Nghiên cứu thành phần glucolipit từ cây gừa (ficus microcapa)

Trờng đại học s phạm hà nội 2

Khoa hoá học
**********

trần thị hồng

Nghiên cứu thành phần
glucolipit từ cây gừa
(Ficus microcapa)

Khoá luận tốt nghiệp
Chuyên ngành: Hoá Hữu Cơ

Hà Nội - 2011


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

LờI CảM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này đợc hoàn thành tại phòng nghiên cứu cấu trúc
Viện hóa sinh biển Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
Em xin đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo
PGS.TS.Phan Văn Kiệm Viện hóa sinh biển, Viện khoa học và công nghệ
Việt Nam đã tận tình hớng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo Viện hóa sinh biển đã tạo điều
kiện cho em đợc học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của Viện để hoàn
thành tốt các mục tiêu đề ra của khóa luận tốt nghiệp.

Em xin cảm ơn thầy giáo trởng khoa TS. Nguyễn Văn Bằng cùng toàn
thể các thầy cô giáo trong khoa Hóa họcTrờng Đại học s phạm Hà Nội II đã
tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Trần Thị Hồng

Trần Thị Hồng

ii

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi. Các số liệu và kết quả đợc
nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và cha đợc ai công bố trong bất kì
công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Trần Thị Hồng

Trần Thị Hồng

iii

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

mục lục
lời cảm ơn
lời cam đoan
mục lục
danh mục hình vẽ
danh mục sơ đồ và bảng
danh mục chữ viết tắt
mở đầu ....................................................................................................... 1
chơng 1: tổng quan ............................................................................. 3
1.1. Tổng quan về cây Gừa
1.1.1. Thực vật học ......................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố và sinh thái ................................................................... 4
1.1.3. Công dụng .................................................................................. 5
1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................... 5
1.2. Các phơng pháp chiết mẫu thực vật.......................................................... 6
1.2.1. Chon dung môi chiết................................................................... 6
1.2.2. Qúa trình chiết ........................................................................... 8
1.3. Các phơng pháp sắc ký trong phân lập các chất hữu cơ ............................ 9
1.3.1. Đặc điểm chung của phơng pháp sắc ký ..................................... 9
1.3.2. Cơ sở của phơng pháp sắc ký.................................................... 10
1.3.3. Phân loại các phơng pháp sắc ký.............................................. 10
1.4. Một số phơng pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ.... 12
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) ............................. 13

1.4.2. Phổ khối lợng (Mass Spectroscopy, MS) ................................... 13
1.4.3. Phổ cộng hởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR)........................................................................... 14
CHƯƠNG 2: Đối TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU................ 17
Trần Thị Hồng

iv

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

2.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 17
2.2. Phơng pháp phân lập các hợp chất.............................................. 17
2.2.1. Sắc ký kớp mỏng (TLC)............................................................. 17
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế .......................................................... 18
2.2.3. Sắc ký cột (CC)........................................................................... 8
2.3. Phơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất............................... 18
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ............................................................... 18
2.3.2. Phổ khố lợng (ESI-MS) ............................................................. 18
2.3.3. Phổ cộng hởng từ hạt nhân (NMR) ........................................... 18
2.3.4. Độ quay cực []D..................................................................... 19
2.4. Dụng cụ và thiết bị................................................................................. 19
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết ................................................... 19
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc ....................................... 19
2.5. Hóa chất ................................................................................................ 20
chơng 3: thực nghiệm và kết quả............................................... 21

3.1. Thu mẫu thực vật và xử lýmẫu ............................................................... 21
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các chất...................................... 22
3.2.1. Hợp chất FD17A1 (1-O--D-glucopyranosyl- (2S,3R,4E,8Z)-2[(2-hydroxylhexadecanoyl)amido]-4,8-octađecaien-1,3-diol) ........... 22
3.2.2.Hợp chất CL1R4 (1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O--Dgalactopyranosylglycerol) ................................................................. 23
CHƯƠNG 4: KếT QUả Và THảO LUậN ................................................. 25
4.1. Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 1: 1-O--D-glucopyranosyl(2S,3R,4E,8Z)-2-[(2-hydroxylhexadecanoyl)amido]-4,8-octađecaien-1,3-diol)
(kí hiệu FD17A1). ........................................................................................ 25
4.2.

Hợp

chất

2

(1,2-Di-O-(9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O--D-

galactopyranosylglycerol) (Kí hiệu CL1R4) ................................................. 29

Trần Thị Hồng

v

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Kết luận .................................................................................................. 37
tài liệu tham khảo ............................................................................ 38

Trần Thị Hồng

vi

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục hình vẽ và bảng biểu
Hình 1.1.1

Lá và quả Gừa

3

Hình 2.1.1

Hình ảnh cây Gừa

17

Hình 2.1.2

Hình ảnh mẫu tiêu bản

17

Hình 4.1.1

Phổ 1H-NMR của hợp chất 1

25

Hình 4.1.2

Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

26

Hình 4.1.3

Cấu trúc của hợp chất 1 và tơng tác HMBC

27

Hình 4.2.1

Phổ 1H-NMR của hợp chất 2

30

Hình 4.2.2

Phổ 13C-NMR của hợp chất 2

31

Hình 4.2.3

Cấu trúc hóa học của hợp chất 2

32

Hình 4.2.4

Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 2

32

Hình 4.2.5

Phổ HSQC của hợp chất 2

33

Hình 4.2.6

Phổ HMBC của hợp chất 2

33

Hình 4.2.7

Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất 2

34

Hình 4.2.8

Phổ HMBC dãn rộng của hợp chất 2

34

Trần Thị Hồng

vii

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục sơ đồ và bảng

Sơ đồ 3.1

Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết metanol của cây

21

Gừa
Sơ đồ 3.2

Sơ đồ phân lập hợp chất FD17A1 và CL1R4 từ cây

22

Gừa
Bảng 4.1

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1

28

Bảng 4.2

Kết quả phổ NMR của hợp chất 2

35

Trần Thị Hồng

viii

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục chữ viết tắt

13

C NMR

Phổ cộng hởng từ hạt nhân cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H NMR

Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H-1H COSY

1

H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR

Phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR

CC

Sắc kí cột (Column Chromatography)

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS

Phổ khối lợng va chạm electron
(Electron Impact Mass Spectrometry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy).

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lợng (Mass Spectroscopy).

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Trần Thị Hồng

ix

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mở đầu
Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa có khí hậu nóng
ẩm, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình từ 15-27oC là điều kiện thuận lợi cho
các loài thực vật phát triển. Phát huy thế mạnh đó, các nhà khoa học đã khai
thác kho tài nguyên thiên nhiên vô giá với nguồn dược liệu phong phú bao
gồm nhiều loại cây có thể dùng làm thuốc chữa bệnh, làm hương liệu
Từ xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng những bài thuốc dân gian để chữa
bệnh từ cây cỏ như: lá tía tô để giải cảm, hương nhu, xả để tạo mùi
thơmCác phương thuốc y học cổ truyền có nhiều ưu điểm như: ít độc tính, ít
tác đụng phụ, dễ tìm kiếm nguyên liệu. Do có nhiều ưu điểm như vậy nên
ngày nay con người ngày càng quan tâm đến các hợp chất thiên nhiên có hoạt
tính cao trong thực vật và động vật. Rất nhiều cây thuốc đã được khoa học y
dược chứng minh về tác dụng điều trị bệnh của chúng, nhiều loại thuốc được
chiết xuất từ dược liệu như: Berberin, Penicillin (1941)Do vậy, đối với sự

phát triển của các dược phẩm mới thì các hợp chất có hoạt tính sinh học đóng
vai trò vô cùng quan trọng vì nó là khởi đầu cho việc tổng hợp nên các loại
thuốc mới có tác dụng tốt hơn.
Xuất phát từ thực tiễn đó tôi đã chọn đề tài cho khóa luận là: Nghiên
cứu thành phần glucolipit từ cây Gừa .
Cây Gừa (Ficus microcapa), thuộc họ dâu tằm moraceae là 1 loại cây đã
được sử dụng từ lâu trong dân gian làm thuốc chữa bệnh như: rễ gừa phối hợp
với nhiều vị thuốc khác để chữa bệnh sỏi thận, lá gừa chữa vết thương do đâm,
chém, cảm cúm, viêm amidan

Trần Thị Hồng

1

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Nhiệm vụ của đề tài:
1. Thu mẫu lá cây gừa (Ficus microcapa), xử lí mẫu và tạo dịch chiết
metanol.
2. Tách chiết các hợp chất glucolipit.
3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất đã tách, chiết được.

Trần Thị Hồng

2

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chương 1: Tổng Quan
1.1. Tổng quan về cây Gừa
1.1.1. Thực vật học
Tên khoa học: Ficus microcapa.
Tên tiếng việt : Gừa
Họ: Dâu tằm - Moraceae
Cây gỗ to, cao 15 20m, có rễ khí sinh mọc từ cành. cành non có cạnh,
sau hình trụ, màu xám tro. lá mọc so le, dày và dai, dài 6 18cm, rông 3 8
cm, gốc tròn hoặc thuôn, đầu nhọn, mép nguyên, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới
nhạt, 2 mặt nhẵn, lá non có lông trắng mềm, lá kèm nhỏ.
Cụm hoa có dạng quả sung, mọc ở kẽ lá, gần như không cuống chứa
hoa đực và hoa cái.
Quả màu vàng, có vân đỏ, mùa hoa quả tháng 5 7.

Hình 1.1.1: Lá và quả cây Gừa.

Trần Thị Hồng

3

K33C - Khoa Hóa học

Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.1.2. Phân bố, sinh thái.
Ficus L. là 1 chi lớn gồm rất nhiều loài. hiện nay ước tính trên thế giới
có khoảng 1000 loài, phân bố rộng rãi ở tất cả các vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới của 2 bán cầu, phân bố nhiều nhất ở Malaysia (có mặt 50% tổng số loài).
Việt Nam, chi Ficus L. được ước tính có tới 120 loài (Nguyễn Tiến
Bân,1997) và được phân bố rộng rãi. Gừa thuộc nhóm cây gỗ lớn, phân bố rải
rác ở khắp các tỉnh miền nuí, trung du, đồng bằng và các đảo. trên thế giới
loài cây này cũng gặp ở nhiều nơi từ Ân Độ, Srilanka, Nam Trung Quốc đến
Đông Dương, các nước Đông Nam á, đảo Solomon, Caroline,Australia
Việt Nam Gừa thường thấy trong các quần hệ rừng núi đá, rừng thứ sinh
nhất là ở vùng ven biển và đảo. Cây cũng được trồng xung quanh làng bản, nơi
công cộng để lấy bóng mát. Khi còn nhỏ cây có thể ở dạng sống phụ sinh
(trên đá hay cây gỗ khác). Sau lớn dần bóp nghẹt cây giá để trở thành cây gỗ
lớn với nhiều rễ khí sinh buông xuống từ cành. Gừa ra hoa quả nhiều hàng
năm. quả chín là thức ăn ưa thích của nhiều loài chim rừng. Do đó hạt được
phát tán dễ dàng đi khắp nơi. Hạt rơi vào các kẽ đá, hốc cây đều có khả năng
nảy mầm. tuổi thọ của Gừa có thể hàng trăm năm, gỗ nhẹ và mềm nên ít được
sử dụng.
Bộ phận được sử dụng: rễ và lá, thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi
khô.
Tính vị, công năng:
- Rễ Gừa có vị đắng, chát, tính bình, mát, có tác dụng khử phong, thanh
nhiệt, hoạt huyết, giải độc.
-Lá Gừa có vị đắng, chát, tính mát, có tác dụng hoạt huyết, tán ứ, giải
nhiệt, lý thấp.

Trần Thị Hồng

4

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.1.3. Công dụng
Theo kinh nghiệm nhân dân, 1 số người bốc thuốc chữa bệnh ở tỉnh
Minh Hải đã dùng rễ Gừa phối hợp với nhiều vị thuốc để chữa bệnh sỏi thận.
Cách bào chế như sau: rễ Gừa 30g, rễ nhàu 20g, thân cây muồng trâu
20g, cây thài lài trắng 10g, vỏ thân cây chân chim 10g, lõi cỏ bấc 4g. Tất cả
thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400ml nước, còn 100ml nước. Uống làm 2 lần
trong ngày. Mỗi đợt điều trị kéo dài 5-7 ngày.
Dùng chữa bệnh liệt nửa người từ rễ Gừa như sau: rễ gừa 30g, rễ nhàu
non hoặc vỏ, thân cây nhàu già 20g, cây trinh nữ 20g.
Trung Quốc, rễ Gừa được dùng chữa cảm cúm, ho gà, sởi mọc không
đều, viêm kết mạc, đau mắt hột, đau phong thấp, chảy máu cam, đi tiểu ra
máu. Để chữa đau răng lấy tua rễ Gừa, bồ kết với lượng bằng nhau, sắc với
nước, ngậm không được uống.
Lá Gừa chữa vết thương do đâm, chém, cảm cúm, viêm amidan, viêm
phế quản mãn tính, kiết lị, viêm ruột.
Nhựa, mủ từ cây Gừa pha với giấm bôi ngoài để chữa hắc lào, tràng
nhạc.
1.1.4. Thành phần hoá học

Vỏ cây Gừa chứa 14 chất tritecpenoid, 1 ancol béo, 8 chất steroit, 1 chất
coumarin, 1 chất flavan, 2 chất 4-hydroxybenzoat và 1 chất tương tự
carotenoid (Kuo Yueh Hsiung và cs, 1997; CA. 127,231875w).
Vỏ chứa ficuisoflavon và iso lupinisoflavon E. (Theo Li Yen Cheng và
cs, 1997) (CA. 126, 142027a).

Trần Thị Hồng

5

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Quả chứa amyrin acetat, amyrin, acid maslinic, acid 2
hydroxyursolic, acid oleanolic, sitosterol và acid protocatechuic (Higa
Mastutake và cs, 1996; CA. 126, 318827p).
1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung
bình, chất phân cực) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau
1.2.1. Chọn dung môi chiết
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung

môi dùng trong quá trình chiết ít khi được quan tâm và cần phải được lựa chọn
rất cẩn thận.
Dung môi nếu lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này cần được chưng
cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Có một số chất dẻo thường lẫn
trong dung môi như: diankyl phtalat, tri-n-butyl photsphat và tri-n-butyl
axetylcitrar. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất
hoặc trong khâu bảo quản như trong các nút đậy bằng nhựa hoặc trong các
thùng chứa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)
phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlorofrom, metyl

Trần Thị Hồng

6

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình
chiết sơ bộ một phần của cây như: Rễ, thân, lá, hoa, củ, quả
Những tạp chất của chlorofrom như CH2ClBr, CH2Cl2 có thể phản ứng
với vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác.
Tương tự như vậy, sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có

thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất
khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với
chất này cần thao tác cẩn thận và khéo léo ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt
nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho rằng sẽ thấm
tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được
lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm được tạo thành khi dùng methanol
trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechonaetes
aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ
1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được
chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, dễ bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
Trần Thị Hồng

7

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất
không có khả năng tạo cholesterol như các calotenoid. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong
cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá
trình chiết tránh được sự phân huỷ của chất bởi dung môi và quá trình tạo
thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn.
1.2.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi
nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời
gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả cao hơn. Trước đây, máy
chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình
thuỷ tinh.
Trần Thị Hồng

8

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ
thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những
chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách
khác nhau.
Ví dụ: Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp
chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Dragendroff và Maye.
1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ.
Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký.
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha
tĩnh.
Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác

nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc
theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
tình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ
chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn
với pha này, nhờ đặc điểm này người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc
ký.

Trần Thị Hồng

9

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký.
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha tĩnh và pha động. ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc
với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng
nhiệt Langmuir:

n=
Trong đó:

n.b.C
1+b.C

n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n: lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất
hấp phụ nào đó.
b: hằng số.
C: nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký.
Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thế (các chất ở trạng
thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm
lớn: sắc ký lỏng và sắc ký khí. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra
thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.3.3.1. Sắc ký cột (C.C).
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,
ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc
kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức
quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.
Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách
Trần Thị Hồng

10

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng
nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp, nếu lực trọng trường
không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được), khi
đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao
(HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu
tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa đường
đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, với mỗi một
chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể
tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất
quan trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ
thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm
chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa
trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng
tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất
hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột
đến khi cột trong suốt.

Trần Thị Hồng

11

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

- Cách 2: Nhồi cột ướt. Tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung
môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần lên cột đến
khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có
bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm tốc độ hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng
chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công
việc.
1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử đụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica
gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu
chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn
silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy
sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải
hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát
hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho
từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.4. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ.
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương

pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta
sử dụng phương pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối
hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định

Trần Thị Hồng

12

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các
phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương
pháp sắc ký so sánh
1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa
vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm đặc trưng trong hợp chất.
Ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là
3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1
1.4.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của
phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic
ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân
mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất

nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau,
phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là
phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp
hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và
các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá
vỡ.

Trần Thị Hồng

13

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó
phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),
cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc
ký kết hợp với phổ khối khác như: GC-MS (Sắc ký khí Phổ khối), LC-MS
(Sắc ký lỏng Phổ khối). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu
khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong

ngành dược).
1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một
chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của
hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (Phổ proton và
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác
dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng
độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra đặc trưng của phân tử còn
được xác định dựa vào sự tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
1.4.3.1. Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học
() của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào
mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa
vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có
thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
Trần Thị Hồng

14

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2
1.4.3.2. Phổ

Khoá luận tốt nghiệp

13

C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi

nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ
khác nhau. Thang đo của phổ

13

C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-

230ppm.
1.4.3.3. Phổ DEPT(Distortionless Enhancement by Polarisation
Transfer): Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.
Trên phổ DEPT tín hiệu của các cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu của CH và
CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ
DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.4.3.4. Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác
định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều.
Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương
tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ,
một trục và phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC
nằm trên đỉnh các ô vuông phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các
proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử
được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ
biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên

phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về
cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu
diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên

Trần Thị Hồng

15

K33C - Khoa Hóa học


Trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả
phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE
differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào
một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các
proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng
hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (Nhiễu xạ Rơnghen) để xác định
cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh
thể. Nhưng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu tiên quyết của phương
pháp này là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối
với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử
dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp

phân tích, so sánh kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch
nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được
chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định
chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng
phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc
GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.

Trần Thị Hồng

16

K33C - Khoa Hóa học