của phân tử
cỏ chất sẽ bị phá vỡ.
1.4
I.4.1.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase
Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của
enzym, khi tăng nhiệt độ lên 100C thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên gấp
đôi, nhưng khi tăng nhiệt độ lên quá cao vượt quá nhiệt độ tối ưu thì enzyme bắt
đầu biến tính, do đó vận tốc phản ứng của enzyme cũng giảm xuống. Mỗi enzyme
4

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

sẽ hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, enzyme glucoamylase hoạt động
trong khoảng 200C – 750C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym
glucoamylase: 400C – 650C.
1.4.2

pH

pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzym, là do pH
thay đổi có ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa tham gia trong trung tâm hoạt động
của enzym như nhóm α – COOH, ω – COOH, – NH2, – OH. Vòng imodazol…
cũng như trạng thái ion hóa của cơ chất và của phức chất trung gian ES.
Khoảng pH mà enzym glucoamylase hoạt động được là từ 2 – 8, pH tối ưu:
4 – 5.5
1.4.3

Các chất ức chế

Enzyme glucoamylase sẽ bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Hg2+, Pb2+,
Ni2+,Cu2+. Ngoài ra, khi cơ chất là tinh bột thì schardinger dextrin sẽ hoạt động như
một chất ngăn cản khả năng taog phức hợp giữa enzyme glucoamylase và tinh bột.
với cơ chất là maltose thì trong môi trường có sự hiện diện của gentitobiose,
mantitol với nồng độ khoảng 20mM sẽ ức chế hoạt động của enzyme glucoamylase
1.4.4

Các chất hóa học

Khi cho thêm vào môi trường phản ứng các dung môi như: chloroform,
hexane, n – deoecane với nồng độ khoảng 50% sẽ làm tăng hoạt tính glucoamylase
lên 2 lần so với môi trường chỉ có nước là chất dung môi duy nhất. Các chất 2,2’ –
dipyridyl, iodoacetamyde sẽ làm tăng hoạt tính enzym glucoamylase.
1.5.

Tính chất của glucoamylase
Cơ chế tác động

Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn –
1,6 glucoside của phân tử tinh bột.

Hình 1.3: Sơ đồ phân giải của enzyme glucoamylase
Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside
glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực
xúc tác thuỷ phân tinh bột. Vì thế việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các chủng
vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có một ý nghĩa triển vọng
rất lớn. Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không
5


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

khử của chuỗi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là glycone,
chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone.
Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O – glucoside là do hoạt động chủ yếu của
một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất,

acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton
hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucoside). Acid glutamic ở vị
trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên
kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn
công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucoside của phân tử cơ
chất sẽ bị phá vỡ.
Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp,
liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose. Glucoamylase thuỷ
phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt ở các liên – 1,4 và – 1,6
glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, chuyển những dextrin
có phân tử lượng cao không lên men thành những hợpchất lên men được và do đó
nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu là tinh bột.
Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật tuy
có những điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau. Ngay cả
các chế phẩm được tách từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng khác nhau,
thậm chí ngay cả các chủng cùng loài cũng khác nhau về các đặc điểm về tính chất
lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu với cơ chất và điều kiện
hoạt động. Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và
polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy rằng sự
thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải theo cơ
chế đơn mạch. Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase:
Glucoseamylase kiểu Asp.niger khác nhau

Tinh bột hay
Phản ứng cho ra 80 – 85 % glucose
oligosaccharide

1.6.

Glucose

Ứng dụng của enzym glucoamylase

Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … được thay
thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu
có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được
hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.
Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai
trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, do đó cần
chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều enzym glucoamylase. Trong sản
xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt của Aspergillus
Usamii và Aspergillus Balatae.

6


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Nếu coi tổng lượng đường maltose, glucose, saccharose, fructose là 100%
thì khi đường hóa bằng malt ta có 71% maltose, 24 – 28% glucose, còn khi đường
hóa bằng amylase nấm mốc sẽ có 14 – 21% maltose, 80 – 85% glucose, sản phẩm
cuối cùng của sự thủy phân bởi amylase nấm mốc chủ yếu là glucose – đường dễ
lên men, do vậy sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn
Glucose được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như y học, trong công
nghiệp thực phẩm. ngày nay việc sản xuất glucose đa số được sử dụng công nghệ
enzyme. Enzyme glucoamylase là enzyme chủ yếu cho quá trình đường phân tinh
bột để tạo thành glucose. Tinh bột có chỉ số DE khoảng 4 – 8, sau khi thủy phân
bằng enzyme glucoamylase thì chỉ số DE tăng lên 96 – 98. Dung dịch sau thủy

phân có thể trực tiếp được sử dụng để sản xuất siro giàu fructose hoặc là sản xuất
glucose ở dạng tinh thể.
Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase còn được bổ sung vào
một số loại thuốc giúp tăng khả năng tiêu hóa cho cơ thể.
Ngày nay, enzyme glucoamylase còn được sử dụng kết hợp với các enzyme
cellulase và protease dưới dạng canh trường nấm mốc bổ sung vào trong thức ăn
gia súc, làm tăng quá trình đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh hơn.
2.
2.1.

Nấm mốc Aspergillus niger
Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger

Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên,
trong đó có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,…có
giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ…
Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc
Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cố,
hạt bắp…; Aspergillus niger cũng được phân lập từ các sản phảm lên men cổ
truyền
2.2.

Vị trí phân loại của Aspergillus niger

Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901
Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này.
Raper and Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài
tạo thành bào tử trần. Như vậy Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau:
Bảng 1.1: Phân loại Aspergillus niger
Giới Fungi

7


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Lớp Fungi
imperfecti
Bộ
Moniliales
Họ Aspergillaceae
Loài Aspergillus
niger
Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính không nằm tron bọc bào tử,
cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọc lớn hình cầu 5 – 6 x 20 –
30µm, đôi khi 6 – 10 x 60 – 70µm màu nâu đen

Hình 1.4: Nấm mốc Aspergillus Niger
2.3.

Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 – 80C và tối đa là
45 – 470C, tối ưu ở 28 – 350C, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm
môi trường thích hợp để lên men bán rắn của Aspergillus niger là 60 – 65%, nó chỉ
sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4 – 6.5, cũng có những
chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2. Sự thay đổi pH của môi trường
nuôi cấy từ 3 đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus niger.

8


Enzyme Glucoamylase
2.4.

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger

Asp.niger có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản sinh dưỡng, sinh sản
vô tính bằng bào tử hoặc sinh sản hữu tính.
2.4.1.
•

Điều kiện sinh trưởng

Nhiệt độ

Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu là 28 – 320C, trong quá trình sinh
trưởng và phát triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng và thải ra một lượng
nhiệt khá lớn. Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải có những trang thiết bị phù
hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường.
UI (Hoạt độ enzyme)

t0
•

Hình 1.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme glucoamylase
Độ ẩm

Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 65 – 70%. Tuỳ theo điều
kiện khí hậu và điều kiện vô trùng của mỗi phòng thí nghiệm của mỗi quốc gia mà
lựa chọn độ ẩm cho thích hợp, độ ẩm thường khống chế ở 50 – 60%, thường sử
dụng 58 – 60%. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp
hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự
tạo Enzyme Glucoamylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình
tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Glucoamylase cao nhất thu ở độ
ẩm 65 – 68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt
đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn
nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và
9


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi
lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme.
•

pH

Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt thì pH ít ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc, thường người ta sử dụng pH tự nhiên vào
khoảng 5.5 – 6.
UI (Hoạt độ enzyme)

pH

•

Hình 1.6:Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme glucoamylase
Cung cấp Oxy

Trong quá trình phát triển và tích tụ enzyme nấm mốc rất cần oxy, khi nuôi
cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí
qua hệ thống sợi tơ và micell vì thế đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc
tạo nhiều hệ sợi và tích luỹ nhiều enzyme. Nếu môi trường dính bết, không đủ độ
xốp, không khí sẽ ít tiếp xúc vi sinh vật xảy ra hô hấp yếm khí ảnh hưởng đến việc
tích luỹ enzyme. Độ hoà tan của oxy vào môi trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều
yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp thổi khí, nhiệt độ cao thì khả năng
hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hoà tan của oxy, ngược
lại cũng có một số yếu tố làm tăng khả năng hoà tan của oxy: ete, rượu, acid hữu
cơ…
I.4.2. Nguồn cơ chất
• Nguồn C

10


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit
Đối với các hệ vi sinh vật sinh enzyme amylaza: Tinh bột, dextrin, maltoza
vừa là chất cảm ứng vừa là nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng hợp amylaza. Khi
nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nếu dùng cám thì không cần bổ sung tinh bột,
ngoài cám có thể dùng bột ngô, bột mì, bo bo. Cần chú ý trong đa số trường hợp,

một số loại đường điển hình, nhất là glucose lại kìm hãm sinh tổng hợp các
enzyme thủy phân nói chung (chẳng hạn theo cơ chế trấn áp phân giải do làm giàu
lượng AMPV trong tế bào)
Ngoài nguồn gluxit là chủ yếu còn phải kể đến các nguồn cacbon khác như:
‒ Các axit béo phân tử lượng lớn (Oleic, stearic, miniotic). Ví dụ: axit oleic
có tác dụng kích thích tổng hợp glucoamylaza lên 2.5 – 3.5 lần so với nồng độ
thích hợp 2 – 3%.
‒ Etanol và glyxerin trong nhiều trường hợp nuôi cấy được dùng làm
cacbon bổ sung.
•

Nguồn Nitơ
Ở nhiều loại nấm mốc, nguồn nitơ tốt nhất là NaNO3 và NH4NO3, nhưng khi nồng độ nitơ dưới
0.05% nấm mốc vẫn phát triển được nhưng sinh tổng hợp amylaza rất kém. Các muối amoni vô cơ, một
số nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, cazein, cao ngô) cho hiệu quả sinh tổng hợp amylaza thấp.
Trong thực tế, người ta thường dùng nguồn nitơ là các axit amin có nguồn gốc từ dịch thủy phân
protein (dịch tự phân nấm men, nước chấm, cao ngô, dịch chiết malt), đây vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn
cacbon và chất cảm ứng sinh enzyme. Các axit amin có tác dụng tốt nhất trong những trường hợp này là
asparagin, axit glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thậm chí là ức chế thì dịch thủy
phân casein lại cảm ứng sinh tổng hợp amylaza lên gấp 2 lần so với ban đầu.
Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt cho nuôi cấy vi sinh vật hơn cả. Các muối
amon và nitrat khác đều làm giảm hoạt lực enzyme.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt nhất đến quá trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật nói chung.
Nhiều acid amin lại có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme như valin, axit glutamic, izolơxin, treonin.
•

Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng

Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật, đặc biệt là đối với
các quá trình sinh tổng hợp các enzyme kim loại. Để sinh tổng hợp glucoamylaza,

nồng độ MnSO4 thích hợp nhất là 0.05%. Nếu thiếu muối này và muối photphat
kali thì vi sinh vật không thể sinh tổng hợp được dextrinaza. Hoạt lực
glucoamylaza được nâng cao ở nồng độ KCl 0,05%
Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở
nhiệt độ cao.

11


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Lưu huỳnh S với nguồn chủ yếu là các axit amin chứa S như metionin,
cystein, sistin, và các muối sunphat (CuSO4). Các muối khoáng có Fe, Mn, Zn, B,
Mo, Cu ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Trong đa số trường hợp
biotin (vitamin H) và một số vitamin cũng rất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp
enzyme.
2.5.

Tiêu chí chọn giống

Giống nấm mốc sử dụng phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được
phép sử dụng.Các yếu tố cơ bản đối với giống nấm mốc sử dụng lên men thu nhận
chế phẩm glucoamylase gồm:
-

Giống nấm mốc phải có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase mạnh, sản phẩm này phải
có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm từ các giống nấm mốc khác.

Hình 1.7: So sánh hoạt tính enzyme glucoamylase sinh ra từ các giống nấm mốc khác nhau
-

-

Giống phải có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy hoạt
động, các phụ phẩm của các nhà máy.
Chế phẩm enzyme cần thu nhận do giống đang áp dụng trong sản xuất phải dễ dàng tách ra khỏi
các tạp chất môi trường và sinh khối của nấm mốc giống.
Giống nấm mốc sử dụng phải là chủng thuần khiết, không nhiễm các sinh vật lạ.
Giống phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp,
trong đó có sự ổn định về nhiệt độ, pH, độ ẩm…
Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp.
Tính chất này rất quan trọng vì khi nhiễm các vi sinh vật lạ thì giống dung trong sản xuất phải có
khả năng lấn át sự phát triển của vi sinh vật lạ.
Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn, giúp ta tăng nhiều chu kỳ sản
xuất.
Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản, ít bị thoái hóa

12


Enzyme Glucoamylase

3.

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Môi trường lên men

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo
Glucoamylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo
enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo glucoamylase đều hấp
thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng
H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi
trường và ở dạng oxy phân tử.
Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Glucoamylase bằng phương
pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn
hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần
bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16 – 22% tinh bột, 10 – 12% protein,
trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%),
arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose,
các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P – 0.94%) và các nguyên
tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất
béo, 10 – 14% protein, 8 – 16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 –
59%).
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của cám mì
Thành phần
% Khối lượng
Độ ẩm
13
Tinh bột
16 – 22
Protein thô
10 – 12
Béo thô
3–4
Xơ thô
10 – 11
Canxi

0.16
Phospho tổng
0.94
Natri
0.09
K
1

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của cám gạo
Thành phần
% Khối
lượng
Tinh bột
20
Chất béo
10 – 15
Protein
10 – 14
13


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Cellulose
Cấu tử hòa tan không chứa
Nito

8 – 16

37 – 59

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme.
Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không
có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp
chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám
cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, các chất dinh
dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền
hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20%), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 –
10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử
chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và
các chất phụ gia chứa nhiều bào tử vi sinh vật khác nên cần phải tiệt trùng để đảm
bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh
vật ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 5atm trong vòng 4 – 6 giờ, có
thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho
vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường.
Tiêu chuẩn chọn nguyên liệu: Tiêu chuẩn chất lượng cám mì, cám gạo theo
qui định của Bộ Nông nghiệp – phát triển nông thôn.
•
•
•

Độ ẩm: < 12%
Không mùi chua mốc
Độc tố Aflatoxin: không quá 50 ppb
Tỉ lệ cám mì/Cám gạo = 7/3
Bảng 1.4: Thành phần dinh dưỡng của hỗn hợp nguyên liệu cám gạo – cám mì

Thành phần dinh dưỡng

% Khối lượng

Độ ẩm
Protein thô
Xơ thô
NDF (Hàm lượng chất xơ trung tính)
ADF (Hàm lượng xơ acid dễ tiêu hóa)
Hàm lượng tro và khoáng

11
16.5
9.75
42
16
4.75

Bảng 1.5: Chỉ tiêu nước sạch trong công nghiệp
•
-

Chỉ tiêu vật lí
Mùi vị
Độ trong (ống Dienert)

•
-

Tiêu chuẩn
Không mùi
100 ml

14


Enzyme Glucoamylase

•
•

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

-

Màu sắc (thang màu Coban)

•
-

Chỉ tiêu hoá học
pH
Độ cặn cố định (đốt ở 600C)
Độ cứng toàn phần (độ Đức)
Độ cứng vĩnh viễn
CaO
MgO
Fe2O3
MnO
BO4-3
SO4-2
NH4+

NO2NO3Pb
As
Fe
Zn

•
-

Chỉ tiêu vi sinh vật
Tổng số vi sinh vật hiếu khí
Chỉ số Coli
Vi sinh vật gây bệnh

-

50
-

-

6 ÷ 8,5
75 ÷ 150 mg/lít
Dưới 150
70
50 ÷ 100 mg/lít
50 mg/lít
0.3 mg/lít
0.2 mg/lít
2.5 mg/lít
0.5 mg/lít

0.3 mg/lít
Không có
Không có
0.1 mg/lít
0.05 mg/lít
0.3 ÷ 0.5 mg/lít
5.00 mg/lít
Dưới 100 cfu/ml
Dưới 20 cfu/ml
Không có

Các chất bổ sung môi trường lên men bán rắn:
K2HPO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, NaNO3
Chất độn: Mùn cưa

Bảng 1. 6: Hàm lượng các chất bổ sung trong nguyên liệu
Chất bổ sung
K2HPO4
MgSO4
NaNO3
FeSO4.7H2O
Mùn cưa

% (Khối lượng)
0.001
0.005
0.9
0.1
10

Bảng 1.7: Chỉ tiêu cho phép của MgSO4

Độ tinh khiết
Asen
Selen

> 99.5 %
< 3 ppm
< 30ppm
15


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Chì

< 10 ppm

Bảng 1.8: Chỉ tiêu cho phép của KH2PO4

Độ tinh khiết
Asen
Flo
Clo
Sulfate
Sắt
Chì

> 98 %

< 3 ppm
< 10 ppm
< 0.03%
<0.1 %
<0.003 %
< 5 ppm

Bảng 1.9: Chỉ tiêu cho phép của FeSO4.7H2O

Độ tinh khiết
Asen
Thủy ngân
Chì
4.

> 99.5 %
< 3 ppm
< 3 ppm
< 10 ppm

Phương pháp nuôi cấy

Ở đây, ta sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt
Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường rắn hoặc lỏng (vì vậy còn gọi là phương pháp nổi). Các môi trường rắn
trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm. Thường dùng cám, đôi khi dùng
gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô…hoặc hỗn hợp những
nguyên liệu này.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật mà trong
đó vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay phát triển trên hạt, trên môi

trường bán rắn.
Nguyên liệu dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này thường là
môi trường cám trấu, cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của
môi trường từ các nguyên liệu trên, người ta thường bổ sung vào các thành phần
làm xốp như trấu, lõi ngô được làm nhỏ. Tuy nhiên, các thành phần trên là các
thành phần chứa rất ít chất dinh dưỡng vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường
một lượng phụ liệu trong khoảng 15 – 20%. Mặc khác, để tăng cường quá trình
sinh tổng hợp enzyme thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những
chất cảm ứng để cảm ứng tổng hợp enzyme.

16


Enzyme Glucoamylase

II.

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Quy trình công nghệ

Nguyên
liệu
Trộn
Tiệt trùng
Cấy giống

Nấm
mốc
Nhân

Lên men
Nghiền
Nước

Chất
độn
Bao bì

Trích li

Bã

Li tâm
Siêu lọc UF

Bã

Sấy thăng hoa
Phối trộn
Đóng gói
Chế phẩm enzyme
17


Enzyme Glucoamylase

1.

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Trộn

Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men
Quá trình trộn làm cho nguyên liệu phân tán đều vào nhau, đảm bảo thành
phần dinh dưỡng ở mọi vị trí là gần như nhau để thích hợp cho vi sinh vật sử dụng.
Các biến đổi của nguyên liệu: do đây là quá trình phối trộn vật liệu rời nên
trong quá trình phối trộn thường không tạo ra biến đổi nào đáng kể.
•
•
•
•
•

Vật lí: nhiệt độ môi trường tăng
Hóa học: thành phần hóa học của môi trường thay đổi
Hóa lí: không có biến đổi đáng kể.
Hóa sinh: phản ứng do enzyme xúc tác
Sinh học: Hỗn hợp cám mì, cám gạo là môi trường giàu dinh dưỡng thích hợp cho vi
khuẩn, nấm mốc phát triển nên trong quá trình phối trộn có thể bị nhiễm vi sinh vật
Thiết bị: thiết bị phối trộn dạng thùng quay

Hình 2.1: Thiết bị phối trộn dạng thùng quay

Thiết bị trộn dạng thùng quay, bên trong thùng có thể lắp thêm các thanh
chặn để làm tăng hiệu quả của quá trình phối trộn. Nguyên liệu thường được cho
vào với thể tích khoảng 50 – 60% thể tích thùng, rồi điều chỉnh tốc độ quay của
thùng và thời gian phối trộn cho phù hợp
Thông số công nghệ:
2.

Tỉ lệ phối trộn: cám mì/cám gạo = 7/3
Tốc độ quay của thùng = 1/2 tốc độ giới hạn (tốc độ mà vật liệu bắt đầu di chuyển trên
thành thùng do lực ly tâm)
Nhiệt độ phối trộn: 28 – 30oC
Thời gian phối trộn: 15 phút

Tiệt trùng

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men
18


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Quá trình tiệt trùng sẽ làm giảm lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu, tức
là giảm các yếu tố cạnh tranh và các yếu tố làm thay đổi thành phần dinh dưỡng
môi trường lên men, nhằm tạo điều kiện tốt cho Aspergillus Niger phát triển và tạo
hệ enzyme glucoamylase
Các biển đổi của nguyên liệu:
-

-

Vật lí: trong quá trình tiệt trùng, biến đổi vật lý quan trọng nhất là sự tăng nhiệt độ của nguyên
liệu, có sự giảm nhẹ khối lượng do sự bay hơi nước trong nguyên liệu.
Hóa học: các phản ứng hóa học xảy ra dưới tác dụng của nhiệt độ như phản ứng Maillard, oxy
hóa chất béo, phân hủy một số vitamin… nhưng mức độ các phản ứng xảy ra không đáng kể.

Hóa lí: biến đổi hóa lý chủ yếu trong quá trình tiệt trùng nguyên liệu là sự bay hơi nước, tuy
nhiên độ ẩm ban đầu của nguyên liệu cũng không quá cao nên mức độ bay hơi nước cũng không
đáng kể.
Sinh học: dưới tác dụng của nhiệt độ cao các vi sinh vật sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt. đây chính là
mục đích chính của quá trình.
Hóa sinh: nhiệt độ cao sẽ làm biến tính bất thuận nghịch các enzyme có mặt trong nguyên liệu, do
đó chúng sẽ bị vô hoạt.

Thiết bị: Thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang

Hình 2.2: Thiết bị thanh trùng dạng nằm ngang
1 – Vỏ; 2 – Khớp nối để nạp hơi; 3 – Cửa để nạp nguyên liệu; 4 – Van không
khí; 5 – Trục nối các cánh; 6 – Khớp nối để mở nước rửa; 7 – Cửa tháo liệu; 8 –
Áo nước; 9 – Khớp nối để tháo nước ngưng; 10 – Khớp nối để thải hơi trong áo tơi
Trong công nhiệp vi sinh để tiệt trùng các môi trường dinh dưỡng dạng rời,
người ta sử dụng rộng rãi các thiết bị tiệt trùng hình trụ dạng nằm ngang có áo hơi.
Bên trong thiết bị tiệt trùng được bố trí hai trục với các cánh có thể quay một góc
độ nào đó để dễ dàng điều chỉnh.
Điều đó cho phép xác định khe hở cần thiết theo hướng kính giữa các cánh
và thành tường của thiết bị, nó phụ thuộc vào các tính chất hoá lý của các cấu tử và
thành phần của môi trường. Các trục quay theo các hướng khác nhau làm cho môi
trường chuyển đảo liên tục trong những hướng đối nhau. Loại cấu tạo này sẽ đảm
bảo sự đảo trộn môi trường, làm giảm đáng kể sự vón cục và đảm bảo sự đồng nhất
19


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

môi trường có thành phần nhiều cấu tử. Điều đó có ảnh hưởng tốt tới quá trình
nuôi cấy.
Hơi có áp suất 0,2 MPa cho vào áo tơi để làm tăng nhanh quá trình đun nóng
môi trường. Môi trường được giữ ở chế độ tiệt trùng đã cho khi khởi động chu kì
các cơ cấu chuyển đảo. Sau khi tiệt trùng, môi trường sẽ được làm nguội về 38 –
400C và thoát liệu ra ngoài. Tiến hành tháo môi trường dinh dưỡng đã được tiệt
trùng qua cửa tháo liệu bên dưới. Cửa tháo liệu có các nắp trong và ngoài được lắp
chặt bằng các vít. Ngoài ra, thiết bị tiệt trùng còn có các cửa nạp liệu, nhiều khớp
nối để nạp hơi và thải nước ngưng, để nạp và thải nước làm lạnh, cho các dụng cụ
kiểm tra và điều chỉnh nhiệt độ, áp suất và có van bảo hiểm.
Thông số công nghệ:
- Nhiệt độ: 1210C
- Thời gian: 20 – 30 phút
3.
Quá trình nhân giống

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình cấy giống, thu nhận bào tử vi
sinh vật chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase.
Các biến đổi trong quá trình nhân giống:
-

-

Sinh học: vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất và sinh sản tạo ra nhiều tế bào mới.
Hóa sinh: các phản ứng hóa sinh xảy ra bên trong và ngoài tế bào, hầu hết chúng đều có liên quan
đến sự trao đổi chất của tế bào. Các phản ứng này được chia làm hai nhóm:
• Phản ứng dị hóa: chuyển hóa cơ chất phức tạp thành cơ chất đơn giản hoặc phân giải cơ chất
để tạo ra năng lượng sinh học.
• Phản ứng đồng hóa: tổng hợp các polymer sinh học của tế bào từ các hợp chất đơn giản và
năng lượng do dị hóa cung cấp.

Vật lý: có sự tăng nhiệt độ canh trường, do trong quá trình sinh trưởng một phần năng lượng sẽ
được vi sinh vật thải ra bên ngoài tế bào dưới dạng nhiệt năng.

Nhân giống bao gồm 2 quá trình:
•
•

Trong phòng thí nghiệm: Ở số lượng nhỏ. Môi trường nhân giống được đưa tiệt trùng,
sau đó cấy giống vi sinh vật vào môi trường và cho sinh trưởng ở điều kiện bình thường.
Trong phân xưởng: Ta sử dụng thiết bị lên men hình trụ, có cánh khuấy, bộ phận sục khí
và lớp vỏ điều nhiệt.

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nhân giống
Cơ chất
Hàm lượng
Pepton
5g/l
Glucose
10g/l
(NH4)2SO4
5g/l
MgSO4.7H2O
2g/l
CaCl2.H2O
2g/l
KH2PO4
1,5g/l
K2HPO4
0,1g/l
20

Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Nước cất

1000ml

Thông số công nghệ:
4.

• Nhiệt độ môi trường: 28 – 32oC
• Độ ẩm môi trường: 60 – 65%
Cấy giống

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men thu nhận chế phẩm
enzyme glucoamylase
Các biến đổi của nguyên liệu: Không có biến đổi đáng kể.
Thiết bị: Thiết bị phun bào tử vi sinh vật
Môi trường sau khi được xử lý sẽ được phân phối vào các khay rồi được đưa
vào một thiết bị kín có băng tải, các khay di chuyển trên băng tải, giống được cấy
vào môi trường bằng cách phun bào tử lên bề mặt môi trường nhờ hệ thống vòi
phun ở phía trên.
Thông số công nghệ:
5.

Tỉ lệ giống cấy: 5 – 10% v/v
Lên men

Mục đích công nghệ: Khai thác, lên men nhằm thu nhận chế phẩm enzyme
glucoamylase
Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men:
-

-

-

Sinh học: biến đổi sinh học quan trọng trong quá trình lên men là sự trao đổi chất và sự sinh
trưởng của nấm mốc. Chúng sẽ tiết enzyme phân giải cơ chất trong môi trường tạo nguyên liệu
phục vụ cho việc xây dựng tế bào và sản sinh năng lượng trong hoạt động trao đổi chất.
Hóa học và hóa sinh:
Hóa lý: một số biến đổi về pha trong quá trình lên men như sự hòa tan một phần oxy do việc sục
khí và khuấy trộn canh trường, khí CO2 do vi sinh vật thải ra trong quá trình phân giải cơ chất
cũng sẽ hòa tan một phần trong canh trường….
Vật lý: sự tăng nhiệt độ canh trường do năng lượng được thải ra từ hoạt động sống của vi sinh
vật, sự thay đổi về tỷ trọng, khối lượng….

Quá trình nuôi cấy nấm mốc thường kéo dài từ 35 – 48 giờ tùy thuộc vào
thời gian hoàn thành việc tạo ra enzyme. Ở một số loài Aspergillus, sự tạo thành
lượng enzyme tối đa sẽ trùng với sự bắt đầu tạo ra đính bào tử, do đó cho ngừng
quá trình phát triển vào lúc này là thích hợp. trong một số trường hợp khác, sự tích
lũy enzyme còn tiếp tục được kéo dài trong cả thời gian tạo ra đính bào tử một
cách mạnh mẽ. và canh trường nấm mốc hoạt động kiểu này thường có nhiều đính
bào tử. do đó khi sấy, nghiền và bao gói sẽ làm cho không khí bị nhiễm bởi đính
bào tử của chủng đó. Để tránh hiện tượng này, tất cả các thiết bị phải kín và có cơ
cấu hút bụi. tốt hơn cả là trong sản xuất enzyme, chọn những biến chủng tạo đính
bào yếu.

21


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Toàn bộ chu kì sinh trưởng của Aspergillus Niger trên cám có thể chia làm 3
thời kỳ:
-

-

-

Trong 10 – 14 giờ đầu, xảy ra sự trương đính bào tử và bắt đầu mọc nấm. Trong thời kỳ này
phòng nuôi cấy cần giữ ở nhiệt độ không dưới 28 – 300C, để không kiềm hãm sự phát triển ban
đầu của chúng.
Qua thời gian trên, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh. Thời kỳ này kéo dài trong khoảng 14 –
18 giờ. Aspergillus niger phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng lớn các chất dinh dưỡng, hô hấp
rất mạnh và một lượng lớn lượng nhiệt tỏa ra nhiều. Vì vậy trong lớp canh trường nhiệt độ tăng
lên đến 37 – 400C và có thể còn cao hơn tùy thuộc vào độ dày của lớp. Do đó cần phải thổi không
khí điều tiết có nhiệt độ không thấp hơn 28 – 290C và có độ ẩm tương đối cực đại vào.
Thời kỳ thứ 3 kéo dài trong 10 – 20 giờ. Trong thời kỳ này, quá trình trao đổi chất xảy ra không
mạnh mẽ lắm và dần dần yếu đi, lượng nhiệt thoát ra bé hơn, nhưng sự tạo thành enzyme có thể
còn xảy ra. Phụ thuộc vào tính chất sinh lý của chúng và sự kết thúc sinh tổng hợp enzyme, mà có
thể làm ngừng sự phát triển của Aspergillus niger vào một thời gian bất kỳ.

UI (Hoạt độ enzyme)

Thời gian (h)
Hình 2.2: Mối quan hệ giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ enzyme
Thiết bị: Sử dụng buồng nuôi cấy bề mặt

22


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Hình 2.3: Buồng nuôi cấy bề mặt
1. Giá để khay
4. Quạt
2. Van hơi nóng để điều hoà
5. Lọc khí
nhiệt độ
6. Đường thông khí vào
3. Hệ thống phun nước thành
7. Đường thông khí ra
bụi
Thông số công nghệ:
Buồng nuôi cấy là buồng kín có kích thước 10000×2800×2100 mm với hai
cửa, một cửa nối với hành lang thải liệu. Bên trong phòng có ba đoạn ống thông
khí để nạp không khí điều hoà từ một hướng, còn từ hướng ngược lại – các ống để
thải không khí trong phòng. Diện tích của phòng được tính cho 18 – 20 giàn có
khoảng 9 – 10 khay cho mỗi bên. Khoảng cách giữa các giàn 80 – 100 mm, giữa
các giàn có khoảng cách rộng 1000 – 1200 mm để đi lại và cách tường
200 –
300 mm.

Các bộ điều hoà độc lập được phân bổ trên các phòng tiệt trùng nhằm để đẩy
không khí có nhiệt độ 22 – 320C, độ ẩm tương đối 96 – 98% vào phòng. Không khí
tuần hoàn có bổ sung 10% không khí sạch từ bộ điều hoà chính, các hành lang nạp
và tháo của các phòng cần phải cách ly các phòng bên cạnh. Điều đó thực hiện
được nhờ thông gió hai chiều khi trao đổi không khí nhiều lần (đến 8 lần) và nhờ
làm sạch không khí thải khỏi các bào tử.
6.

Nghiền

Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình trích ly
Quá trình nghiền làm cho nguyên liệu như cám mì, cám trở nên tơi xốp hơn,
làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và tăng hiệu quả sử dụng cơ chất, đồng đều về
kích thước và dễ phối trộn. Ở đây, do cám mì và cám gạo đã ở sẵn dạng bột, ta có
thể bỏ qua quá trình nghiền, tuy nhiên nếu nguyên liệu xuất hiện nhiều hạt kích
thước lớn do vón cục bởi độ ẩm, ta sẽ phải cho nguyên liệu qua máy nghiền.
23


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Các biến đổi của nguyên liệu:
• Vật lí: quan trọng nhất trong quá trình nghiền là kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích
bề mặt riêng tăng lên. Việc tăng diện tích bề mặt riêng có thể là tăng hiệu quả của quá
trình truyền nhiệt và truyền khối. Trong quá trình nghiền, dưới tác dụng của các lực, nhiệt
độ của vật liệu sẽ tăng lên, chủ yếu do lực ma sát.
• Hóa học: Khi nghiền vật liệu, cấu trúc của vật liệu bị phá vỡ, các thành phần dễ bị oxy
hóa trong vật liệu như các acid béo, vitamin,... sẽ có điều kiện tiếp xúc với oxy, do đó các

phản ứng oxy hóa sẽ xảy ra, làm giảm giá trị dinh dưỡng của môi trường. Ngoài ra, còn
có một số phản ứng hóa học khác diễn ra trong quá trình nghiền do nhiệt sinh ra thúc đẩy
các phản ứng hóa học dễ xảy ra hơn.
• Hóa lí: diện tích bề mặt riêng tăng và nhiệt độ tăng nên tốc độ bay hơi tăng, tổn thất các
cấu tử dễ bay hơi. Ngoài ra, việc tăng diện tích bề mặt sẽ làm tăng quá trình hút ẩm của
nguyên liệu và việc tăng nhiệt độ có thể làm đông tụ protein.
• Sinh học: khi nghiền vật liệu, dưới tác dụng của lực cơ học, vi sinh vật có thể bị tiêu diệt
nhưng mức độ không đáng kể. Sau khi nghiền, diện tích bề mặt riêng tăng, mật độ vi sinh
vật có thể tăng lên. Đồng thời, các thành phần dinh dưỡng thích hợp của vi sinh vật bên
trong nguyên liệu có thể thoát ra bề mặt, làm vi sinh vật phát triền mạnh hơn. Sự phát
triển của vi sinh vật có thể làm giảm chất lượng môi trường, ảnh hưởng đến chế độ thanh
trùng.
• Hóa sinh: các phản ứng oxy hóa được xúc tác bởi enzyme sẽ diễn ra mạnh hơn do tiếp
xúc với oxy nhiều hơn.
Thiết bị:

Hình 2.4: Thiết bị nghiền dĩa dạng pin-disc
Đây là 1 dạng của thiết bị nghiền dĩa. Cấu tạo bao gồm 1 dĩa quay và 1 dĩa cố định. Trên
mỗi dĩa có các rảnh sâu và các rãnh này ăn khớp với nhau. Hình dạng của các đường gân do rãnh
tạo thành có thể khác nhau, tròn, vuông hoặc dạng lưỡi dao. Tốc độ có thể đạt 10.000rpm. Thiết
bị có thể có thêm lớp vỏ áo để giải nhiệt.

24


Enzyme Glucoamylase

GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Thông số công nghệ:

Kích thước vật liệu vào: 4 – 7 µm
Kính thước vật liệu ra:
Vận tốc lưỡi dao: 5000 – 7000rpm
7.

Trích li

Mục đích công nghệ: Khai thác, dùng nước để chiết rút enzyme
glucoamylase trong canh trường
Các biến đổi của nguyên liệu:
-

-

Vật lí: sự khuyết tán các phân tử chất tan từ tâm của nguyên liệu đến vùng bề mặt và dịch chuyển
từ vùng bề mặt nguyên liệu vào dung môi (nước). Động lực của sự khuyếch tán là do chênh lệch
nồng độ.
Hóa học: các phản ứng hóa học giữa các cấu tử nhưng không đáng kể do trích ly ở nhiệt độ
thường.
Hóa lí: sự hòa tan các các enzyme và các cấu tử khác vào tan vào nước.
Hóa sinh: trích ly ở nhiệt độ thường các enzyme trong canh trường sẽ xúc tác phản ứng chuyển
hóa cơ chất từ nguyên liệu.
Sinh học: Thời gian trích ly kéo dài vi sinh vật sẽ phát triển.

Thiết bị: Thiết bị trích ly 1 bậc

Hình 2.5: Thiết bị trích li 1 bậc
Nguyên lý hoạt động:
Thiết bị là bể hình trụ đứng, phía bên dưới có một đáy lưới. Người ta sẽ cho
nguyên liệu cần trích ly vào thiết bị qua cửa đỉnh. Dung môi sẽ được bơm vào thiết

bị qua hệ thống phân phối vào phía dưới đỉnh. Dung môi sẽ được chảy qua lớp
nguyên liệu từ trên xuống dưới. Dịch trích được tháo ra ngoài qua của đáy. Dịch
trích được hồi lưu lại nhờ vào đường ống dẫn và bơm ở gần cửa đáy.
Để tránh vi sinh vật nhiễm cần thêm vào nước một ít formalin hoặc chất sát
trùng khác. Dịch chiết rút đựơc thường trong suốt có màu xám và chứa từ 10 – 15
% chất khô và tất cả các enzyme của nấm mốc.

25