khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ aspergillus oryzae trên môi trường rắn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRÍCH LY
TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN

Sinh viên thực hiện
Huỳnh Thị Phương Thảo
MSSV: LT10039
Lớp: CNTP K36LT

Giáo viên hướng dẫn
TS. Nguyễn Công Hà

NĂM 2012


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME
PROTEASE TRÍCH LY TỪ ASPERGILLUS ORYZAE TRÊN MÔI TRƯỜNG
RẮN”, do “HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO” thực hiện và báo cáo, đã được hội
đồng chấm luận văn thông qua.
Giáo viên hướng dẫn

Giáo viên phản biện 1

TS. NGUYỄN CÔNG HÀ
Giáo viên phản biện 2

Cần Thơ, ngày …. tháng …. năm ….
Chủ tịch hội đồng

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM ƠN
Qua ba học kì học tập tại trường Đại học Cần Thơ em đã được quý thầy cô
trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm –
Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi và truyền thụ
những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong suốt thời gian
học tập.
Sau khi hoàn thành chương trình học tại trường, em đã được thầy Nguyễn
Công Hà tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực
hiện luận văn tốt nghiệp.
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ
đã cung cấp nguồn nấm mốc cho em thực hiện đề tài. Đặc biệt cảm ơn thầy Nguyễn
Văn Thành đã nhiệt tình giúp đỡ em.

Em xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 15 tháng 5 năm 2012
Sinh viện thực hiện

HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông
nghiệp…nhưng giá thành chế phẩm enzyme thương mại hiện nay còn rất cao. Vì
vậy đề tài này được thực hiện với mục đích dùng nấm mốc để làm dồi dào nguồn
enzyme và giảm giá thành chế phẩm enzyme thương mại. Quá trình nghiên cứu
cũng tiến hành xác định động học của enzyme này nhằm phục vụ cho những nghiên
cứu ứng dụng vào sản xuất thực phẩm. Sau đó dựa vào nguồn enzyme này ứng dụng
vào việc thuỷ phân da cá tra để sản xuất collagen.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có thể tiến hành thu enzyme có hoạt
tính cao ở thành phần môi trường thích hợp để tạo enzyme protease thuỷ phân
trong môi trường acid là 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin và pH môi trường là 5.
Đồng thời có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ
enzyme protease trong dịch chiết. Enzyme này thể hiện hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ
45oC và pH = 5,5.

Động học của enzyme protease có Vmax = 1,2548µmol/phút và Km =
0,3932%
Khả năng thuỷ phân của enzyme protease trong dịch acid protein ứng với
thời gian thuỷ phân là 50 phút với thể tích dung dịch enzyme là 1ml, pH dung dịch
là 3,2 và nhiệt độ thuỷ phân là 45oC.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................iii
TÓM TẮT.............................................................................................................iv
MỤC LỤC .............................................................................................................v
DANH SÁCH BẢNG...........................................................................................vii
DANH SÁCH HÌNH ..........................................................................................viii
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..........................................................................2
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................3
2.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE..........................................................3
2.1.1 Giới thiệu...............................................................................................3
2.1.2 Phân loại enzyme protease vi sinh vật....................................................4
2.1.3 Động học của enzyme............................................................................5
2.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT .........................................................................8

2.2.1 Giới thiệu về cơ chất gelatine.................................................................8
2.2.2 Giới thiệu về cơ chất casein ...................................................................9
2.2.3 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serium Albumin (BSA)..........................10
2.3 NGUỒN TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ VI SINH VẬT..............11
2.3.1 Đặc điểm enzyme protease từ vi sinh vật .............................................11
2.3.2 Nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vật............................................11
2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME....13
2.4.1 Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme...........13
2.4.2 Đơn vị hoạt độ của enzyme..................................................................14
2.5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS
ORYZAE ...............................................................................................................14
2.5.1 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus oryzae...............................................14
2.5.2 Môi trường nuôi cấy ............................................................................15
2.5.4 Phương pháp nuôi cấy bề mặt .............................................................. 16
2.5.5 Thu nhận chế phẩm enzyme protease thô .............................................19
2.6 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME PROTEASE .........................................................................................20
2.6.1 Độ ẩm môi trường................................................................................20
2.6.2 Ảnh hưởng của không khí....................................................................20
2.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường ..........................................20
2.6.4 Thời gian nuôi cấy ...............................................................................20
2.7 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE.................................................20
2.7.1 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm ....................................................20
2.7.2 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác.......................................21
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............22
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ..................................................................22
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ...........................................................22
3.1.2 Vật liệu ................................................................................................ 22
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................22
3.1.4 Hoá chất thí nghiệm.............................................................................22

3.1.5 Thiết bị thí nghiệm...............................................................................23

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................................................24
3.2.1 Phương pháp thí nghiệm ......................................................................24
3.2.2 Bố trí thí nghiệm................................................................................ 245
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và
pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease................................ 25
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính
của enzyme protease ............................................................................................. 26
3.2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính
enzyme protease....................................................................................................27
3.2.2.4 Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease
trên dung dịch acid protein ...................................................................................28
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................. 29
4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường
khác nhau..............................................................................................................29
4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme
protease.................................................................................................................32
4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme
protease.................................................................................................................35
4.4 Kết quả khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịch

acid protein ở những thời gian khác nhau.............................................................. 36
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................39
5.1 KẾT LUẬN.................................................................................................39
5.2 KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................40
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.....................................................ix
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ............................................................... xiv

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần acid amin có trong gelatine .....................................................8
Bảng 2: Thành phần các acid amin trong casein ......................................................9
Bảng 3: Thành phần các acid amin trong phân tử BSA ..........................................10
Bảng 4: Thành phần dinh dưỡng của cám .............................................................. 16
Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme (TU/ml) theo thành phần môi trường và pH
môi trường.............................................................................................................30
Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính riêng (TU/mg) của enzyme theo thành phần môi
trường và pH môi trường.......................................................................................30
Bảng 7: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease theo pH với từng nhiệt độ ......32
Bảng 8: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease theo nồng độ casein ...............35
Bảng 9: Hàm lượng protein còn lại sau quá trình thuỷ phân...................................37
Bảng 10: Hàm lượng tyrosine sau quá trình thuỷ phân...........................................38

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein ..................................3
Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease.........................................................4
Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis – Menten .....................................7
Hình 4: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver ................................................8
Hình 5: Bacillus.....................................................................................................12
Hình 6: Nấm mốc ..................................................................................................12
Hình 7: Xạ khuẩn ..................................................................................................13
Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngày..........................................15
Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi ..........................................15
Hình 10: Quy trình nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt........................17
Hình 11: Máy khuấy từ....... ......................................................................................... 23
Hình 12: Cân điện tử..............................................................................................23
Hình 13: Tủ ủ ........................................................................................................23
Hình 14: Máy đo quang phổ ..................................................................................23
Hình 15: Tủ cấy vi sinh vật....................................................................................24
Hình 16: Thiết bị ủ nhiệt........................................................................................24
Hình 17: Máy vortex ............................................................................................. 24
Hình 18: Kính hiển vi điện tử ................................................................................24
Hình 19: Quy trình thí nghiệm sản xuất enzyme protease ......................................26

Hình 20: Môi trường sau khi ủ 42 giờ....................................................................29
Hình 21: Dịch lọc thô enzyme protease .................................................................29
Hình 22: Biến đổi hoạt tính của enzyme theo pH và thành phần môi trường..........30
Hình 23: Biến đổi hoạt tính riêng của enzyme theo pH và thành phần môi trường.31
Hình 24: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của protease theo nhiệt độ ....................32
Hình 25: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của protease thep pH ....................33
Hình 26: Sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme
protease .................................................................................................................34
Hình 27: Ảnh hưởng của nồng độ casein lên hoạt tính enzyme protease theo phương
trình Michaelis – Menten.......................................................................................36
Hình 28: Biến đổi hàm lượng protein theo thời gian thuỷ phân.............................. 37
Hình 29: Thay đổi hàm lượng tyrosine ở những thời gian thuỷ phân khác nhau.....38

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

viii


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các
lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Đặc biệt trong
ngành thực phẩm, những ứng dụng của kỹ thuật sinh học đã tạo nên những tiến bộ
đáng kinh ngạc trong việc sản xuất các sản phẩm mới cũng như gia tăng hiệu suất
của các sản phẩm truyền thống. Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế

giới đạt trên 300.000 tấn với giá trị hơn 500 triệu USD được phân phối trong các
lĩnh vực khác nhau.
Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận to lớn cho Việt
Nam. Ứng dụng enzyme để hỗ trợ cho quá trình sản xuất trong chế biến thực phẩm
đã trở nên phổ biến và quen thuộc. Bản chất của enzyme là những chất protein.
Chúng được tạo ra bởi tế bào sống (thực vật, động vật và vi sinh vật) là chất xúc tác
cho các phản ứng sinh học. Chức năng chính của enzyme trong hoạt động sống là
xúc tác sự hình thành và cắt đứt các liên kết hóa học.
Do có ưu thế về nhiều mặt nên vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme
chủ đạo. Tùy theo mục đích sử dụng mà người ta sản xuất nhiều dạng chế phẩm
enzyme khác nhau như enzyme thô, enzyme bán tinh khiết và enzyme tinh khiết.
Sản xuất enzyme từ vi sinh vật so với từ thực vật và động vật có rất nhiều ưu điểm
như:
- Tốc độ sản sinh của vi sinh vật rất mạnh.
- Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao.
- Vi sinh vật là rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp.
- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ kiếm.
- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme
khác nhau.
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt…), sản
xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như nguồn cung cấp protease đã cải thiện
đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành
chế phẩm enzyme còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme
trong công nghiệp và đời sống.
Với những thuận lợi và sự cần thiết của enzyme, đề tài thực hiện khảo sát

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease từ
Aspergillus oryzae trên môi trường rắn. Bởi những ứng dụng ngày càng rộng rãi của
protease thì việc sản xuất ra enzyme sẽ góp phần đưa công nghệ enzyme ngày càng
phát triển, góp phần hạ giá thành chế phẩm enzyme tạo điều kiện mở rộng sản xuất
enzyme trong thực tế, cải thiện được quy trình sản xuất, cải thiện điều kiện lao động
và nâng cao chất lượng sản phẩm.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát hoạt tính enzyme protease trích ly từ
Aspergillus oryzae trên môi trường rắn với các mục tiêu sau:
- Ảnh hưởng của thành phần môi trường và pH môi trường khác nhau
đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ
phân của enzyme protease.
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính xúc tác phản ứng thuỷ
phân của enzyme protease.
- Khảo sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease trên dung dịch acid
protein.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

2

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Enzyme protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn
enzyme ở vi sinh vật là phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất
để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống.
2.1 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE
2.1.1 Giới thiệu
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase xúc tác cho quá trình thủy phân
liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng
là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este
và vận chuyển acid amin.

Hình 1: Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật
(gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Hầu hết protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptid
định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl
hoặc nhóm amin được lựa chọn để bảo vệ khả năng kết tủa sản phẩm…
Trong cơ thể protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các

enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các
protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhầy thành ruột. Các acid
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

3


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

amin tự do, các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở thành
ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành ruột. Các
acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình chuyển hóa.
Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại
thực phẩm. Quá trình này có thể được thực hiện nhờ chính protease của thực phẩm
đó hoặc do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế biến thực
phẩm.
Trong nhiều trường hợp các tính chất protein của thực phẩm được cải thiện
khi thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy phân hạn chế
có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan và
khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia).

Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease

2.1.2 Phân loại enzyme protease vi sinh vật
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống
phân loại các nhóm enzyme.
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
2.1.2.1 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid, exopeptidase được phân chia

thành hai loại:
- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ tự do
của chuỗi polypeptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một
tripeptid.
- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon
của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.
2.1.2.2 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
- Serine protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc
tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,
elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisin

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

4


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
- Cysteine protease: các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papayin, bromalin,
một vài protease động vật và protease ký sinh trùng. Các cysteine protease thường
hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
- Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin.

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
rennin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
- Metallo protease: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm
mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động
vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
2.1.2.3 Dựa vào khả năng hoạt động ở các giá trị pH khác nhau
Chia làm 03 loại protease acid, protease trung tính và protease kiềm.
- Protease acid: loại protease này được thu nhận từ nấm mốc màu đen
như: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus saitoi. pH hoạt động của
protease nấm mốc này là 2,5 ÷ 3,0.
- Protease trung tính: loại này có ở rất nhiều loại nấm mốc khác nhau,
chủ yếu là ở các loại nấm mốc có màu vàng như: Aspergillus oryzae, Aspergillus
flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericole. Ngoài nấm mốc ra, protease
trung tính còn tìm thấy ở vi khuẩn Bacillus mesentericus.
- Protease kiềm: tìm thấy nhiều ở nấm men. Tuy nhiên việc tạo ra
protease acid, trung tính và kiềm còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi
trường hoặc cơ chất mà chúng tác dụng. Đã có nhiều trường hợp thí nghiệm cho
thấy thành phần môi trường làm thay đổi hẳn đặc tính của protease.
2.1.3 Động học của enzyme
2.1.3.1 Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme
Nghiên cứu động học của enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố:
nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm… đến tốc độ
phản ứng do enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho ta biết được
các vấn đề sau đây:
- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme.
- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt năng lượng
của quá trình enzyme.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa
chọn các đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất
đối với hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng
đến hoạt động của chúng.
- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì
người ta cần phải kiểm tra về mặt năng lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt
động của chế phẩm enzyme trong các giai đoạn tinh chế.
2.1.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
a. Phương trình động học Michalelis – Menten
Năm 1913 hai nhà khoa học Leonom Michalelis và Maud Menten đưa ra mô
hình động học để giải thích phản ứng xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản
ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng, nồng độ cơ chất và enzyme.
Mô hình chuyển hoá của phản ứng enzyme với một cơ chất như sau:
k1

kcat


 ES 
 P  E
E  S 
k 1

Trong đó: k1, k-1, kcat: là những hằng số của các phản ứng
E: là enzyme
S: là cơ chất
ES: phức hợp enzyme – cơ chất
Etot: nồng độ enzyme ban đầu
Giả sử nồng độ enzyme ban đầu cũng là nồng độ cơ chất ở trạng thái cân
bằng của phản ứng, nếu bỏ qua phản ứng ngược P  E  ES
Tốc độ phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng: V  dP / dt  kcat  ES
Phản ứng xấp xỉ trạng thái ổn định (Steady – State): [ES] là hằng số
Tốc độ xuôi chiều = tốc độ ngược chiều
k1  S  E   k1  S   Etot   ES   k1  kcat   ES
 k1  S  Etot   k1  kcat  k1  S    ES
  ES   S  Etot /  K m   S 

Với K m   k1  kcat  / k1
Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả enzyme đều tham gia phản ứng tạo
phức hệ ES ta có: [ES] = Etot, khi phản ứng này đạt tốc độ cực đại Vmax = kcatEtot
V  kcat  ES  kcat  S  Etot /  K m   S V  Vmax  S  /  K m   S    

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Phương trình (*) là phương trình Michaelis – Menten. Phương trình này phản

ánh tương quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng V, tốc độ cực đại của
phản ứng Vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số Km.

Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis – Menten
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Những trường hợp giới hạn của phương trình Michaelis – Menten
V = kcat[S]Etot/(Km+[S]) = Vmax[S]/(Km+[S])
Trong trường hợp:
K E
[S] >> Km: phản ứng có dạng S 
P
cat tot

V ~ Vmax = kcatEtot
k /K
[S] << Km: phản ứng có dạng E  S 
PE
cat

m

V ~ (kcat/Km)[S][E]
kcat/Km ~ 109/ (M sec)
[S] = Km
V ~ (1/2)Vmax = (1/2)kcatEtot
b. Ý nghĩa của hằng số Michaelis – Menten
Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis, chính là giá trị của nồng độ cơ chất
khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ cực đại. Km có đơn vị là Molar, khi [S] = Km thì
V = Vmax/2 và ngược lại.

Hằng số Michaelis là một hằng số rất quan trọng. Nó xác định ái lực của
enzyme với cơ chất. Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì
thế tốc độ cực đại Vmax đạt ở nồng độ cơ chất thấp.
(kcat/Km) là hằng số tốc độ phản ứng hai phân tử hiệu quả tại nồng độ cơ chất
thấp. Khi (kcat/Km) ~ 109 chỉ ra rằng sự xúc tác gần như hoàn chỉnh: mỗi khi cơ chất
gặp enzyme hầu như đều chuyển thành sản phẩm.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

7


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

c. Phương trình Line Weaver
V = Vmax[S]/(Km + [S])
Nghịch đảo 2 vế phương trình:
1/V = (1/Vmax) + (Km/Vmax)*(1/[S])
Đây là phương trình được Line Weaver và Burk đưa ra vào năm 1943 có
dạng y = ax + b là phương trình đường thẳng.
Nếu vẽ đồ thị đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở 1/Km và độ nghiêng bằng Km/Vmax. Từ phương trình trên ta dễ dàng xác định Km và
Vmax trong các thí nghiệm.

Hình 4: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2 GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT
2.2.1 Giới thiệu về cơ chất gelatine

Cơ chất cảm ứng được xem như yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá
trình sinh tổng hợp enzyme.
Gelatine có sẵn trong tự nhiên nhưng nó được tìm thấy từ protein collagen
gốc bằng quá trình phá hủy cấu trúc bậc hai hoặc cao hơn ở các nhiệt độ khác nhau
của quá trình thủy phân polypeptide có trong xương và da.
Gelatine là các polypeptide cao phân tử dẫn xuất từ collagen, là thành phần
protein chính trong các tế bào liên kết của nhiều loại động vật. Cấu tạo là một chuỗi
acid amin gồm 3 acid amin chủ yếu là glycine, proline và hydroproline.Trong phân
tử gelatine, các acid amin liên kết với nhau tạo chuỗi xoắn ốc có khả năng giữ nước.
Bảng 1: Thành phần acid amin có trong gelatine

Acid amin
Aspartic acid
Arginine
Alanine
Glutamic acid
Proline và Hydroproline

Tỷ lệ
6%
8%
9%
10%
25%

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

8

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Glycine
Các acid amin khác

27%
10%

(Nguồn: />
2.2.2 Giới thiệu về cơ chất casein
Casein là protein chủ yếu trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa.
Chúng tồn tại dưới dạng micelle. Casein là những protein có tính acid vì trong phân
tử của chúng rất giàu các acid glutamic và acid aspartic. Tất cả các casein đều được
phosphoryl hoá với những mức độ khác nhau trên gốc serin và threonine. Casein có
điểm đẳng điện pI = 4,6. Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác
nhau nên có cấu trúc bậc 1 khác nhau. Casein trong sữa có 4 dạng chính: casein αs1
và casein αs2, casein β, casein K.
- Casein αs1: phân tử lượng khoảng 23.000Da, có 199 gốc acid amine. Do
sự phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử
loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.
- Casein αs2: phân tử lượng 25.000Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa
nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl
và gốc cation nhất.
- Casein β: phân tử lượng khoảng 24.000Da, có 209 gốc acid amine, có
tính ưa béo cao nhất. Phân tử casein β gồm 10% cấu trúc xoắn α, 13% cấu trúc lá
xếp β và 77% cấu trúc không trật tự.
- Casein K: phân tử lượng khoảng 19.000Da, có 169 gốc acid amine.
Loại này chỉ chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của

phân tử protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. Casein K gồm 23% vùng
xoắn α, 31% vùng lá xếp β và 24% vùng vòng cung β.
Bảng 2: Thành phần các acid amin trong casein

Acid amin
Glutamic acid
Proline
Leucine
Lycine
Valine
Aspartic acid
Serine
Tyrosine
Isoleucine
Phenylalanine
Threonine

Tỷ lệ (%)
20,2%
10,2%
8,3%
7,4%
6,5%
6,4%
5,7%
5,7%
5,5%
4,5%
4,4%

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

9


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Arginine
Histidine
Alanine
Methionine
Glycine
Tryptophane
Cystine

3,7%
2,8%
2,7%
2,5%
2,4%
1,1%
0,3%

(Nguồn: />
2.2.3 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serium Albumin (BSA)
Serum Albumin là một trong những protein được nghiên cứu rộng rãi và là
protein phong phú nhất trong huyết tương với nồng độ là 5g/100ml. Nhiều nhà khoa
học đã có nghiên cứu về cấu trúc và những tính chất của serum albumin cũng như

những ảnh hưởng của nó đến những loại protein khác để từ đó biết được ảnh hưởng
của serum albumin đến chức năng của thực phẩm là như thế nào.
BSA là protein hình cầu lớn (66.000Da) với những acid amin cần thiết. Nó
có đầy đủ những đặc điểm và tính chất của protein đã được biết đến (Peter, 1975).
Trong thành phần của nó chứa ít tryptophane và methionine nhưng hàm
lượng cystein và acid amin phân cực cao. Hàm lượng glycine và isoleucine phân tử
BSA thì thấp hơn mức trung bình trong protein (Peter, 1985). Thành phần acid amin
trong phân tử BSA được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3: Thành phần các acid amin trong phân tử BSA

Loại acid amin

Số lượng

Alanine
Phenylalanine
Lysine
Proline
Cystein
Glycine
Valine
Aspartic acid

48
30
60
28
34
35
17

41

Histidine
Methionine
Arginine
Tryptophane
Glutamic acid
Isoleucine

16
5
26
3
58
15

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Asparagine
Serine

14
32

Tyrosine

21

(Nguồn: Brown, 1975; Patterson and Geller, 1977; McGillivray et al., 1979; Reed et al., 1980; Hirayama et
al., 1990)

2.3 NGUỒN TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ VI SINH VẬT
2.3.1 Đặc điểm enzyme protease từ vi sinh vật
Khác với protease thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những
enzyme ngoại bào và có tính đặc hiệu rộng rãi.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật
có những lợi ích chính như sau:
- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn 16 ÷ 100 giờ nên có thể thu
nhiều lần trong năm.
- Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi
(định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
- Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ
chức sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,
gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa và xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật
có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ
tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
2.3.2 Nguồn thu enzyme protease từ vi sinh vật
Enzyme protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn và một số
loại nấm men.

2.3.2.1 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme đã sử dụng.
Protease của động vật hoặc thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase và exopeptadase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên,
do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân
hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

11


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

circulans, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus thermorpoteoliticus,
Bacillus thermophyllus, Bacillus brevis và một số giống thuộc chi Clostridium.
Trong đó Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn
thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH = 5 ÷
8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng.
Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và
thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus,
Bacillus thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Hình 5: Bacillus

2.3.2.2 Nấm mốc
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, Aspergillus
flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus soyae, Penicillum chysogenum, Mucor
hiemalis…Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả 03 loại protease: acid,
trung tính và kiềm. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng
thủy phân protein ở pH 2,5 ÷ 3,0.
Một số nấm mốc như Aspergillus canditatus, Penicillum cameberti,
Penicillium roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease đông tụ sữa sử dụng
trong sản xuất phomat.

Hình 6: Nấm mốc
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

12


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.2.3 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao: Streptomyces grieus, Streptomyces fradiae,
Streptomyces trerimosus…
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease được chiết
tách từ Streptomyces grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptid của nhiều protein thành acid amin. Ở Liên Xô (cũ)
người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ Streptomyces grieus có tên là

protelin.

Hình 7: Xạ khuẩn

2.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME
Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt
độ hoạt động của enzyme. Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà
phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả
năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng.
2.4.1 Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương pháp
sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme.
- Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành
sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước. Phương pháp này
được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác.
- Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến
đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng
enzyme nhất định.
- Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất
định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

13


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

2.4.2 Đơn vị hoạt độ của enzyme
Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động
của enzyme. Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt
độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị sau.
2.4.2.1 Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI)
Đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa
được 1µmol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1UI = 1µmol cơ chất (10 -6mol)/phút
2.4.2.2 Katal (Kat)
Đơn vị Kat là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được một
mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn.
1Kat = 1mol cơ chất/giây
1UI =

1
 10 6 Kat = 16,67nKat (nanoKatal)
60

2.4.2.3 Hoạt độ riêng
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc một đơn vị
Katal) ứng với 1ml dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc 1mg protein (nếu là bột khô)
của chế phẩm enzyme. Khi biết được phân tử của enzyme ta hoàn toàn có thể tính
được hoạt độ riêng của phân tử.
2.4.2.4 Hoạt độ riêng của phân tử
Hoạt độ riêng của phân tử enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi
một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian.
2.5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS
ORYZAE
2.5.1 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus oryzae
2.5.1.1 Phân loại

Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Pezizomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Plectascales
Họ: Aspergillaceae
Giống: Aspergillus

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

14


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

Loài: Aspergillus oryzae
2.5.1.2 Đặc điểm
 Hình thái
Chủng mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất
mạnh (chiều ngang 5 ÷ 7µm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm
đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.

Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngày

Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi

 Điều kiện phát triển
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%.

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55 ÷ 58%.
Độ ẩm không khí: 85 ÷ 95%.
pH môi trường: 5,5 ÷ 6,5
Nhiệt độ nuôi cấy: 27 ÷ 30oC
2.5.2 Môi trường nuôi cấy
2.5.2.1 Nguyên liệu
Môi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thường là cám

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

15


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

gạo hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm. Trong các loại nguyên liệu trên thì
cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại cám này có đầy đủ
chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Mặt khác, khi tạo môi trường,
chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để đảm bảo khối kết dính cần thiết,
vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Nguồn dinh
dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphat…
Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường
cho thêm trấu với lượng khoảng 20 ÷ 25%. Thực chất, việc cho trấu vào là làm tăng
độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông
trong lòng môi trường.
Bảng 4: Thành phần dinh dưỡng của cám (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Thành phần dinh dưỡng

Hàm lượng

Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng

Năng lượng

350 ÷ 426kcal Tro

6,0 ÷ 6,5 %

Nước

12 ÷ 14%

Canxi

30 ÷ 32mg%

Protein thô

10 ÷ 12,2%

Phospho

4,5 ÷ 4,6mg%

Lipid

20 ÷ 22,7%

Sắt

10 ÷ 14mg%

Glucid tổng số

40,3 ÷ 42%

Vitamin B1

0,96 ÷ 1mg%

Cellulose

6,3 ÷ 7%

2.5.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm
thích hợp. Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trường cám
là 60%W. Độ ẩm vượt quá 60%W thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát
triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Nếu độ ẩm < 60%W (thường 45 ÷
50%W) thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử nấm sợi và như vậy thì enzyme thu
được sẽ giảm hoạt tính rất mạnh.
Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường để
tiêu diệt các vi sinh vật lạ nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của
giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thường, môi trường sẽ được thanh trùng
bằng hơi nước nóng ở 121oC trong thời gian 15 ÷ 30 phút.
Môi trường nuôi cấy sẽ được cho vào bình tam giác và tiến hành trộn giống
vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu

nhận enzyme vào khoảng 36 ÷ 60 giờ.
2.5.4 Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Để nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease ta lựa
chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn. Phương pháp nuôi cấy bề
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

16


Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học Cần Thơ

mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường
hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thường, môi trường dạng rắn với
nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nảy mầm, trấu
và bổ sung một số chất dinh dưỡng khác (amon sulfat, amon clorua, amon
phosphat). Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay.
Những ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt:
- Dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất
nhiều so với nuôi cấy chìm.
- Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Khi bị nhiễm vi sinh vật lạ ta rất dễ dàng xử lý.
2.5.4.1 Quy trình
Nguyên liệu
Trộn, làm ẩm
Thanh trùng bằng nhiệt
Làm nguội, làm tơi
Trộn giống VSV

Giống vi sinh vật

Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy
Nuôi cấy, theo dõi

Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Hình 10: Quy trình nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt

2.5.4.2 Thuyết minh quy trình
a. Nguyên liệu
Đặc điểm của giống Aspergillus oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào
và ngoại bào (amylase, protease, pectinase…), ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo đã hết nhưng không được rửa sạch,
ở cặn bã bia, bã rượu, ở bã sắn… Chúng mọc và có khi phát triển thành lớp mốc, có

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

17