Nghiên cứu thành phần flavonoit từ cây ficus microcapa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN XUÂN BÁCH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOIT
TỪ CÂY FICUS MICROCAPA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. PHAN VĂN KIỆM

HÀ NỘI - 2011


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu cấu trúc
– Viện Hóa sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.
Phan Văn Kiệm, Viện Hóa sinh biển-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện khóa
luận tốt nghiệp.
Em xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Văn Bằng, Khoa Hóa
học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện và hoàn thiện khóa luận.

Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo trong khoa Hóa học, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ Viện Hóa sinh biển-Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này dù rất cố gắng nhưng
em vẫn không tránh khỏi một số sai sót. Vì vậy em kính mong nhận được sự góp
ý chỉ bảo của các thầy, cô và các ban sinh viên quan tâm.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2011

Sinh viên

Nguyễn Xuân Bách

K33C – Khoa Hóa học

ii

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả trong khóa luận này là trung thực. Các kết quả không trùng với các kết
quả đã được công bố. Nếu có bất kỳ vấn đề gì không đúng tôi xin hoàn toàn chịu
trách nhiệm.

Sinh viên

Nguyễn Xuân Bách

K33C – Khoa Hóa học

iii

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PHỤ LỤC: DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG
Trang
MỞ ĐẦU................................................................................................

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN................................................................

3

1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Gừa .................................

3

1.1.1. Mô tả.....................................................................................

3

1.1.2. Phân bố, sinh thái..................................................................

3

1.1.3. Thành phần hoá học..............................................................

4

1.1.4. Công dụng.............................................................................

5

1.2. Lớp chất Flavonoit, thành phần hoá học có trong cây Gừa.............

6

1.2.1. Giới thiệu chung....................................................................

6

1.2.2. Các nhóm flavonoit...............................................................

6

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật...............................................

10

1.3.1. Chọn dung môi chiết.............................................................

10

1.3.2. Quá trình chiết.......................................................................

12

K33C – Khoa Hóa học

iv

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ.........

14

1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký.............................

14

1.4.2. Cơ sở phương pháp sắc ký....................................................

14

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký........................................

15

1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất
hữu cơ..............................................................................................

17

1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR).........................

18

1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).............................

18

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR).......................................................................

19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1. Mẫu thực vật....................................................................................

22

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất................................................

22

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC).........................................................

22

2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế.....................................................

23

2.2.3. Sắc ký cột (CC)....................................................................

23

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất.....................

23

2.3.1. Điểm nóng chảy (MP)...........................................................

23

2.3.2. Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS)...........................

23

2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).....................................

23

2.3.4. Độ quay cực []D .................................................................

24

K33C – Khoa Hóa học

v

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

2.4. Dụng cụ và thiết bị...........................................................................

24

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết................................................

24

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc....................................

24

2.5. Hoá chất...........................................................................................

25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.................................

26

3.1. Chiết và phân lập các hợp chất …………………………………...

26

3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất ……………..

28

3.2.1. Hợp chất 1 (FM-19A2)……………………………………..

28

3.2.2. Hợp chất 2 (Catechin) ...........................................................

28

CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ……………………………..

30

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (FM-19A2)……………

30

4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (TGGT3)……………...

34

KẾT LUẬN............................................................................................

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................

43

K33C – Khoa Hóa học

vi

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
[]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

C NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1

H NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry

FAB-MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High
Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

K33C – Khoa Hóa học

vii

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

PHỤ LỤC
Danh mục các hình vẽ và bảng

Trang

Hình 1.1: Lá và quả cây Gừa

11

Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen)

14

Hình 1.3: Flavon

15

Hình 1.4: Flavonol

15

Hình 1.5: Flavanon

15

Hình 1.6: Flavanonol-3

15

Hình 1.7: Chalcon

16

Hình 1.8: Auron

16

Hình 1.9: Antoxianidin

16

Hình 1.10: Leucoantoxianidin

16

Hình 1.11: (+) Catechin

17

Hình 1.12: (-) Catechin

17

Hình 1.13: 3-phenyl chromen

17

Hình 1.14: 3-phenylchromen-4-one

17

Hình 1.15: Rotenoit

18

Hình 2.1: Ảnh cây Gừa và ảnh mẫu tiêu bản

30

Hình 3.1: Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ lá Gừa.

35

Hình 4.1.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 (FM-19A2)

38

Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 (FM-19A2)

39

K33C – Khoa Hóa học

viii

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

Hình 4.1.3 Phổ ESI-MS của hợp chất 1 (FM-19A2)

41

Hình 4.1.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (FM-19A2)

41

Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 (TGGT3)

42

Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 (TGGT3)

43

Hình 4.2.3. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 2 (TGGT3)

44

Hình 4.2.4. Phổ HSQS của hợp chất 2 (TGGT3)

45

Hình 4.2.5. Cấu trúc hóa học của 2 (TGGT3)

45

Hình 4.2.6. Phổ HSQS của hợp chất 2 (TGGT3)

47

Hình 4.2.7. Các tương tác HMBC chủ yếu của 2 (TGGT3)

47

Hình 4.2.8. Phổ khối lượng của hợp chất 2 (TGGT3)

48

Hình 4.2.9. Phổ khối lượng của hợp chất 2 (TGGT3)

48

Bảng 4.1. Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất 1 (FM-19A2)

40

Bảng 4.2. Các dữ kiện phổ NMR của hợp chất 2 (TGGT3)

46

K33C – Khoa Hóa học

ix

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt đới gió mùa, có độ ẩm trên 80% và có
lượng mưa rất lớn. Đó chính là điều kiện rất tốt cho thực vật phát triển mạnh mẽ.
Chính vì vậy thực vật ở Việt Nam vô cùng phong phú và đa dạng với khoảng
12000 loài trong đó có khoảng 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược
[2]. Điều này thực sự có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của các ngành
như ngành y học, ngành hóa học và các ngành khác. Hệ thực vật của nước ta
phong phú như vậy cũng là tiền đề cho sự phát triển của ngành hóa học các hợp
chất thiên nhiên.
Theo các tài liệu [8] đã được công bố hiện nay có khoảng 60% đến 70%
các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử
nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên.
Với những công trình nghiên cứu và sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt
tính sinh học có giá trị từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp
rất lớn trong việc tạo ra các loại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh
hiểm nghèo như: penicillin (1941); artemisinin (những năm 1970);... để kéo dài
tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. Thiên nhiên là nguồn
nguyên liệu phong phú cung cấp các hoạt chất quý hiếm để tạo ra các biệt dược
và các chất dẫn đường để tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những chất được

phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hoạt
chất có khả năng trị bệnh rất cao.
Cây Ficus microcapa (còn gọi là cây Gừa), thuộc họ dâu tằm (Moraceae)
là một loài cây đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu trong dân gian, như
lá cây, rễ cây, nhựa cây phối hợp với nhiều vị thuốc khác có thể chữa được bệnh
sỏi thận, chữa bệnh liệt nửa người, chữa cảm cúm, chữa các vết thương do đâm
K33C – Khoa Hóa học

1

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

chém và còn có thể chữa được bệnh hắc lào, tràng hạt… Tuy nhiên cho tới nay
chưa có một nghiên cứu chính thức nào về hóa thực vật của cây.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khoá luận
tốt nghiệp là:
“ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ cây Ficus microcapa”.
Nhiệm vụ của đề tài là:
1. Thu mẫu lá cây Ficus microcapa, xử lý mẫu, tạo dịch chiết;
2. Phân lập các hợp chất flavonoit;
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lâp được.

K33C – Khoa Hóa học

2

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Ficus microcapa.
1.1.1. Mô tả.
Tên khoa học:
Ficus microcapa L.f.
Tên tiếng Việt: Gừa
Họ: Dâu tằm (Moraceae)
Cây Gừa là cây gỗ lớn, có
chiều cao từ 15 - 20m. Cây có rễ
khí sinh mọc từ cành. Cành non
có cạnh, sau hình trụ, màu xám
Hình 1.1: Lá và quả cây Gừa

tro.

Lá cây Gừa mọc so le, dày và dai; lá có chiều dài từ 6 – 18cm, chiều rộng
từ 3 – 8cm, gốc tròn hoặc thuôn, đầu nhọn, mép nguyên, mặt trên sẫm bóng,
mặt dưới nhạt, hai mặt nhẵn; lá non có lông trắng mềm; lá kèm nhỏ.
Cụm hoa có dạng quả sung, mọc ở kẽ lá, gần như không cuống, chứa hoa
đực và hoa cái.
Quả màu vàng, có vân đỏ.
1.1.2. Phân bố, sinh thái. [2]

Cây Gừa được phân bố ở nhiều nơi, từ Ấn Độ, Srilanca, Nam Trung Quốc
đến Đông Dương, các nước Đông Nam Á, đảo Solomon, Caroline, Tân
Caledonia và Australia…

K33C – Khoa Hóa học

3

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

Ở nước ta, cây Gừa thường được thấy trong các quần hệ rừng núi đá, rừng
thứ sinh, nhất là ở vùng ven biển và đảo. Cây cũng được trồng xung quanh làng
bản, nơi công cộng để lấy bóng mát.
Gừa ra hoa quả nhiều hàng năm. Quả chín là thức ăn ưa thích của nhiều
loại chim rừng. Do đó, hạt được phát tán dễ dàng đi khắp nơi. Hạt rơi vào các kẽ
đá, hốc cây đều có khả năng nảy mầm. Gừa là cây có thể sống hàng trăm năm.
Bộ phận được sử dụng: Rễ cây và lá cây.
Tính vị và tác dụng: Rễ Gừa có vị đắng, chát, tính bình, mát, có tác dụng
khư phong, thanh nhiệt, hoạt huyết giải độc; Lá Gừa có vị đắng, chát, tính mát,
có tác dụng hoạt huyết, tán ứ, giải nhiệt, lý thấp.
1.1.3. Thành phần hóa học.
Theo tác giả Kuo Yueh – Hsiung và cs, 1997, từ vỏ cây gừa đã phân lập
được 14 chất triterpenoid, một alcol béo, 8 chất steroid, 1 chất coumarin, 1 chất
flavan, 2 chất 4-hydroxybenzoat và 1 chất tương tự carotenoid [2].
Theo tác giả Li Yen Cheng và cs, 1997, từ vỏ cây gừa đã phân lập được

ficuisoflavon và isolupinisoflavon E [2].
Theo tác giả Higa Matsutake và cs, 1996 từ quả cây gừa đã phân lập được
β – amyrin acetat, β – amyrin, acid maslinic, acid 2α – hydroxyursolic, acid
oleanolic, β – sitosterol vµ acid protocatechuic[2] .
Theo tác giả Yi-Ming Chiang, Jang-Yang Chang, Kuo Ching-Chuan,
Chang Chi-Yen, Yueh-Hsiung Kuo (Phytochemistry, tập 66, trang 495-501) từ rễ
trời của cây gừa đã phân lập được các chất sáu triterpenes, 3β-acetoxy-12 ,19dioxo-13 (18)-oleanene (1), 3β-acetoxy-19 (29)-taraxasten-20α-ol (2), 3βacetoxy-21α, 22α-epoxytaraxastan -20α-ol (3), 3,22-dioxo-20-taraxastene (4),

K33C – Khoa Hóa học

4

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

3β-acetoxy-11α,

Nguyễn Xuân Bách

12α-epoxy-16-oxo-14-taraxerene

(5),

3β-acetoxy-25-

methoxylanosta- 8,23-diene (6) cùng với chín triterpenes biết, 3β-acetoxy-11α,
12α-epoxy-14-taraxerene (7), 3β-acetoxy-25-hydroxylanosta-8 ,23-diene (8),
oleanonic acid (9), acetylbetulinic acid (10), betulonic acid (11), acetylursolic

acid (12), ursonic acid (13), acid ursolic (14), và acid 3-oxofriedelan-28-OIC
(15) và có chứa hoạt tính độc tế bào hiệu quả với 3 dòng tế bào ung thư của con
người cụ thể là, ung thư vòm họng, các tế ung thư biểu mô và HT29 đại trực
tràng [12].
Theo tác giả Yen-cheng Lia and Yueh-Hsiung Kuoa, từ dịch chiết
methanol của gỗ cây gừa đã phân lập được ba hợp chất mới, (Z) -1,6,6-trimethyl7-oxabicyclo [2,2,1] hexa-2 (9)-en-10-OIC axit, methyl (S) -2 - (4-hydroxy-3methoxyphenyl)-3-hydroxypropanoate và 1 β -(3-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl)
-O glucopyranoside .
1.1.4. Công dụng.
Theo kinh nghiệm của một số người bốc thuốc chữa bệnh ở tỉnh Minh Hải,
rễ Gừa phối hợp với nhiều vị thuốc khác để chữa bệnh sỏi thận.
Ngoài ra rễ Gừa và các vị thuốc khác còn được người dân chữa bệnh liệt
nửa người (bán thân bất toại).
Ở Trung Quốc, rễ Gừa được dùng chữa cảm cúm, ho gà, sởi mọc không
đề, viêm kết mạc, đau phong thấp, chảy máu cam, đái ra máu (huyết lâm).
Lá Gừa chữa vết thương do đâm chém, cảm cúm, viêm amiđan, viêm phế
quản mạn tính, kiết lỵ, viêm ruột.

K33C – Khoa Hóa học

5

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

Nhựa mủ từ cây Gừa pha với giấm bôi ngoài chữa được bệnh hắc lào và
tràng nhạc.[2]

1.2. Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong cây Gừa.
1.2.1. Giới thiệu chung. [1, 3, 6, 7, 11]
Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật.
Chúng là hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với nhau
bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon C6-C3-C6.
Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các
glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin màu
đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin là
các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào).
Các flavonoit là các dẫn xuất của 2–phenyl chromen (flavan).
2'

A

1'

8
9

7

O

B

3'
4'

2
5'

6'

3

6

10
5

4

C

Hình 1.2: Flavan (2-phenyl chromen)

1.2.2. Các nhóm flavonoit. [1, 3, 6, 7, 11]
1.2.2.1. Flavon và flavonol: Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên.
Công thức cấu tạo của chúng chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3.

K33C – Khoa Hóa học

6

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

O

O
OH

RO

OH

RO

OH
O

O

Hình 1.3: Flavon

Hình 1.4: Flavonol

1.2.2.2. Flavanon: Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến các Chalcon do
vòng dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành
chalcon.
OR

O
RO

O

Hình 1.5: Flavanon
1.2.2.3. Flavanonol-3: Có 2 nguyên tử cacbon bất đối là C-2 và C-3 nên chúng
có tính quang hoạt. Các hợp chất thường gặp là aromadendrin, fustin và
taxifolin.
OR
O
RO
OH
O

Hình 1.6: Flavanonol-3
1.2.2.4. Chalcon: Chalcon có thể bị đồng phân hoá thành flavonon khi đun nóng
với axit clohydric (HCl).

K33C – Khoa Hóa học

7

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách
OR
OH
RO

O

Hình 1.7: Chalcon
1.2.2.5. Auron: Có màu đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng shinoda.
O

A

RO

OR

C

B

CH

O

Hình 1.8: Auron
1.2.2.6. Antoxianidin: Thường gặp trong tự nhiên ở dạng glycozit dễ tan trong
nước. Màu sắc của nó thay đổi theo pH.
OR

O
RO

OH

Hình 1.9: Antoxianidin

1.2.2.7. Leucoantoxianidin: Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng agycon,
chưa tìm thấy ở dạng glycozit.
O

OH
O

Hình 1.10: Leucoantoxianidin
K33C – Khoa Hóa học

8

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

1.2.2.8. Catechin: Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol. Do có 2 trung tâm
cacbon bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng 2 cặp đồng phân đối quang.
OH

O
HO

OH

OH
OH

Hình 1.11: (+) Catechin
OH

O
HO

OH

OH
OH

Hình 1.12: (–) Catechin

1.2.2.9. Isoflavonoit: bao gồm các dẫn xuất của 3-phenyl chroman.
O

O

O

Hình 1.13: 3-phenyl chromen

K33C – Khoa Hóa học

Hình 1.14: 3-phenylchromen-4-one

9

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

1.2.2.10. Rotenoit và neoflavonoit: Các rotenoit có quan hệ chặt chẽ với các
isoflavon về mặt cấu trúc cũng như sinh tổng hợp.

H
O

O
O

H
O
OMe
MeO

Hình 1.15: Rotenoit
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật.
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết.
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ

cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất
nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước
khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả
và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi
như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất
K33C – Khoa Hóa học

10

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản
như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol

và

chloroform

thường

chứa

dioctylphtalat

[di-(2-

etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả
phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen
clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết
sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
Những tạp chất của chloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác.
Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây
ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác.
Chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này
cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm
tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được
lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà
tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung
bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng
thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá
trình chiết sơ bộ.

K33C – Khoa Hóa học

11

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết [5]. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được
chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ
nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất không có
khả năng tạo cholesterol như các carotenoit. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo
thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết
dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc
trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể tạo thành những
sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong
cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá
trình chiết tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất
mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 30 - 400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn.
1.3.2. Quá trình chiết.
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm.

K33C – Khoa Hóa học

12

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian.
Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh
tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng
hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm
đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24
giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực
hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị
nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này
bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Đragendroff và tác nhân Mayer.

- Các flavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết chảy
ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự
xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có
thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin
axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết được
khi nào quá trình chiết kết thúc.

K33C – Khoa Hóa học

13

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất
mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ. [8,10]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất
hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký.
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất

hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của
chúng (tính bị hấp phụ, tính tan...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau
với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc
ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ
và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động
chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này.
Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai
pha tĩnh và pha động. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:

K33C – Khoa Hóa học

14

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

n

Nguyễn Xuân Bách

n .b.C

1  b.C

n - lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n∞ - lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b - hằng số.
C - nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái
khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào
trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký
khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các
phương pháp sắc ký chủ yếu sau:

1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,
ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc
kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan
trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt
của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao
và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ
chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì
gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử
dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
K33C – Khoa Hóa học

15

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Xuân Bách

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu
tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf,
với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta
có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất
quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 –
1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc
vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm
chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa
trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng
tối thiểu.

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp
phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi
cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi
chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ
lượng cần thiết.

K33C – Khoa Hóa học

16

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2