nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin thu nhận nacetyldglucosamine, sử dụng enzyme endochitinase và βhexosaminidase tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------oOo------------

GIANG TRUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN
THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME
ENDOCHITINASE VÀ β-HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

HÀ NỘI, NĂM 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------oOo------------

GIANG TRUNG DŨNG

NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN THỦY PHÂN CHITIN
THU NHẬN N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE, SỬ DỤNG ENZYME
ENDOCHITINASE VÀ β-HEXOSAMINIDASE TÁI TỔ HỢP

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
MÃ SỐ

: 60-54-10

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN HOÀNG ANH
PGS.TS. LÊ THANH HÀ

HÀ NỘI, NĂM 2014


LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa hề ñược sử dụng.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc.
Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2014
Học viên

Giang Trung Dũng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i


LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn

nhận ñược rất nhiều sự quan tâm, giúp ñỡ của các tổ chức và cá nhân.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo TS. Nguyễn Hoàng Anh,
Phó trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và cô giáo
PGS.TS Lê Thanh Hà, viện Sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường ðại học Bách
khoa Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn, truyền ñạt cho tôi những kiến thức quý báu
trong lĩnh vực chuyên môn của luận văn, ñộng viên giúp ñỡ tôi thực hiện và hoàn
thành công trình nghiên cứu khoa học của mình.
Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS. Hoàng Hải Hà, khoa Công nghệ thực
phẩm và bạn ðỗ Hải Quỳnh, học viên K22, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông
nghiệp Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô giáo, cán bộ trong
khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm Trung
tâm khoa Thú Y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi
thực hiện ñề tài tốt nghiệp.
Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh ñạo Huyện ủy – UBND huyện Mường
Khương, lãnh ñạo và công chức phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Mường
Khương, tỉnh Lào Cai ñã tạo ñiều kiện, hỗ trợ giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập,
nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin trân trọng cảm ơn bạn bè ñã luôn bên, ñộng viên và khuyến khích tôi
trong quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu.
ðặc biệt, tôi xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất ñến bố, mẹ và vợ của tôi cùng
những người thân trong trong gia ñình ñã luôn quan tâm ñộng viên trong quá trình học
tập và nghiên cứu hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 25 tháng 9 năm 2014
Học viên

Giang Trung Dũng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC

Lời cam ñoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng
Danh mục hình
PHẦN 1 ðẶT VẤN ðỀ

1

1.1

ðặt vấn ñề

2

1.2

Mục ñích - yêu cầu

2

1.2.1

Mục ñích

2

1.2.2

Yêu cầu

2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1

Tìm hiểu chung về chitin

3

2.1.1

Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên

3

2.1.2

Tính chất lý hóa của chitin

3

2.2

Tìm hiểu chung về GlcNAc

5

2.2.1

Công thức cấu tạo

5

2.2.2

Tính chất của GlcNAc

6

2.2.3

Vai trò của GlcNAc

6

2.2.4

Phương pháp sản xuất

8

2.3

Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis khả năng ứng
dụng ñể sản xuất enzyme

11

2.3.1

ðặc ñiểm hình thái Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis

11

2.3.2

ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis

11

2.3.3

Ứng dụng của Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis

12

2.4

Giới thiệu về enzyme endochitinase

14

2.4.1

Khối lượng phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase

14

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


2.4.2

Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH ñến hoạt ñộng của endochitinase

15

2.4.3

Nguồn thu nhận endochitinase

15

2.5

Tìm hiểu về enzyme β-hexosaminidase

16

2.5.1

Cơ chế xúc tác của β-hexosaminidase

16

2.5.2

Một số ñặc tính của β-hexosaminidase

17

2.5.3

Vai trò của β-hexosaminidase

18

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19

3.1

Vật liệu

19

3.1.1

ðối tượng nghiên cứu

19

3.1.2

ðịa ñiểm nghiên cứu

19

3.1.3

Thời gian nghiên cứu

19

3.1.4

Dụng cụ, hóa chất

19

3.2

Nội dung nghiên cứu

23

3.3

Phương pháp nghiên cứu

23

3.3.1

Nuôi cấy thu sinh khối tế bào

23

3.3.2

Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện gene mã hóa cho endochitinase và βhexosaminidase bằng phương pháp ñiện di SDS-PAGE

24

3.3.3

Tinh sạch enzyme bằng hệ thống sắc ký lỏng FPLC

25

3.3.4

Phương pháp tinh sạch enzyme bằng muối (NH4)2SO4

26

3.3.5

Phương pháp tạo cơ chất colloidal chitin

26

3.3.6

Phương pháp xác ñịnh hoạt tính endochitinase

27

3.3.7

Phương pháp xác ñịnh hoạt tính của β-hexosaminidase

28

3.3.8

Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

29

3.3.9

Xác ñịnh nhiệt ñộ tối thích và ñộ bền nhiệt của endochitinase và βhexosaminidase

29

3.3.10 Xác ñịnh pH tối thích và ñộ bền pH của endochitinase và βhexosaminidase

30

3.3.11 Xác ñịnh sản phẩm thủy phân bằng sắc ký bản mỏng TLC

30

3.4

31

Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1

32

Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái hợp và xác ñịnh mức ñộ biểu hiện của
gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase

32

4.1.1

Nuôi cấy chủng E.coli tái tổ hợp thu sinh khối

32

4.1.2

Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện của gene mã hóa cho endochitinase và βhexosaminidase

32

4.2

Tinh sạch endochitinase và β-hexosaminidase

33

4.2.1

Tinh sạch endochitinase

33

4.2.2

Tinh sạch β-hexosaminidase

36

4.3

Xác ñịnh một số ñặc tính thủy phân colloidal chitin của endochitinase
và thủy phân pNP-GlcNAc của β-hexosaminidase

38

4.3.1

Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt của endochitinase

38

4.3.2

Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu và ñộ bền nhiệt của β-hexosaminidase

40

4.3.3

Xác ñịnh pH tối ưu và ñộ bền pH của endochitinase

42

4.3.4

Xác ñịnh pH tối ưu và ñộ bền pH của β-hexosaminidase

45

4.4

Phân tích thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm
thủy phân

4.4.1

47

Xác ñịnh khả năng thủy phân colloidal chitin của endochitinase bằng
47

phương pháp TLC
4.4.2

Xác ñịnh khả năng thủy phân oligosaccharides của β-hexosaminidase
bằng phương pháp TLC

4.5

48

Xây dựng quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc bằng cách kết hợp
hai enzyme

48

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

52

5.1

Kết luận

52

5.2

Kiến nghị

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNS

Dinitrosaicylic acid

GlcNAc

N-acetyl-β-D-glucosamine

FPLC

Fast protein liquid chromatography

LB

Luria bertani

RPM

Revolutions per minute

PAGE

Polyarylamide gel electrophoresis

pNP-GlcNAc

p-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide

IPTG

Isopropyl -thio-β-D-galactopyranoside

TEMED

N,N,N’,N’-tetramethylethynediamine

TLC

Thin layer chromatography

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

w/v

Khối lượng/thể tích

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu

20

Bảng 3.2: Thành phần gel cô và gel tách

24

Bảng 4.1: Hoạt tính của enzyme endochitinase tái tổ hợp thu ñược khi tinh
sạch bằng sắc ký FPLC tính theo 1 lít dịch nuôi cấy

34

Bảng 4.2: Hoạt tính của endochitinase tái tổ hợp thu ñược khi tinh sạch ở các nồng
ñộ muối amonisunfat khác nhau tính theo 1 lít dịch nuôi cấy

35

Bảng 4.3:Hoạt tính của β-hexosaminidase tái tổ hợp thu ñược khi tinh sạch
bằng sắc ký FPLC tính cho 1 lít dịch nuôi cấy

36

Bảng 4.4: Hoạt tính của β-hexosaminidase tái tổ hợp thu ñược khi tinh sạch ở
các nồng ñộ muối amonisunfat khác nhau tính cho 1 lít dịch nuôi
cấy

37

Bảng phụ lục 1: Phản ứng DNS với các nồng ñộ GlcNAc khác nhau

58

Bảng phụ lục 2: Nồng ñộ dung dịch pNP

59

Bảng phụ lục 3.1: Phản ứng của CBB G-250 với abumin

60

Bảng phụ lục 3.2: ðường chuẩn protein

60

Bảng phụ lục 4: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của endochitinase

61

Bảng phụ lục 5: ðộ bền nhiệt của endochitinase ở 37 0C và 50 0C

61

Bảng phụ lục 6: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính β-hexosaminidase

62

Bảng phụ lục 7: ðộ bền nhiệt của β-hexosaminidase

62

Bảng phụ lục 8: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của endochitinase

63

Bảng phụ lục 9: ðộ bền pH của endochitinase

64

Bảng phụ lục 10: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase

64

Bảng phụ lục 11: ðộ bền pH của β-hexosaminidase

65

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1:Cấu trúc của phân tử chitin [51]

4

Hình 2.2: Công thức cấu tạo của GlcNAc [47]

5

Hình 2.3: Vị trí phân thủy phân của endochitinase

15

Hình 2.4: Vị trí thủy phân liên kết của β-hexosaminidase

17

Hình 4.1: ðịnh tính khả năng sinh endochitinase của vi khuẩn tái Bacillus
licheniformis DSM13 tổ hợp bằng ñiện di SDS-PAGE

32

Hình 4.2: ðịnh tính khả năng sinh β-hexosaminidase của vi khuẩn Lactococcus
lactis ssp.lactis IL1403 tái tổ hợp bằng ñiện di SDS-PAG

33

Hình 4.3: Sắc ký ñồ tinh sạch endochitinase tái tổ hợp

34

Hình 4.4: Sắc ký ñồ tinh sạch β-hexosaminidase tái tổ hợp

36

Hình 4.5: ðồ thị ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của endochitinase

39

o

o

Hình 4.6: ðộ bền của endochitinase ở 37 C và 50 C

40

Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính của β-hexosaminidase

41

Hình 4.8: ðồ thị xác ñịnh ñộ bền nhiệt của β-hexosaminidase ở 30oC và 37oC

42

Hình 4.9: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính của endochitinase

43

Hình 4.10: ðồ thị biểu diễn ñộ bền pH của endochitinase

44

Hình 4.11: Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính β-hexosaminidase

45

Hình 4.12: ðồ thị biểu diễn ñộ bền pH của β-hexosaminidase

46

Hình 4.13: Sắc ký bản mỏng sản phẩm phân giải colloidal chitin 2% (A) và 20
% (B) bởi endochitinase ở các thời gian thủy phân khác nhau. M.
Hỗn hợp chitooligosaccharide chuẩn.

47

Hình 4.14: Sắc ký bản mỏng sản phẩm phân giải 50 mM diacetyl chitobiose
(A) và 50mM diacetyl chitotriose (B) bởi β-hexosaminiase.

48

Hình 4.15: Quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin, sử dụng enzyme
endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp

49

Hình phụ lục 1: ðồ thị ñường chuẩn GlcNAc

58

Hình phụ lục 2: ðồ thị ñường ñường chuẩn pNP

59

Hình phụ lục 3: ðồ thị ñường chuẩn protein

60

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


PHẦN 1. ðẶT VẤN ðỀ
N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc) ñã ñược biết ñến là một hoạt chất sinh
học quý, có tác dụng chữa các loại bệnh về khớp, viêm ruột và ứng dụng sản xuất
mỹ phẩm. ðã có nhiều nghiên cứu với những thử nghiệm lâm sàng chứng minh
G l cN A c có tác dụng ñiều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp [27]. Hiện nay, các
dược phẩm có GlcNAc ñã ñược sản xuất và thương mại hóa với giá trị rất cao. Các
sản phẩm có gốc glucosamine như glucosamine sunfat, glucosamine hydroclorid có
tác dụng tương tự như GlcNAc, tuy nhiên khả năng cơ thể con người hấp thụ khó
hơn GlcNAc. Nguồn nguyên liệu chính ñể sản xuất GlcNAc là chitin. Với lợi thế
chăn nuôi và chế biến thủy sản phát triển, Việt Nam có nguồn nguyên liệu sản xuất
chitin rất dồi dào [1].
Chitin chiếm từ 14-35% trọng lượng khô của vỏ giáp xác [4]. Ở Việt Nam,
giáp xác chiếm trên 30% nguồn nguyên liệu thủy sản. Trong công nghiệp chế
biến thủy sản xuất khẩu, lượng phế phụ phẩm từ chế biến giáp xác khoảng 70.000
tấn/năm [1]. Việc nghiên cứu, sản xuất GlcNAc từ nguồn cơ chất chitin này sẽ
góp phần làm tăng giá trị kinh tế ngành chế biến thủy sản và làm sạch môi trường.
Ngày nay, GlcNAc có thể ñược sản xuất bằng phương pháp hóa học, hoặc
phương pháp sinh học sử dụng phức hệ enzyme endochitinase và β-hexosaminidase.
Tuy nhiên, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân chitin thành GlcNAc ñang
ñược quan tâm nghiên cứu do phương pháp này cho ñộ tinh khiết của sản phẩm cao,
không gây ăn mòn thiết bị và thân thiện với môi trường [19].
Kỹ thuật DNA tái tổ hợp ñóng vai trò then chốt của lĩnh vực Công nghệ sinh
học. Kỹ thuật này góp phần cải thiện hoạt tính và khả năng sinh tổng hợp enzyme
ñang ñược ứng dụng rộng rãi. Enzyme tái tổ hợp sẽ hạn chế ñược nhược ñiểm của
enzyme thu nhận từ các chủng vi sinh vật tự nhiên như: mức ñộ biểu hiện của
enzyme tự nhiên thường thấp, hoạt tính không cao. ðến nay, trên thế giới ñã có một

số nghiên cứu nhất ñịnh về ứng dụng chitinase ñể sản xuất GlcNAc. Tuy nhiên, ở
Việt Nam chưa có nghiên cứu nào ứng dụng endochitinase và β-hexosaminidase tái
tổ hợp ñể sản xuất GlcNAc. Chính vì lý do ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


tài: “Nghiên cứu ñiều kiện thủy phân chitin, thu nhận N-acetyl-D-glucoamine sử
dụng enzyme endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp”.
1.1. ðặt vấn ñề
1.2. Mục ñích - yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Bước ñầu xây dựng quy trình sản xuất GlcNAc từ chitin sử dụng enzyme
endochitinase và β-hexosaminidase tái tổ hợp.
1.2.2. Yêu cầu
- Nuôi cấy 02 chủng E.coli tái tổ hợp và xác ñịnh ñược mức ñộ biểu hiện của
gen mã hóa cho endochitinase và β-hexosaminidase.
- Tinh sạch và xác ñịnh ñược ñặc tính thủy phân chitin của enzyme
endochitinase từ chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho
endochitinase của Bacillus licheniformis DSM13.
- Tinh sạch và xác ñịnh ñược ñặc tính thủy phân pNP-N-acetylglucosaminide của chủng vi khuẩn E.coli tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho βhexosaminidase của Lactococus lactis ssp.lactis IL1403.
- Phân tích ñược thành phần chitooligosaccharide và GlcNAc trong sản phẩm
thủy phân.
- Bước ñầu xây dựng ñược quy trình thủy phân chitin thu GlcNAc bằng cách
kết hợp hai enzyme.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tìm hiểu chung về chitin
2.1.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên
Chitin ñược mô tả lần ñầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên
cứu loài nấm Agaricus volvacecus, ông thu ñược sản phẩm và ñặt tên là chitin.
Năm 1823, Odier phân lập ñược một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin.
Odier và Braconnot ñều ñi ñến kết luận chitin có dạng công thức tương tự như
cellulose [51].
Chitin là một polysacharide phổ biến trong tự nhiên với sản lượng rất lớn
(nhiều thứ hai sau cellulose), là một polymer sinh học ñược tổng hợp với số lượng
lớn từ sinh vật. Trong ñộng vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng
của vỏ một số ñộng vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác
và giun tròn. Trong ñộng vật bậc cao chitin là một thành phần chủ yếu trong mô
da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật
chitin có ở thành tế bào nấm, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo. Trong thủy
sản, hàm lượng chitin chiếm khá cao so với khối lượng chất khô: mực 3 – 20%,
tôm 33%, cua 70% [1].
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, ñó là cấu trúc gồm nhiều phân tử
ñược nối với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự
nhiên, hiếm khi chitin tồn tại ở trạng thái tự do mà luôn liên kết dưới dạng phức hợp
chitin – protein [4].
2.1.2. Tính chất lý hóa của chitin
2.1.2.1. Tính chất vật lý
Chitin có màu trắng hoặc trắng ngà, vô ñịnh hình. Chitin ở thể rắn, xốp nhẹ,
không màu, không mùi, không vị. Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước
sóng từ 884-890 nm. Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm
loãng, trong cồn và các dung môi thông thường. Nó chỉ tan ñược trong một số acid
vô cơ ñặc như HCl, H2SO4. Chitin tương ñối ổn ñịnh với các chất oxi hóa khử như

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


thuốc tím (KMnO4), oxi già (H2O2), nước javen (NaOCl - NaCl)… do vậy người ta
ñã sử dụng các chất này ñể khử màu cho chitin [1].
2.1.2.2. Tính chất hóa học
- Cấu trúc hóa học của chitin:
Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n
Tên gọi: Poly(1-4)-2acetamido-2deoxy-β-D-glucose;
Poly(1-4)-2acetamido-2deoxy-β-D-glucopyranose

Hình 2.1: Cấu trúc của phân tử chitin [51]
Chitin có cấu trúc gần giống với cellulose, chỉ có vị trí của nhóm hydroxyl
thứ hai trên nguyên tử cacbon ñược thay thế bởi nhóm amino-acetyl. Chitin là
polysaccharide có khối lượng phân tử lớn. Chitin có công thức phân tử:
(C8H13NO5)n, ñược hình thành từ các ñơn phân GlcNAc liên kết với nhau bằng liên
kết β-1,4glycoside [4]. Trong ñó: n thay ñổi tùy theo nguồn thu nhận chitin, tôm thẻ
(n = 400-500), tôm hùm (n = 700-800), cua (n = 500 – 600).
Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và ñều ñặn. Bằng phương pháp nhiễu
xạ tia X. Người ta ñã chứng minh ñược chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình là α, β,
γ-chitin. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi
mắt xích trong mạch. Có thể biểu diễn mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần ñầu
của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần ñuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc
α, β, γ- chitin ñược mô tả như sau [2]:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


α chitin

β chitin

γ chitin

α - chitin có cấu trúc các mạch ñược sắp xếp ngược chiều nhau ñều ñặn,
nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa
các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp
xếp ñảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. ðây cũng là
dạng phổ biến trong tự nhiên [4].
β, γ-chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β-chitin) và hai
song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro.
Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa
cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn [4].
- Một số tính chất hóa học ñiển hình:
Thủy phân chitin bằng HCl ñậm ñặc ở nhiệt ñộ cao cho sản phẩm gồm
88,5% D-glucosamine và 11,5% acid acetic, quá trình thủy phân bắt ñầu xảy ra ở
liên kết glucoside, sau ñó là loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3) [1].
Thủy phân chitin bằng dung dịch NaOH ñậm ñặc ở nhiệt ñộ cao thì chitin sẽ
bị mất gốc acetyl, sản phẩm tạo thành là chitosan và muối CH3COONa [1].
2.2. Tìm hiểu chung về GlcNAc
2.2.1. Công thức cấu tạo
Công thức cấu tạo phân tử của GlcNAc: C8H15NO6
Tên IUPAC: N-[(3R, 4R, 5S, 6R)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl) oxan-3-yl]

Hình 2.2. Công thức cấu tạo của GlcNAc [49]

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


2.2.2. Tính chất của GlcNAc
GlcNAc là một dẫn xuất monosaccharide của glucose. Nó là chất rắn dạng
tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, ñiểm nóng chảy 210 0C, khối lượng
phân tử 221,21 g/mol, ñộ hòa tan nước 167 mg/ml, không tan trong ether và
chloroform. Giống như glucose, GlcNAc cho phản ứng tráng bạc, phản ứng với
Cu(OH)2 cho màu xanh nhạt [54].
Các phân tử GlcNAc với dẫn xuất của chúng ñược sử dụng ñể bảo vệ mặt
ngoài của tế bào hoặc trực tiếp tham gia vào tương tác tế bào, làm tăng ñộ ñặc và
lực tương tác giữa các tế bào [50].
GlcNAc là một thành phần của polysaccharide không ñồng nhất như murein
(là một polysaccharide, thành phần cơ bản của tế bào vi khuẩn) và acid hyaluronic
(là yếu tố chính ảnh hưởng tới sự hình thành mạch, sự vận ñộng của sụn, khớp, ñộ
bám dính và chữa lành vết thương) [14], [6].
Ở người, GlcNAc thường thấy trong các glycoprotein như mô plasinogen
[42], tuyến giáp kích thích hocrmon, gonadotropin màng ñệm ở người giúp cho
khớp vận ñộng dễ dàng hơn. Ở ñộng vật, GlcNAc cũng thấy trong các loài ñộng vật
có vú. Trong thực vật, GlcNAc ñã thấy trong bromelin, ricin, agglutinin và abrus
agglutinin [27].
Do những tác dụng của nó ñối với sức khỏe con người, từ ñầu thế kỷ XXI,
GlcNAc ñược sử dụng trong thực phẩm chức năng và ứng dụng trong y học.
2.2.3. Vai trò của GlcNAc
Nhiều nghiên cứu về GlcNAc ñược thực hiện trên ñộng vật như thử nghiệm
ñộc tính, cấp tính trên các tế bào tủy xương, nhiễm sắc thể tinh hoàn chuột, thử
nghiệm lâm sàng trên người…[26] cho thấy GlcNAc là một chất an toàn, sử dụng

ñể bổ sung dinh dưỡng, ứng dụng trong ñiều trị bệnh cho con người.
2.2.3.1. GlcNAc ñiều trị các về bệnh khớp
GlcNAc ñược sử dụng làm thuốc ñiều trị bệnh thoái hóa khớp, ngoài ra
GlcNAc còn ñược sử dụng như thực phẩm chức năng ñể cải thiện các triệu chứng
do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo sụn khớp, ñiều trị tận gốc nguyên
nhân gây bệnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp GlcNAc của cơ thể bị giảm sút, dễ mắc
các bệnh về viêm xương khớp, người ta ñã bổ sung vào cơ thể GlcNAc dưới dạng
thuốc, có tác dụng chống viêm và kích thích phát triển mô sụn.
Nhiều thử nghiệm lâm sàng ñã ñược thực hiện ñể ñiều trị bệnh nhân rối loạn
khớp bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn
thương sụn, tổn thương khớp, thoái hóa khớp. Các kết quả thử nghiệm trên chỉ ra
rằng GlcNAc có vai trò quan trọng trong việc phòng chống tổn thương khớp [28].
2.2.3.2. GlcNAc ñiều trị viêm ruột
Bệnh viêm ruột (IBD) là bệnh mãn tính gây viêm ở một số phần của ruột. Các
thành ruột trở nên sưng, viêm và phát triển gây loét, gây khó chịu và ảnh hưởng tới tiêu
hóa. IBD là một phần chẩn ñoán chung bao gồm một số bệnh về ñường ruột như: viêm
loét ñại tràng, viêm niêm mạc trực tràng mãn tính và bệnh Crohn. Khi bệnh Crohn tấn
công vào ruột non, cơ thể khó hấp thụ các chất dinh dưỡng. Kém hấp thụ và cảm giác
chán ăn có thể dẫn ñến suy dinh dưỡng [23].
GlcNAc có khả năng tăng cường việc tiết acid mucopolysaccharides bởi các
nguyên bào sợi và khôi phục lại sự hình thành cấu trúc bảo vệ ñường tiêu hóa. Ngoài
ra, GlcNAc làm tăng tính ñàn hồi của các mô quanh mạch, dẫn ñến sự gia tăng lưu
lượng máu qua mao mạch ñộng mạch. GlcNAc hoạt ñộng như một tác nhân bảo vệ
giúp khôi phục lại chức năng bình thường của niêm mạc ruột ở người [23].

Một thử nghiệm lâm sàng ñã ñược thực hiện ñể xác ñịnh hiệu quả ñiều trị
bệnh IBD của GlcNAc. Trẻ em bị bệnh Crohn ñã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau
khi dùng GlcNAc qua ñường uống hay hậu môn. Trong 12 trẻ em tham gia thử
nghiệm có 8 trẻ em cải thiện rõ rệt khi ñược uống GlcNAc như là một liệu pháp
song song với liệu pháp hiện hành, trong khi ñó 4 trẻ còn lại không thấy chuyển
biến. Ngoài ra, 7 trẻ em bị IBD khác cũng dùng GlcNAc qua ñường hậu môn, kết
quả cho thấy có 5 trẻ en cho thấy kết quả rõ rệt, còn lại 2 trẻ còn lại không thấy
chuyển biến và ñiều ñáng quan tâm là 2 trẻ em này trước ñó ñã ñề kháng lại các liệu
pháp ñiều trị khác [40].
Từ những thử nghiệm trên, GlcNAc có triển vọng là một phương pháp ñiều
trị rẻ tiền và không ñộc hại ñối với bệnh IBD mãn tính.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


2.2.3.3. GlcNAc là nguyên liệu sản xuất acid sialic
Acid N-acetylneuraminic (Neu5Ac) là acid sialic phổ biến nhất tồn tại trong
cấu trúc của các loài ñộng vật có vú và gia cầm. Neu5Ac là một phần tử quan trọng
trong hệ thống nhận dạng sinh học, là thuốc thử dùng ñể chuẩn ñoán bệnh virus
cúm, chúng như là một phương thuốc hiệu quả trong việc ñiều trị bệnh cúm [29],
[15]. Sản xuất Neu5Ac từ GlcNAc ñơn giản, dễ thực hiện, thu ñược số lượng lớn.
Theo nghiên cứu của Maru và cộng sự (1998) từ 27 kg GlcNAc thu ñược 29 kg
Neu5Ac [30]. Như vậy, GlcNAc là một nguyên liệu quan trọng ñể sản xuất acid
Neu5Ac.
2.2.3.4. GlcNAc là nguyên liệu sản xuất mỹ phẩm
Da người gồm hai lớp là lớp sừng (lớp ngoài cùng) và lớp hạ bì (lớp bên
trong) ñể bảo vệ cơ thể khỏi các tác ñộng khắc nghiệt của môi trường. Tầng lớp
sừng ñóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì ñộ ẩm, ñộ săn chắc cho da. Lớp
hạ bì bao gồm collagen, elastin… ñược tạo ra bởi các nguyên bào sợi giúp làm tăng

khả năng phục hồi, ñộ bền, ñộ ñàn hồi giúp da luôn khỏe mạnh. Một trong những
nhóm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic và proteoglycan có khả năng giữ
nước cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì ñộ ẩm cho da [9].
Lượng carbonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi
của da giảm và do ñó làm cho da khô, xuất hiện các nếp nhăn. Bổ sung GlcNAc
giúp tăng cường sự phát triển của collagen của nguyên bào sợi, thúc ñẩy sự gia tăng
của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khuôn mặt,
giảm nếp nhăn trên da [9]. Vì vậy GlcNAc ñược coi là một thành phần có giá trị
trong mỹ phẩm, ngoài ra GlcNAc còn ñược sử dụng trong việc giúp cho các vết
thương nhanh hồi phục [13].
2.2.4. Phương pháp sản xuất
2.2.4.1. Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp hóa học
GlcNAc trong lịch sử ñã ñược thương mại thông qua quá trình thủy phân
chitin thô bằng acid mạnh như HCl. Nhiệt ñộ xử lý và nồng ñộ acid phải ñược lựa
chọn cẩn thận. Các thông số này phải ñủ cao ñể thủy phân chitin nhưng không quá
cao ñể tránh các sản phẩm GlcNAc bị phá hủy. ðiều kiện phản ứng thích hợp gồm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


15-36% HCl, nhiệt ñộ 40 – 80 0C. Trong ñiều kiện này có thể sản xuất ñược 6,42
gam/lít GlcNAc trong 1 giờ [7].
Ưu ñiểm của phương pháp này là kinh tế. Nhược ñiểm của phương pháp này
là năng suất thấp dưới 65%, chất thải có tính acid, sản phẩm không ñược coi là tự
nhiên và tinh khiết do có sự biến ñổi hóa học [41]. Mặt khác, GlcNAc sản xuất hóa
học thường có vị ñắng do những chất còn tồn dư như dung môi, tributylamine.
Nhiều công trình ñã ñược thực hiện ñể cải thiện ñộ tinh khiết của GlcNAc
sản xuất bằng phương pháp hóa học. Ryosuke và cộng sự (2002) kết hợp quá trình
thủy phân acid của chitin và trao ñổi ion màng ñể ñiều chế GlcNAc tự nhiên [39].

Zhan (2007) ñã kết tinh ñể ñiều chế GlcNAc với ñộ tinh khiết cao 99,95% [51]. Do
ñó, có thể nghiên cứu sử dụng kết hợp các phương pháp hóa học ñể sản xuất
GlcNAc với giá rẻ trong tương lai.
2.2.4.2. Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp chuyển hóa sinh học
ðể tăng hiệu quả sản xuất GlcNAc phương pháp chuyển hóa sinh học ñã
ñược nghiên cứu và ñề xuất. Một loại vi khuẩn thủy phân chitin là Chitinibacter
tainanensis ñược phân lập từ mẫu ñất ở miền nam ðài Loan ñã ñược chứng minh ñể
sản xuất GlcNAc [12]. Hiệu suất sản phẩm thu ñược là 75% khi sử dụng α-chitin và
98% khi sử dụng β-chitin. Hạn chế của phương pháp này là vi khuẩn có thể bị chết
trong môi trường acid.
GlcNAc ñược sản xuất bằng phương pháp biến ñổi gene của vi sinh vật sử
dụng cơ chất glucose. Theo Deng và cộng sự (2005), chủng E.coli biến ñổi gene ñã
sử dụng glucose ñể tạo ra GlcNAc. Trong nghiên cứu này, ñã thu ñược trên 120 g/l
GlcNAc sau khi lên men trong 60 giờ [12].
Mặc dù hiệu quả sản xuất GlcNAc cao, tuy nhiên phương pháp chuyển hóa
sinh học không sử dụng ñược nguồn phế liệu có sẵn trong tự nhiên, quá trình tinh
sạch từ các chủng khó khăn, chi phí rất cao [12].
2.2.4.3. Sản xuất GlcNAc bằng phương pháp enzyme
GlcNAc sản xuất bằng phương pháp hóa học và biến ñổi sinh học không
ñược thương mại rộng rãi không chỉ vì lý do kỹ thuật mà còn ảnh hưởng tới môi
trường. Lượng lớn các chất thải hóa học sử dụng trong quá trình sản xuất không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


thân thiện với môi trường. Vì vậy, phương pháp sử dụng hệ enzyme chitinase của vi
sinh vật ñã ñược quan tâm [19].
Phương pháp này sử dụng endochitinase cắt các liên kết của chitin một cách
ngẫu nhiên tạo ra các olygosaccharide, sau ñó enzyme β-hexosaminidase tiếp tục

thủy phân liên kết glucoside của các olygosaccharide tạo ra GlcNAc [19], [38]. Một
số enzyme thô ñược phân lập từ Tricoderma viride, Aspergillus niger, Carcica
papaya, Penicillium oxalicum và Aeromonium sản xuất GlcNAc hiệu quả cao [41].
Theo Sashiwa và cộng sự (2002) nghiên cứu sản xuất GlcNAc từ α-chitin bởi
các enzyme thô từ Aeromonas hydrophila H2330 [43], hiệu suất GlcNAc thu ñược
77% trong thời gian 10 ngày. Một nghiên cứu khác của Pichangkura và cộng sự
(2002) sử dụng chitinase thô từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis SK-1 thủy phân αchitin ñể sản xuất GlcNAc, hiệu suất thu sản phẩm GlcNAc ñạt 41% [18].
Một nghiên cứu của Kuk và cộng sự (2005) chủng vi khuẩn ñược phân lập từ
ñất ven biển là Aeromonas sp. GJ-18 có khả năng thủy phân chitin tạo GlcNAc.
Bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy ở ñiều
kiện 45 0C sản phẩm chính của phản ứng thủy phân là GlcNAc và một lượng nhỏ
(GlcNAc)2 và (GlcNAc)3, trên 500C sản phẩm chính là (GlcNAc)2. Tại nhiệt ñộ tối
ưu 45 0C và pH 5 trong 9 ngày hiệu suất thủy phân của enzyme là 94,9% [11].
Theo nghiên cứu của Paramenswaran Binod và cộng sự (2007), sử dụng
endochitinase và chitobiase từ nấm ñể sản xuất GlcNAc. Trong 15 chủng nấm ñược
lựa chọn, chủng Penicillium aceleatum NRRL 2129 cho endochitinase hoạt ñộ cao
nhất, chủng Trichoderuma harzianum TUBF927 cho hoạt ñộ chitobiase cao nhất.
Sự kết hợp hai enzyme từ chủng nấm ñược lựa chọn, tạo ra sản phẩm GlcNAc với
một lượng lớn [37].
Tiếp theo nghiên cứu của Phakapob Settthaketset và cộng sự (2008), sử
dụng chitinase từ chủng nấm mốc Aspergillus sp. kết hợp với β-chitin từ vỏ mực ñể
ứng dụng cho thu nhận GlcNAc. Sau 2 ngày thủy phân, pH4, nhiệt ñộ 45 0C lượng
GlcNAc tạo ra là 65% [38].
Phương pháp sử dụng hệ enzyme từ vi sinh vật trong sản xuất GlcNAc từ
chitin ngày càng ñược sử dụng phổ biến và rộng rãi do có hiệu suất thu GlcNAc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10

cao, khắc phục ñược nhiều hạn chế của phương pháp hóa học và chuyển hóa sinh
học [11], [37], [18].
2.3. Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Lactococcus lactis khả năng ứng dụng
ñể sản xuất enzyme
2.3.1. ðặc ñiểm hình thái Bacillus licheniformis và Lactoccus lactis
2.3.1.1. ðặc ñiểm hình thái Bacillus licheniformis
Vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử hình ô van
không phình, thuộc nhóm hai theo phân loại của Pries và cộng sự [52]. Các tế bào vi
khuẩn này ñứng riêng rẽ hoặc có thể sắp xếp với nhau tạo thành chuỗi. Tế bào vi khuẩn
ngắn, nhỏ có thể thay ñổi tùy theo chuỗi từ 1 – 5µm, ñuờng kính từ 0.5 – 1µm.
2.3.1.2. ðặc ñiểm hình thái Lactococcus lactis
Theo phân loại của Bergay (1994) vi khuẩn lactococcus lactis: Lớp
lactobacillaceae – Họ Streptococeae – Giống: Lactococcus – Loài: Lactococcus
lactis. Dưới loài của Lactococcus lactis gồm: Lc.lactis ssp.cremoris, Lc lactis
ssp.hordniae, Lc lactis ssp. lactis và Lc lactis ssp.Lactis biovar diacetylactis [17]
Tế bào lactococcus lactis hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước 0,5-1,2 x 0,51,5µm. Trong môi trường dịch thể, tế bào thường tồn tại ở dạng kết ñôi hoặc chuỗi
ngắn. Tế bào gram dương, không hình thành nội bào tử, không di ñộng, không có vỏ
bọc, hiếu khí, phản ứng catalase âm tính, phản ứng oxidase âm tính [17].
2.3.2. ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis và Lactococus lactis
2.3.2.1. ðặc ñiểm sinh lý Bacillus licheniformis
Trong tự nhiên có thể phân lập Bacillus licheniformis ở khắp nơi từ ñất,
nước, cây trồng. Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của nó là 50 0C, nhưng nó cũng có thể
tồn tại ở nhiệt ñộ cao hơn nhiều. Tuy nhiên, nhiệt ñộ tốt nhất ñể tiết một số enzyme
là 37 0C [52]. Khi ñiều kiện môi trường khắc nghiệt nó sẽ chuyển sang dạng bào tử
ñể chống chịu tốt hơn và quay về trạng thái sinh dưỡng khi gặp ñiều kiện thuận lợi.
Hiện nay hầu hết các quá trình lên men vi khuẩn ñều ñược thực hiện bằng
các phương pháp nuôi cấy chìm có sục khí, khả năng sinh sinh khối và sinh tổng
hợp enzyme chitinase của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào ñiều kiện môi trường.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


2.3.2.2. ðặc ñiểm sinh lý Lactococcus lactis
Lactococcus lactis lên men lactic một số nguồn carbon, tạo sản phẩm chủ
yếu là L(+) lactic acid. Lactococcus lactis có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng
cần nhiều nguồn cơ chất khác nhau trong môi trường ñể sinh trưởng.
Nhiệt ñộ tăng trưởng tối ưu của Lactococcus lactis là 30 0C, có thể tồn tại ở
10 0C nhưng không sống ñược ở 45 0C. Ngoài ra, Lactococcus lactis có khả năng
tăng trưởng trong môi trường pH 3,5- pH 9,2 nhưng chết ở pH 9,6 và tồn tại ñược
trong môi trường có nồng ñộ NaCl thấp hơn 6,5%.
Bộ gen của Lactococcus lactis có một nhiễm sắc thể vòng, kích thước từ 2,03,1Mbp. Hầu hết các chủng Lactococcus lactis ñều có nhiều plasmid (số lượng từ 211), phổ biến là từ 4-7 plasmid trong tế bào [17].
2.3.3. Ứng dụng của Bacillus licheniformis và Lactococus lactis
2.3.3.1. Ứng dụng của Bacillus licheniformis
Hiện nay, vi khuẩn này ñang ñược chú ý và sử dụng cho mục ñích công
nghiệp như sản xuất enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa. Nó có khả năng
sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào có liên quan tới các chu trình dinh dưỡng trong
tự nhiên.
Bacillus licheniformis cũng ñược ứng dụng là một thành phần quan trọng
trong chất giặt tẩy. Do nó có khả năng phát triển trong môi trường kiềm và sản sinh
ra một protease có thể tồn tại ở pH cao. Protease có pH tối ưu ở khoảng pH 9 và
pH10, do vậy nó có thể loại bỏ protein bao gồm bụi bẩn trong quần áo [51].
Bacillus licheniformis ñược sử dụng ñể sản xuất kháng sinh Bacitracin.
Bacitracin bao gồm một hỗn hợp của các polypeptide tuần hoàn do Bacillus
licheniformis tạo ra nhưng nó lại ñược tạo ra ñể ức chế sự tăng trưởng của Bacillus
licheniformis. Ngoài ra, Bacillus licheniformis cũng ñược sử dụng ñể sản xuất
penicillinase, pentosanases, proticin, citric acid.
Hiện nay ñã có rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới thu nhận chitosanase
từ Bacillus sp. như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium,

Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei,.. và Bacillus licheniformis.
Theo Yasushi Uchida et al (1994), Bacillus licheniformis UTK ñược phân lập từ ñất
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


cho thấy khả năng sinh chitosanase ngoại bào. Sau khi nuôi cấy và thu dịch thô
enzyme, thực hiện các bước làm sạch ñã thu ñược hai enzyme chitosanase C1, C2
có khối lượng khoảng 31 và 26kDa. Nhiệt ñộ tối ưu khoảng 40 - 450C và pH tối ưu
4.6 - 4.9 [43].
Nghiên cứu gần ñây của Ekowati và cộng sự (2006) cũng ñược thực hiện thu
nhận chitosanase từ Bacillus licheniformis MB2 ñược phân lập từ suối nước nóng ở
Manado, Indonesia. Cũng sau quá trình làm sạch thu ñược hai enzyme chitosanase.
chitosanase thứ hai thu ñược có khối lượng phân tử khoảng 75kDa, nhiệt ñộ hoạt
ñộng tối ưu là 700C và khoảng pH tối ưu là pH 6 – pH 7 [8].
2.3.3.2. Ứng dụng của Lactococcus lactis
Trong môi trường có nguồn carbonhydrate phong phú, Lactococcus lên men
carbonhydrate bằng cơ chế lên men lactic ñồng hình, chủ yếu tạo ra L (+) -lactic
acid. Lactic acid ñược tạo ra làm giảm pH môi trường, vì vậy ức chế sự tăng trưởng
của nhiều vi khuẩn khác. Một số chủng Lc.lactis có khả năng ñồng hóa các phân tử
ñường ñơn giản thành các polysaccharide phức tạp, ñược xuất bào và kết hợp với bề
mặt tế bào. Những hợp chất này cung cấp kết cấu vững chắc cho một số sản phẩm
lên men và có thể ñóng vai trò như những tác nhân ổn ñịnh [43], [52].
Trong chủng dưới loài Lc.lactis, chỉ Lc.lactis ssp. lactis biovar diacetylactis
có khả năng sử dụng citrate trong sữa. Sản phẩm tạo thành gồm diacetyl, acetoin,
2,3-butanediol, acetic acid và CO2, những hợp chất này góp phần tạo hương thơm
trong các sản phẩm lên men [8].
Enzyme lipase hoặc esterase của Lc.lactis có hoạt tính phân giải lipid thấp,
chủ yếu ñóng vai trò ñảm bảo chức năng sinh lý của tế bào [43].

Lc.lactis cần nhiều hợp chất protein, peptide, aminoacid ñể sinh trưởng.
Trong môi trường sữa có các amino acid isoleucine, leucine, valine, histidine và
methionine, cần thiết cho sự sinh trưởng của Lactoccos. Những amino acid tự do
này cung cấp nguồn nitơ cho tế bào. Casein, chứa khoảng 80% protein trong sữa sẽ
trở thành nguồn nitơ chủ yếu cho tế bào sau khi nguồn nitơ không phải protein bị
phân giải [52].

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


Lc.lactis là vi khuẩn vi hiếu khí, tế bào của chúng không có chu trình
tricarboncylic acid và thiếu hệ thống vận chuyển ñiện tử. Tuy nhiên, chúng vẫn có
khả năng tồn tại khi có sự hiện diện của oxy nhờ các enzyme chuyển hóa oxy. Với
các enzyme oxidase và superoxide dismutase, tế bào Lc.lactis có thể chuyển O2
thành H2O2 hoặc nước. H2O2 ñược tạo ra, sẽ tích lũy trong môi trường tăng trưởng
do Lc.lactis không có enzyme catalase hoặc NADH peroxidase ñể loại bỏ nó. H2O2
tích lũy trong môi trường có tác ñộng ức chế những vi khuẩn khác vì vậy có hiệu
quả bảo quản sản phẩm lên men [43].
2.4. Giới thiệu về enzyme endochitinase
Chitinase

(còn

gọi

là

poly

β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-

glucosidglucanohydrolase) là hệ enzyme thủy phân chitin, có khả năng thủy giải
liên kết β-1,4 glycoside giữa C1 và C4 của hai monomer N-acetyl-D- glucosamine
trong mạch chitin. Enzyme này có ở nhiều loài sinh vật: vi khuẩn, nguyên sinh ñộng
vật, nấm, thực vật và ñộng vật [16].
Dựa vào khả năng phân cắt, chitinase ñược chia

thành

4

loại:

endochitinase (mã số EC 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.30), chitobiosidase, và
chitobiase [49].
2.4.1. Khối lượng phân tử và cơ chế xúc tác của endochitinase
Endochitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử
khoảng 30 kDa (kilodalton). Ở loài thân mềm, chân ñốt, ñộng vật có xương sống,
một số endochitinase có trọng lượng phân tử 40 – 90 kDa hoặc cao hơn là khoảng
120 kDa. Trọng lượng phân tử của endochitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có
khoảng biến ñộng rộng, từ 30 ñến 120 kDa [16].
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch phân tử chitin một cách ngẫu
nhiên, tạo ra các ñoạn oligosaccharides có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng
chiếm ña số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2. Cơ chế xúc tác của endochitinase
ñã ñược nghiên cứu từ dịch chiết nấm Trichoderma harzianum và Gliochadium
virens [49].

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


Hình 2.3: vị trí phân thủy phân của endochitinase
2.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH ñến hoạt ñộng của endochitinase
Theo nhiều nghiên cứu, endochitinase hoạt ñộng ở giới hạn nhiệt ñộ từ 20 – 50
0

C. Nhìn chung nhiệt ñộ tối ưu cho endochitinase ở sinh vật hoạt ñộng là 400C, ngoại

trừ Aspergillus niger tổng hợp endochitinase có nhiệt ñộ tối thích là 500C [49].
Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà endochitinase có thể có những nhiệt ñộ tối
thích khác nhau, endochitinase thu nhận từ Bacillus lichenifomis cho thấy khả năng
chịu ñựng nhiệt ñộ cao ñến 800C. Theo Bendt (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân
chitin mạnh nhất của từ Vibrio sp. từ 30–40 0C, và endochitinase chịu nhiệt từ
chủng Bacillus sp. BG 11 có hoạt tính cao nhất ở 40-600C. Lorito (1998) ñã khảo
sát hoạt tính endochitinase từ chủng Trichoderma harzianum nhận thấy enzyme này
có thể hoạt ñộng trong khoảng nhiệt ñộ rộng từ 20-60 0C, nhiệt ñộ tối thích là 40 0C.
Ngược lại, endochitinase từ côn trùng thường không ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 400C [21].
Giá trị pH tối thích của endochitinase từ 4-9 ñối với các endochitinase ở
thực vật bậc cao và tảo; endochitinase ở ñộng vật là từ 4,8-7,5 và ở vi sinh vật là
từ 3-8,0 [49].
2.4.3. Nguồn thu nhận endochitinase
Trong tự nhiên endochitinase có thể ñược thu nhận từ nhiều nguồn sinh vật
khác nhau như vi khuẩn, nấm, ñộng vật, thực vật. Nguồn vi khuẩn chính ñể thu
endochitinase là nhóm Streptomycetes, ngoài ra còn có các nhóm khác như:
Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio… Vi khuẩn tổng
hợp chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường ñể tạo nguồn carbon cho vi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15