TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN và TINH CHẾ HFGF 2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR 2) tái tổ hợp từ ESCHERICHIA COLI 3

Kết quả - Biện luận

CHƢƠNG III.
KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN

- 56 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.1 Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
3.1.1. Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR
Gen fgf2 đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp PCR với khuôn là plasmid pIDT-fgf2.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn,
kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.1.

Hình 3.1. Sản phẩm PCR thu nhận gen fgf2; giếng 1, thang DNA 1kb plus;
giếng 2, sản phẩm PCR đoạn gene fgf2 với cặp mồi FGF2-F và FGF2-R
Trong hình 3.1, ở giếng 2 xuất hiện một vạch DNA có kích thƣớc khoảng 450bp
khi so sánh với thang chuẩn 1kb plus (giếng 1), bằng với kích thƣớc dự đoán của gen
fgf2. Nhƣ vậy, chúng tôi có thể đã khuếch đại đƣợc đúng đoạn gen mục tiêu cần dùng.
Sau đó, đoạn gen fgf2 thu đƣợc từ phản ứng PCR sẽ đƣợc xử lý với cặp enzyme BamHI
và NdeI để chuẩn bị cho phản ứng nối với plasmid pET-His đã cắt mở vòng để tạo
plasmid tái tổ hợp.

- 57 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Kết quả - Biện luận

3.1.2. Thu nhận và xử lý plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI
Để chuẩn bị một lƣợng lớn vector cho phản ứng nối, chúng tôi tiến hành cấy
E.coli DH5α mang plasmid pET-His vào ống nghiệm chứa môi trƣờng LB lỏng, nuôi
cấy lắc qua đêm ở 37oC, tách chiết và xử lý plasmid thu nhận đƣợc bằng hai enzyme
cắt hạn chế BamHI và NdeI nhằm chuẩn bị cho chiến lƣợc tạo dòng đầu dính. Kết quả
thu nhận plasmid đƣợc trình bày trong hình 3.2.

Hình 3.2. Kết quả thu nhận và cắt mở vòng plasmid pET-His; giếng
1, thang DNA 1kb; giếng 2, Plasmid pET-His; giếng 3, plasmid
pET-His cắt bằng enzyme BamHI và NdeI.
Plasmid pET-His có kích thƣớc 4636bp, mang trình tự nhận biết của hai enzyme
BamHI (4122) và NdeI (4088). Trƣớc khi xử lý, plasmid pET-His tách chiết cho 2 vạch
tƣơng ứng với hai trạng thái tự nhiên khác nhau của plasmid (giếng 2). Sau khi xử lý
với hai enzyme BamHI (4122) và NdeI (4088), plasmid trở về dạng thẳng có kích
thƣớc khoảng 4602bp (giếng 3) nằm giữa hai vạch 4000bp và 5000bp của thang 1kb.

- 58 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách chiết đƣợc plasmid pET-His và cắt mở vòng thành công
plasmid này.
3.1.3. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α
Sau khi xử lý và tinh sạch plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI,

chúng tôi thực hiện phản ứng nối trực tiếp plasmid này với gen fgf2. Hỗn hợp sản
phẩm nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5α. Thực hiện đối chứng âm là
tế bào DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.3.

Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α
1, Đĩa đối chứng;2, Đĩa biến nạp
Ở đĩa đối chứng, các tế bào E. coli DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối
pET-fgf2 nên không mang gen kháng kháng sinh. Do đó, các tế bào này không tăng
trƣởng đƣợc trên đĩa môi trƣờng LB-Amp100.
Ở đĩa biến nạp, các tế bào E. coli DH5α đƣợc biến nạp với hỗn hợp sản phẩm nối
chứa pET-fgf2 có mang gen kháng kháng sinh. Do đó, các tế bào này tăng trƣởng đƣợc
trên đĩa môi trƣờng LB Amp100. Các khuẩn lạc mọc đƣợc trên môi trƣờng LBAmp100 sẽ đƣợc tiếp tục kiểm tra để chọn lọc dòng mang vector tái tổ hợp.
- 59 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.1.4. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
Để khẳng định các thể biến nạp thu đƣợc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2, chúng
tôi tiến hành sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc các thể biến nạp bằng cặp mồi đặc hiệu
FGF2-F/FGF2-R và cặp mồi T7 promoter/T7 terminator. Kết quả đƣợc trình bày ở
hình 3.4.

Hình 3.4. Kết quả sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5α bằng PCR khuẩn lạc
giếng 1, thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi
FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pIDT-fgf2 bằng cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 5,
PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6,7,
PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator.

- 60 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Cặp mồi FGF2-F/FGF2-R sẽ bắt cặp đặc hiệu với trình tự ở hai đầu gen nên đoạn
khuếch đại sẽ có kích thƣớc 438bp. Cặp mồi T7promoter/T7terminator bắt cặp đặc
hiệu với vùng T7promoter và T7terminator trên plasmid nên sản phẩm khuếch đại sẽ
có kích thƣớc dự đoán sẽ là 618bp bao gồm gen fgf2 và một đoạn DNA trên plasmid
pET-His.
Kết quả điện di cho thấy ở giếng 4 xuất hiện một vạch PCR có kích thƣớc nằm
giữa hai vạch thang 250bp và 500bp, ngang với vạch PCR của mẫu chứng dƣơng
(giếng 3). Trong khi đó, với đối chứng âm là plasmid pET-His không mang gen fgf-2
nên không xuất hiện vạch (giếng 2, hình 3.4).
Bên cạnh đó, ở giếng 6, sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng mồi T7promoter
/T7terminator cho sản phẩm PCR là một vạch nằm ở khoảng giữa vạch 500bp và
750bp của thang chuẩn, phù hợp với kích thƣớc đoạn mang gen giữa hai mồi theo dự
đoán là 618bp. Đây là kích thƣớc của gen fgf2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai
mồi trên vector. Trong khi đó, sản phẩm PCR plasmid pET-His làm khuôn chỉ cho một
vạch có kích thƣớc 180bp (giếng 5, hình 3.4). Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã sàng lọc
đƣợc những khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2. Những khuẩn lạc cho kết quả
dƣơng tính đƣợc tách plasmid, tiếp tục kiểm tra sự hiện diện của gen fgf2 bằng phƣơng
pháp PCR plasmid và enzyme cắt hạn chế.
3.1.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phƣơng pháp PCR và
enzyme cắt giới hạn
Các thể biến nạp cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc tiếp tục tách chiết
thu nhận plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp SDS-kiềm. Sau đó, các plasmid tái tổ

hợp pET-fgf2 đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R, cặp mồi T7promoter/T7terminator và bằng enzyme cắt hạn chế. Kết quả
kiểm tra đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Ở giếng thứ 3 (hình 3.5), xuất hiện một vạch có kích thƣớc nằm giữa hai vạch
thang 250bp và 500bp, tƣơng ứng với kích thƣớc gen fgf-2 đƣợc khuếch đại bằng mồi
đặc hiệu (438bp). Bên cạnh đó, sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp bằng cặp mồi
- 61 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

T7promoter/T7terminator cho một vạch có kích thƣớc nằm giữa khoảng 500-700bp
tƣơng ứng với tổng kích thƣớc của gen fgf-2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai mồi
trên plasmid (giếng 5).

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp
PCR và cắt hạn chế; giếng 1, Thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His
với cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pET-fgf2 bằng mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi MCS
T7promoter/T7terminator; giếng 5, PCR plasmid pET-fgf2 bằng cặp mồi
T7promoter/T7terminator; giếng 6, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2; giếng 7, Plasmid
tái tổ hợp pET-fgf2 cắt bằng enzyme EcoRI; giếng 8, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
cắt bằng hai enzyme BamHI và NdeI.
Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi đƣợc cắt bằng EcoRI cho một vạch có
kích thƣớc ngang với vạch thang 5000bp của thang chuẩn, chứng tỏ plasmid này đã
đƣợc chèn thêm một đoạn gen. Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi đƣợc cắt bằng BamHI

- 62 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Kết quả - Biện luận

và NdeI cho hai vạch tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pET-His (4636bp) và đoạn gen
fgf2 (438bp) đƣợc nối vào (giếng 8).
Các kết quả phân tích bằng phƣơng pháp PCR và enzyme cắt giới hạn cho phép
kết luận chúng tôi có thể đã nối thành công gen fgf2 vào plasmid pET-His.
3.1.6. Kiểm tra giải trình tự gen fgf2
Nhằm khẳng định độ chính xác về trình tự so với thiết kế ban đầu cũng nhƣ sự
đồng khung dịch mã, các plasmid tái tổ hợp dự tuyển sau khi đã kiểm tra sự hiện diện
của gen fgf2 đƣợc tách chiết và gửi đi giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger cải tiến
trên máy Big DyeTM terminator (Macrogen, Hàn Quốc).
Kết quả giải trình tự gen fgf2 trên plasmid pET-fgf2 đƣợc so sánh với trình tự lý
thuyết bằng phần mềm Jellyfish. Kết quả so sánh cho thấy gen đã đƣợc tạo dòng có độ
tƣơng đồng 100%với trình tự thiết kế và đồng khung dịch mã với bộ ba khởi đầu trên
vector. Ngoài ra, khi so sánh với vector tái tổ hợp mang gen fgf2 trƣớc đây [2] cho thấy
có sự thay thế các cystein thành các acid amin khác, đúng với kết quả thiết kế ban đầu.
Tuy nhiên, do kết quả của luận văn sẽ đƣợc tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu sắp
công bố tiếp theo nên các thông tin cụ thể về quá trình biến đổi không đƣợc trình bày
trong khuôn khổ luận văn này.
Nhƣ vậy, chúng tôi đã cấu trúc thành công plasmid pET-fgf2.
3.2. Cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3) biểu hiện protein fgf-2
3.2.1. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3)
Plasmid pET-fgf2 đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp SDS-kiềm từ chủng E. coli
DH5α/pET-fgf2 đƣợc biến nạp vào chủng BL21(DE3) và sàng lọc trên môi trƣờng LBAmp100.

- 63 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Kết quả - Biện luận

Hình 3.6. Kết quả biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3)
1, Đĩa đối chứng; 2, Đĩa biến nạp
Trên đĩa đối chứng (1), chúng tôi tiến hành trải những tế bào không mang
plasmid tái tổ hợp pET-fgf2. Những tế bào này không có khả năng kháng kháng sinh,
nên không phát triển đƣợc trên môi trƣờng LB-Amp, vì vậy không thấy xuất hiện
khuẩn lạc trên đĩa (1). Ngƣợc lại, trên đĩa biến nạp (2), những thể biến nạp có mang
plasmid tái tổ hợp nên có khả năng kháng kháng sinh, phát triển và tạo khuẩn lạc.
Sau đó, các khuẩn lạc này đƣợc kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R để sàng lọc những thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp mong muốn.
3.2.2. Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc
Các khuẩn lạc mọc đƣợc trên môi trƣờng LB-Amp100 đƣợc chọn thực hiện kiểm
tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R.

- 64 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Hình 3.7. Kết quả PCR khuẩn lạc tế bào E. coli BL21(DE3) bằng cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 1, thang chuẩn 1kb; giếng 2, sản phẩm PCR plasmid pET-His; giếng
3, sản phẩm PCR plasmid pIDT-fgf2; giếng 4, sản phẩm PCR khuẩn lạc E. coli
BL21(DE3).
Kết quả điện di cho thấy ở giếng 2 không thấy xuất hiện vạch khuếch đại do
khuôn mẫu sử dụng là vector không mang gen fgf2, còn ở giếng 4 xuất hiện một vạch
DNA có kích thƣớc bằng với kích thƣớc của mẫu chứng dƣơng (giếng 3). Nhƣ vậy,
chúng tôi đã biến nạp thành công pET-fgf2 vào chủng E. coli BL21(DE3). Những

khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2 này sẽ đƣợc sử dụng để
kiểm tra khả năng biểu hiện protein mục tiêu.
3.3. Xác nhận sự biểu hiện của protein tái tổ hợp FGF-2 trong chủng BL21(DE3)
/pET-fgf2
Các dòng E. coli mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 sẽ đƣợc nuôi cấy và cảm ứng
bằng IPTG để kiểm tra khả năng biểu hiện protein FGF-2. Kết quả kiểm tra sự biểu
hiện protein FGF-2 đƣợc trình bày trong hình 3.8.

- 65 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Hình 3.8. Kết quả điện di SDS-PAGE (A) và lai Western (B) xác nhận sự biểu hiện
FGF-2; 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(-);
3, E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) protein tổng số; 4, E. coli BL21(DE3)/pETfgf2, IPTG(+) thể vùi; 5, E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) thể tan.
Dựa vào kết quả điện di ta thấy ở giếng 2 tƣơng ứng mẫu E. coli
BL21(DE3)/pET-fgf2 không đƣợc cảm ứng IPTG thì không xuất hiện vạch protein
mong muốn. Giếng 3, 4, 5 là các mẫu protein tƣơng ứng với protein tổng số, protein
trong thể vùi và protein hòa tan của chủng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2 đƣợc cảm ứng
IPTG 0,3mM trong môi trƣờng LB-Amp. Kết quả cho thấy ở giếng 3 xuất hiện một
vạch protein đƣợc biểu hiện vƣợt mức nằm giữa hai vạch kích thƣớc của thang chuẩn
là 14,4kDa và 20,1kDa tƣơng ứng với kích thƣớc dự đoán của protein FGF-2 (18kDa).
Kết quả phân tích dạng biểu hiện cho thấy, protein này chủ yếu biểu hiện ở dạng thể
tan (giếng 5). Đồng thời, kết quả lai Western cho thấy xuất hiện các vạch tín hiệu
tƣơng ứng ở những vị trí vạch protein FGF-2 trên bản điện di SDS-PAGE. Điều này
cho phép khẳng định vạch protein trong kết quả điện di là protein mục tiêu FGF-2.
Nhƣ vậy có thể kết luận chúng tôi đã biểu hiện thành công protein FGF-2 ở dạng

tan từ dòng tế bào E. coli BL21(DE3).

- 66 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein
FGF-2 tái tổ hợp dạng tan
3.4.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng
Quá trình lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc tiến hành bằng hệ thống lên men tự động trong vòng 24
giờ với chất cảm ứng là IPTG bổ sung ở giờ thứ 8. Sự tăng trƣởng của chủng trong
suốt quá trình lên men đƣợc theo dõi thông qua việc phân tích trọng lƣợng khô tế bào
sau mỗi 2 giờ lên men. Kết quả phân tích trọng lƣợng khô tế bào đƣợc trình bày trong
hình 3.9.

Hình 3.9. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men. Hình đại
diện cho ba lần thí nghiệm lặp lại
Dựa vào đồ thị cho thấy trọng lƣợng khô của tế bào tăng dần trong suốt quá trình
lên men và ổn định ở những giờ cuối. Điều này phù hợp với đặc trƣng tăng trƣởng của
chủng, chứng tỏ sự xuất hiện của vector tái tổ hợp không làm thay đổi đặc tính sinh lý
của chủng. Theo kết quả phân tích trọng lƣợng khô tế bào, lƣợng tế bào khô thu nhận

- 67 -

Luận văn thạc sĩ sinh học

Kết quả - Biện luận

đƣợc là 5,2 g/lít môi trƣờng lên men. Tuy nhiên, kết quả này chỉ mới là bƣớc đầu lên
men. Do đó, cần có những khảo sát và phân tích sâu hơn để mang lại hiệu quả lên men
cao nhất.
3.4.2. Khảo sát sự biểu hiện protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng
Trong quá trình lên men, chúng tôi tiến hành thu mẫu sau khi cảm ứng IPTG mỗi 2
giờ để theo dõi sự biểu hiện protein FGF-2 của chủng. Sau đó, mẫu đƣợc xử lý và điện
di SDS-PAGE. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein pha tan trong suốt quá
trình lên men đƣợc trình bày trong hình 3.10.

Hình 3.10. Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein ở pha tan tại các thời điểm lên men.
1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2-10: lượng protein pha tan tương ứng từ
BL21(DE3)/pET-FGF sau 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 giờ lên men
Tại thời điểm giờ lên men thứ 8, chất cảm ứng IPTG đƣợc bổ sung và protein mục
tiêu bắt đầu đƣợc tạo thành. Do đó, ở giờ nuôi cấy thứ 8 (giếng 2) không có sự biểu
hiện của protein mục tiêu. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy bắt đầu từ giờ nuôi cấy
thứ 10 (giếng 3) vạch protein mục tiêu xuất hiện và mức độ biểu hiện của protein này
cũng tăng dần trong suốt quá trình lên men. Để đánh giá chính xác sự biểu hiện FGF-2
- 68 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

dạng tan trong chủng, chúng tôi tiến hành định lƣợng bằng phần mềm Quantity One
(Biorad). Kết quả định lƣợng này đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phụ lục 2.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy phần trăm tỉ lệ protein FGF-2 trong pha tan tăng trong

suốt quá trình lên men. Tỉ lệ này đạt cao nhất ở giờ thứ 24, lƣợng FGF-2 chiếm 10,9%
lƣợng protein tổng. Tuy nhiên, kết quả cho thấy chủng biểu hiện không ổn định, lƣợng
protein mục tiêu không tăng đều theo thời gian. Do đó, cần phải có những khảo sát mở
rộng nhằm đánh giá thời điểm dừng lên men để mang lại sản lƣợng cao nhất và chi phí
sản xuất thấp nhất.
Bảng 3.1. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha
tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men
Thời gian lên

Thời gian sau cảm

Tỉ lệ FGF-2

men (giờ)

ứng (giờ)

trong pha tan (%)

10

2

5,8

12

4

7,5

14

6

9,9

16

8

8,8

18

10

10,4

20

12

9,6

22

14

9,6

24

16

10,9

3.4.3. Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao
Sau 24 giờ lên men, toàn bộ dịch lên men đƣợc ly tâm thu nhận sinh khối E. coli.
Sinh khối đƣợc phá tế bào bằng phƣơng pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao. Nhằm
đảm bảo lƣợng FGF-2 dạng tan có thể thu nhận đƣợc sau quá trình phá tế bào là cao
nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát số chu kỳ phá mẫu. Mẫu protein thể vùi và thể tan

- 69 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

sau mỗi chu kì phá mẫu đƣợc tiến hành điện di SDS-PAGE nhằm xác định lƣợng FGF2 thu đƣợc sau mỗi chu kỳ. Kết quả điện di này đƣợc trình bày trong hình 3.3.
Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE các mẫu phá tế bào theo chu kì cho thấy dịch
sinh khối tế bào phần lớn đƣợc phá ngay chu kì đầu tiên và protein mục tiêu nằm trong
phân đoạn dịch tan của tế bào. Để xác đinh chu kì phá tế bào tối ƣu, chúng tôi sử dụng
phần mềm Quantitive One để xác định phần trăm lƣợng protein mục tiêu thu đƣợc
trong dịch tan sau mỗi chu kì phá tế bào. Từ số liệu có đƣợc, chúng tôi sẽ xác định
đƣợc chu kì phá mẫu tối ƣu để thu nhận lƣợng protein mục tiêu là cao nhất.

Hình 3.11. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế bào
bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao. 1, Thang protein phân tử

lượng thấp; 2, dịch protein tổng; 3, 4, Dịch lên men sau 1 chu kì phá tế bào thể vùi
(3) và thể tan (4); 5, 6, Dịch lên men sau 2 chu kì phá tế bào thể vùi (5) và thể tan
(6); 7, 8, Dịch lên men sau 3 chu kì phá tế bào thể vùi (7) và thể tan (8).

- 70 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy sinh khối tế bào đƣợc phá hoàn toàn. Đồng
thời dựa vào kết quả Quantity One (phụ lục 3) thì tại chu kì phá tế bào thứ hai, lƣợng
protein mục tiêu thu đƣợc ở pha tan là nhiều nhất (bảng 3.2). Do đó, dịch sinh khối nên
đƣợc phá dƣới áp suất cao bằng hai chu kì để tế bào đƣợc phá hoàn toàn và đạt hiệu
suất cao nhất.
Bảng 3.2. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha tan
(%) sau mỗi chu kì phá tế bào
Số chu kì

% FGF-2 pha tan

1

12,6

2

13,2

3

12,6

Dịch nổi thu nhận sau khi ly tâm đƣợc định lƣợng Bradford nhằm đánh giá hiệu quả
của quá trình lên men. Kết quả sau xử lý đƣợc trình bày ở bảng 3.
Bảng 3.3. Hiệu quả thu nhận FGF-2 ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF sau quá
trình lên men
Sinh khối khô (g/l) (X)

5,20 ± 0,53

Lƣợng protein tổng thu đƣợc trong 1
lít dịch lên men (g) (Y)
% FGF-2 trong pha tan (Z)

2,11 ± 0,29
10,9

Lƣợng FGF-2 (g/l) (T)

0,23 ± 0,03

Hiệu quả thu nhận FGF-2 (E%)

4,42 ± 0,97

Kết quả ghi nhận đƣợc ở bảng 3.3 cho thấy quá trình lên men chủng
BL21(DE3)/pET-FGF thu đƣợc 0,23 ± 0,03 g protein FGF-2 dạng tan trong một lít
dịch lên men với tỉ lệ FGF-2 trong pha tan là 10,9%, đạt hiệu quả thu nhận FGF-2 là

4,42%.

- 71 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.5. Tinh chế FGF-2
3.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation
Nhiều nghiên cứu cho thấy FGF-2 bền ở pH trung tính, do vậy chúng tôi tiến hành
tinh chế FGF-2 ở pH 7. Mặt khác, FGF-2 có điểm đẳng điện pI=9,6 nên ở bƣớc tinh
chế đầu tiên, chúng tôi sử dụng sắc ký trao đổi cation nhằm thu nhận FGF-2.
Ở bƣớc tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation, chúng tôi thực hiện với hai mẫu dịch
protein xử lý khác nhau. Mẫu thứ nhất chúng tôi chỉ tiến hành chỉnh pH về 7 và mẫu
thứ hai chúng tôi chỉnh pH về 7 và đồng thời bổ sung thêm MgCl 2 đạt nồng độ cuối
1mM. Ở cả hai mẫu tinh chế, protein mục tiêu đều dung ly ở phân đoạn 20% dung dịch
B và kết quả chạy SDS-PAGE cho thấy ở mẫu chỉ chỉnh pH (phụ lục 7), protein thu
đƣợc sau khi dung ly có nhiều vạch protein tạp hơn mẫu có bổ sung thêm MgCl 2 (hình
3.12).
Do ở nồng độ muối càng cao, protein càng không bền. Nên ở bƣớc tiếp theo, chúng
tôi tiến hành giảm nồng độ dung ly protein xuống 10%. Kết quả SDS-PAGE (phụ lục
8) cho thấy một lƣợng nhỏ protein mục tiêu phân ly ở phân đoạn này, phần lớn protein
nằm trong phân đoạn dung ly 20% dung dịch B. Vì vậy, chúng tôi vẫn chọn dung ly
protein mục tiêu với nồng độ 20% dung dịch B.

Hình 3.12. Hình điện di SDS-PAGE (A) và Western Blot (B) với kháng thể kháng
FGF-2 sản phẩm tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation. 1, thang protein phân tử lượng
- 72 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

thấp; 2, mẫu protein trước khi qua cột; 3, phân đoạn protein không gắn lên cột; 4-8
lần lượt là phân đoạn 20%, 40%, 60%, 80%, 100% dung dịch dung ly B.
Kết quả điện di SDS-PAGE đƣợc trình bày ở hình 3.12 cho thấy ở phân đoạn 20%
dung dịch B xuất hiện một vạch protein nằm giữa 2 vạch có kích thƣớc 14,4kDa và
20,1kDa trên thang chuẩn, phù hợp với khối lƣợng của FGF-2 (18kDa) và cho tín hiệu
dƣơng tính khi lai với kháng thể kháng FGF-2. Do vậy, chúng tôi kết luận đây chính là
vạch FGF-2 mục tiêu. Ở những phân đoạn dung ly tiếp theo, chúng tôi không thấy xuất
hiện vạch protein mục tiêu. Nhƣ vậy protein mục tiêu đã đƣợc dung ly hoàn toàn ở
20% dung dịch B. Protein ở phân đoạn 20% đƣợc thu nhận, đánh giá độ tinh sạch cũng
nhƣ hiệu suất thu hồi và tiếp tục đƣợc tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin tiếp theo
nhằm thu nhận FGF-2 tinh sạch trên 95%.
Hiệu quả của quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation đƣợc đánh giá bằng phần
mềm Quantity One (phụ lục 5) và phƣơng pháp Bradford. Kết quả tính toán cho thấy
với cột trao đổi cation SP FF 5ml, chúng tôi đã thu nhận protein tái tổ hợp FGF-2 có độ
tinh sạch 78,5% với hiệu suất thu hồi là 60,06% (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Hiệu suất của quá trình tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation
Nồng độ

Tổng

protein

protein

(mg/ml)

(mg)

30

3,34

100,20

6,90

6,91

12

0,44

5,28

78,50

4,15

Mẫu

Thể tích

tinh chế

(ml)

Trƣớc
Sau
Hiệu suất

Độ tinh
sạch (%)

Lƣợng
FGF-2
(mg)

60,06%

3.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin
Do FGF-2 có thể tƣơng tác đặc hiệu với heparin, nên trong thí nghiệm này sử dụng
cột sắc ký Heparin để tinh chế bƣớc hai nhằm tăng độ tinh sạch của sản phẩm protein
tái tổ hợp FGF-2 lên trên 95%.

- 73 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế bằng sắc kí ái lực heparin cho thấy,
ở giếng 4 (hình 3.13) tƣơng ứng với phân đoạn dung ly 60% dung dịch B xuất hiện
một vạch duy nhất khoảng 18kDa, ngang với vạch FGF-2 trƣớc tinh chế. Đồng thời,

kết quả lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng FGF-2, đều xuất hiện vạch tín
hiệu tƣơng ứng với vạch protein trên gel SDS-PAGE. Do đó, chúng tôi khẳng định
protein đƣợc thu nhận ở giếng 4 chính là FGF-2 mục tiêu.

Hình 3.13. Hình điện di SDS (A) và Western Blot (B) với kháng thể kháng
FGF-2 sản phẩm tinh chế bằng sắc ký ái lực với Heparin. 1, thang protein
phân tử lượng thấp; 2, mẫu trước khi qua cột; 3, mẫu không bám vào cột
Heparin; 4, mẫu tinh chế thu ở phân đoạn dung ly 60% dung dịch B.
Sử dụng phần mềm Quantity One (phụ lục 6) và phƣơng pháp đo Bradford cho
thấy, protein tái tổ hợp FGF-2 thu đƣợc sau tinh chế Heparin có độ tinh sạch 97,10%
với hiệu suất thu hồi sản phẩm 76,73% (bảng 3.5).

- 74 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Bảng 3.5. Hiệu suất tinh chế FGF-2 trên cột Heparin
Mẫu tinh Thể tích

Nồng độ
protein

Lƣợng

Tổng

Độ tinh

protein (mg)

sạch (%)

FGF-2

chế

(ml)

Trƣớc

30

0,34

10,20

78,50

7,65

Sau

11

0,55

6,05

97,10

5,87

(mg/ml)

Hiệu suất

(mg)

76,73%

Từ các kết quả đạt đƣợc ở trên, chúng tôi tính toán cho thấy từ một lít dịch lên men
dòng E.coli BL21(DE3)/pET-FGF, chúng tôi thu nhận đƣợc 106,15 mg FGF-2 dạng
tinh sạch, đạt hiệu suất thu hồi khoảng 46,08% (bảng 3.6).
Bảng 3.6. Tóm tắt hiệu quả quá trình thu nhận FGF-2 từ một lít dịch lên men
chủng BL21(DE3)/pET-FGF
Khối lƣợng
Bƣớc thu nhận

FGF-2
(mg)

Pha tan dịch
đồng nhất tế bào
Tinh chế
trao đổi cation
Tinh chế
ái lực heparin

Độ tinh
sạch (%)

Hiệu suất
riêng của
bƣớc (%)

Hiệu suất
thu hồi (%)

230,33

6,90

100

100

138,34

78,50

60,06

60,06

106,15

97,10

76,73

46,08

- 75 -

Luận văn thạc sĩ sinh học