Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn acetobacter xylinum có khả năng tạo màng bacterial cellulose có đặc tính dai mỏng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

--------***--------

NGUYỄN THỊ LAN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI
KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CÓ
KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL
CELLULOSE CÓ ĐẶC TÍNH DAI MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Hà Nội – 2011


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

MỤC LỤC
Trang

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

1

2. Mục tiêu của đề tài

2

3. Nội dung nghiên cứu

2

4. Ý nghĩa của đề tài

2

PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
trong sinh giới:

3

1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum

3

1.1.2. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum

3

1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose

7

1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose

7

1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose

8

1.3. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới

9

và ở Việt Nam
1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới.

9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam

11

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị

12

2.1.1. Vi sinh vật

12

2.1.2. Thiết bị và hoá chất

12

2.1.3. Môi trường

13

2.2. Phương pháp nghiên cứu

13

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

ii

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter

13

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi
cấy của các chủng A.xylinum

14

2.2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên
kính hiển vi

14

2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1]

14

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh
hoá của các chủng Acetobacter xylinum

15

2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11]

15

2.2.3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hoá
rượu ethanol thành acid acetic [11]

15

2.2.3.3. Xác định khả năng oxy hoá acid acetic [11].

15

2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose

16

2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng khô của màng BC

19

2.2.5. Phương pháp xác định khả năng thấm hút nước
của màng BC (g/100cm2)

16

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng Acetobacter xylinum

17

3.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu

18

3.1.2. Phân lập vi khuẩn Acetobacter

19

3.1.3. Tuyển chọn các chủng A.xylinum tạo màng
Bacterial Celullose (màng BC)

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

21

iii

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

3. 2. Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo
màng BC dai, mỏng

24

3.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng
Acetobacter xylinum đã tuyển chọn

27

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào học của các
chủng Acetobacter xylinum

27

3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy của các chủng Acetobacter xylinum

28

3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng
Acetobacter xylinum

29

3.3.3.1. Khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng
Acetobacter xylinum

29

3.3.3.2. Khả năng đồng hoá nguồn nitơ của các chủng
Acetobacter xylinum

30

3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng
của 2 chủng R1 và B4

31

PHẦN KẾT LUẬN

33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

34

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

iv

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

DANH MỤC HÌNH BẢNG BIỂU
Trang

HÌNH
Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn A.xylinum

4

Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose của thực vật

7

Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum

9

Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum

17

Hình 3.2. Một số mẫu màng thu được sau khi làm giàu nguyên liệu

19

Hình 3.3. Chuyển hóa ethanol thành acid acetic của vi khuẩn

20

Hình 3.5. Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trên
bề mặt môi trường dịch thể

23

Hình 3.6. Khả năng tạo màng cellulose của các chủng A.xylinum

23

Hình 3.7. Các loại màng bacterial cellulose (BC)

26

Hình 3.8. Hình dạng tế bào của hai chủng vi khuẩn A.xylinum

27

Hình 3.9. Khuẩn lạc A.xylinum

28

BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum

5

Bảng 1.2. Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter

6

( so sánh với Pseudomonas )
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng BC

25

Bảng 3.2. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter xylinum

28

Bảng 3.3. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng R1 và B4

30

Bảng 3.4. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của 2 chủng R1 và B4

31

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng
của chủng R1 và B4

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

32

v

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ đầy đủ

A. xylinum

Acetobacter xylinum

BC

Bacterial cellulose

R1

Acetobacter xylinum R1

B4

Acetobacter xylinum B4

BHN2

Acetobacter xylinum BHN2

cs

Cộng sự

Cty

Công ty

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

vi

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hàng ngày.
Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn để lại di chứng đến khả năng
vận động, thẩm mĩ và sức khỏe của người bệnh. Ở Việt Nam, riêng viện bỏng
quốc gia Hà Nội mỗi năm tiếp nhận khoảng 3000 bệnh nhân bỏng do đủ các

nguyên nhân và mức độ khác nhau. Hơn nửa số bệnh nhân bỏng là trẻ em và
¼ số bệnh nhân nhập viện bị bỏng sâu. TS. Nguyễn Viết Lượng trưởng phòng
hành chính tổng hợp đồng thời là người điều hành các đề tài nghiên cứu của
Viện Bỏng Quốc gia cho biết: “Trước đây những ca bỏng sâu rất dễ tử vong
do hồi đó thiếu những loại thuốc đặc hiệu. Thuốc nhập khẩu rất hiếm và đắt”.
Nếu bệnh nhân bị bỏng nhẹ, diện tích vết bỏng nhỏ các tế bào xung
quanh tự phát triển dần phủ kín vết thương. Nhưng nếu là vết bỏng sâu thì
buộc phải cấy ghép da. Song song với việc cấy ghép da là việc tìm kiếm các
loại da tự thân, da dị loại và các loại màng sinh học thay thế da tạm thời trong
điều trị. Mặc dù da tự thân là vật liệu lí tưởng nhưng trong nhiều trường hợp
không đủ đáp ứng hoặc thể trạng bệnh nhân không cho phép lấy… Việc tìm
kiếm các loại da dị loại và màng sinh học thay thế cho da tạm thời đã trở
thành phương pháp hiệu quả hơn cả. Tuy nhiên các loại da dị loại như da ếch
tươi, đông khô; da lợn tươi, đông lạnh lại có những nhược điểm nhất định như
việc sử dụng ở thế bị động, bảo quản và xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng
rộng rãi trên lâm sàng. Chính vì vậy, vật liệu che phủ tạm thời từ các loại
màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan trọng trong điều trị
bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được quan tâm ngày nay
là màng cellulose vi khuẩn.
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc hoá học đồng nhất với cellulose thực vật
nhưng lại có một số tính chất hoá lý đặc biệt như độ bền cơ học, khả năng

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

1

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer lớn...
rất thích hợp làm màng trị bỏng. Thế giới đã có nhiều nghiên cứu về màng trị
bỏng từ cellulose vi khuẩn. Ở Việt Nam các nghiên cứu về vấn đề này còn rất
ít, mới chỉ có nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn Thanh (2008) và
nhóm tác giả Đinh Thị Kim Nhung (2009) được công bố. Các loại màng trị
bỏng của chúng ta hiện nay phần lớn là nhập ngoại với giá rất đắt đỏ.
Từ những lí do nói trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu:
“Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng

tạo màng Bacterial Cellulose ( màng BC ) có đặc tính dai, mỏng”
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum (A.xylinum) từ một
số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum đã phân lập có khả năng tạo màng
Bacterial Cellulose dai, mỏng.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng đã tuyển chọn.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.
- Tuyển chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo màng Bacterial
Cellulose (BC) dai, mỏng.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng A.xylinum.
4. Ý nghĩa của đề tài
- Đề tài nghiên cứu lựa chọn các chủng A.xylinum có khả năng tạo
màng BC dai mỏng. Có triển vọng ứng dụng trong chế tạo màng trị bỏng.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

2

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum trong sinh giới:
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Tên gọi: Acetobacter xylinum là một tên gọi chính thức theo hệ thống
danh pháp quốc tế 1990.
Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”
A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes [13].
Đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology”,
A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter aceti, thuộc chi
Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc [14].
Năm 1984 Theo Bergey [4], Acetobacter xylinum được xếp vào chi
Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là
Acetobacter và Gluconobacter.
Ngày nay, đã tồn tại nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi
khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng. Vấn đề này vẫn đang gây
nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
* Đặc điểm hình thái - tế bào học
A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn có chứa hemicellulose.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

3

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

1m

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn A.xylinum [36]
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.
* Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC [18]. Ngược lại trong
điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không
đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình
thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [13].

*Đặc điểm sinh lý – sinh hoá
+ Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 - 6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và
nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn
A.xylinum sinh trưởng và tạo màng.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

4

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điểm sinh hoá :
Năm 1950, Prateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn như: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt
tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [23]… Theo quan
điểm này, A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonas, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác
cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng1.1.Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum
STT

Đặc điểm

Hiện tượng

Kết
quả

1

Chuyển hoá môi trường chứa
Oxy hoá ethanol thành
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
acid acetic
xanh sang màu vàng

+

2

Hoạt tính catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

3

Sinh trưởng trên môi
trường Hoyer

Sinh khối không phát triển

_

4

Chuyển hoá
glycerol thành
dihydroxyaceton

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch
sau lên men

+

5

Chuyển hoá glucose
thành acid

Vòng sáng xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường chứa
CaCO3

+

6

Kiểm tra khả năng

sinh sắc tố nâu

Không hình thành sắc tố nâu

_

7

Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

5

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Theo Bergey (1984) [4], Acetobacter xylinum được xếp vào chi
Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Họ vi khuẩn này gồm 2 chi là
Acetobacter và Gluconobacter. Đặc điểm phân biệt giữa 2 chi được trình bày
trong bảng 1.2

Bảng 1.2. Các đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter
( so sánh với Pseudomonas )
Đặc điểm
1. Vị trí tiên mao
2. Phát triển ở pH =
4,5
3. Oxy hóa aceton ở
pH=4,5
4. Oxy hóa axid
acetic
5. Oxy hóa lactat
6. Glucose

Gluconobacter

Acetobacter

Pseudomonas

+

+/-

+

+

-

+

+

-

-

+

+

-

+

+

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

-

+/-

-

-

+/-

Tiên mao ở cực

Gluconat
7. Sử dụng tinh bột,
lactose
8. Sử dụng gelatin
9. Sắc tố huỳnh
quang

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

6

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

1.2. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose cấu trúc màng BC có thành phần hóa học tương tự cellulose
thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau.

Sợi cellulose của màng BC

Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC và sợi cellulose
của thực vật [35]
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng, có đường kính sợi nhỏ hơn rất nhiều so với sợi cellulose của thực vật,
đồng thời khả năng kết tinh cao (khoảng 60 %), độ polimer hóa lớn nên màng
BC có độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước lớn [18]. Đây là đặc tính
ưu việt hơn hẳn so với cellulose thực vật. Khi quan sát trên kính hiển vi điện
tử thấy đường kính của sợi cellulose vi khuẩn chỉ bằng 1/100 của sợi cellulose
thực vật.[35]
Do có những đặc điểm ưu việt như trên mà màng BC đã được ứng dụng
rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau. Một trong các lĩnh vực
đáng lưu ý đó là lĩnh vực y học. Trong lĩnh vực này, màng BC được ứng dụng
để sản xuất màng trị bỏng [22],

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

7

SV: Nguyễn Thị Lan

Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

1.2.2 Cơ chế hình thành màng bacterial cellulose
*Vị trí tổng hợp
Vị trí tổng hợp cellulose của tế bào A.xylinum nằm giữa lớp màng
lipopolysaccharide và lớp màng sinh chất. [34]. Quan sát dưới kính hiển vi
điện tử khi nhuộm âm bản và tiêu bản cho thấy: mỗi tế bào có 46 điểm tổng
hợp cellulose. Khoảng cách giữa mỗi điểm là 12 – 15nm, kích thước mỗi
điểm là 3,5 nm. Khi tế bào phân chia, các vị trí tổng hợp được phân bố đều
vào hai tế bào con [29]
*Cơ chế tổng hợp
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [11], [12].
Quá trình tổng hợp được diễn ra như sau:
Tại các điểm tổng hợp cellulose, nhờ có hệ thống các enzyme xúc tác
mà các phân tử đường được chuyển hóa thành các chuỗi  - 1,4
glucopyranose. Vi khuẩn đẩy dài các chuỗi -1,4 glucopyranose từ một đầu,
các sợi này gọi là “sợi đẩy dài” ( H1.3 – 1 – 2 – 3 ). Tại một số điểm tổng
hợp cellulose khác nhau cũng hình thành các chuỗi  - 1,4 glucopyranose.
Các chuỗi mới hình thành liên kết với nhau và với “sợi đẩy dài” tạo thành sợi
nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm ( hình 1.3 – 4). Những sợi nhỏ kết tinh
tạo sợi lớn hơn – sợi vĩ mô, tiếp tục những sợi vĩ mô lại kết hợp với nhau để
tạo thành bó và cuối cùng tạo dải – ribbon ( H 1.3 – 5, H 1.3 – 6, H 1.3 – 7)

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

8

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Hình 1.3 Sự hình thành những dải ribbon trong màng
BC của A.xylinum [22]
Kích thước của dải ribbon còn nhiều ý kiến chưa đồng nhất, nó có thể
đạt từ 3-4 x 70-80 nm [33], 3,2x133 nm (Brown và cs, 2000). Những dải
ribbon từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải ribbon khác
bằng liên kết hydro hoặc liên kết Van de Van tạo thành dạng sệt (gel) hay
một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn
sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì thế mà
màng BC được mở rộng [12], [19]
1.3. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt
Nam
1.3.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới.
Do có nhiều ứng dụng nên A.xylinum đã thu hút được rất nhiều sự quan
tâm của các nhà khoa học trên thế giới và đã có rất nhiều công trình nghiên
cứu lớn nhỏ ở khắp các quốc gia.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

9

SV: Nguyễn Thị Lan

Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Những nghiên cứu về A.xylinum trên thế giới tập trung theo hai hướng
cơ bản:
*Hướng thứ nhất: chủ yếu là phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu các đặc
tính sinh học của A.xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong
sinh giới.
Tiêu biểu là các nghiên cứu của Beijerinck [15], Prateur [23] .... trên
cơ sở nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, sinh lý-sinh hóa. Các tác
giả đã xác định nguồn gốc, đặc điểm phân loại của A.xylinum.
Theo các nghiên cứu này, A.xylinum được xếp vào những nhóm phân
loại khác nhau. Có quan điểm cho rằng: A.xylinum thuộc chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes; có những quan
điểm lại coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của Acetobacter aceti,
thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn gốc. Gần
đây nhất là quan điểm xếp A.xylinum vào chi Gluconacetobacter, họ
Acetobacteraceae. Vấn đề này còn gây nhiều tranh cãi. Vì thế mặc dù là
hướng nghiên cứu truyền thống nhưng ngày nay nó vẫn thu hút được nhiều
nhà khoa học đi theo hướng này.
*Hướng thứ hai: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm
cũng như ứng dụng của bacterial cellulose vi khuẩn A.xylinum.
Đây là hướng nghiên cứu chủ yếu nhất. Các nghiên cứu trong hướng
này khai thác những khía cạnh khác nhau của quá trình tổng hợp, đặc điểm
cũng như ứng dụng của bacterial cellulose vi khuẩn A.xylinum.
Điển hình là một số công trình nghiên cứu của một số tác giả như: M.
Schramm và cộng sự [24].[30],[31] đã nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện

nuôi cấy đến khả năng hình thành màng BC; Neelobon Suwannapinunt và
cộng sự (2007) nghiên cứu đặc tính vật lý của màng BC [28]; nghiên cứu về
gen sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum có công trình nghiên cứu của các tác

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

10

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

giả như C. Wong và cộng sự (1990) [32], Dag H. Coucheron (1991; 1993)
[20], [21].
1.3.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam
Ở Việt Nam những vấn đề nghiên cứu về A.xylinum và màng BC trong
điều trị bỏng là khá mới mẻ. Có rất ít các nghiên cứu liên quan đến A.xylinum,
sự hình thành màng và ứng dụng của màng. Các công trình mới chỉ bước đầu
nghiên cứu về quá trình tạo màng, đặc tính, cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo
màng trị bỏng : nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Văn Thanh và ThS.
Huỳnh Thị Ngọc Lan (2006) đã tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng trị
bỏng có màu trắng với độ dày 0,5mm và có kích thước khác nhau tùy theo
yêu cầu sử dụng; nhóm nghiên cứu của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung khi tiến
hành khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn Acetobacter xylinum đã phân
lập tuyển chọn được 65 chủng vi khuẩn trong đó có chủng BHN2 có triển
vọng ứng dụng tốt.
Ngoài ra còn có các nghiên cứu của các tác giả như:

Nguyễn Thúy Hương (2006) đã nghiên cứu chọn lọc dòng A.xylinum
thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với
quy mô lớn.
Nguyễn Thị Nguyệt (2008) đã nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum cho
màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da,
Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) đã nghiên cứu đặc tính sinh học và khả
năng tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn A.xylinum và đã phân lập được
14 chủng từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam.
Màng Bacterial Celullose có vai trò quan trọng trong điều trị bỏng.
Chính vì vậy việc nghiên cứu các chủng có khả năng tạo màng BC tốt nhất
đáp ứng được yêu cầu trong điều trị bỏng sẽ có ý nghĩa thực tiễn rất lớn.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

11

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật
- Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu
màng lên men giấm từ các nguồn: Bia hơi Hà Nội, dịch quả (chuối), rượu
vang, nguồn vô cơ (saccharose và ethanol).

- Chủng BHN2 do PTN Vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung
cấp.
2.1.2. Thiết bị và hoá chất
2.1.2.1. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
Nồi hấp Tommy (nhật)
Box vô trùng (Haraeus)
Máy lắc TEIO TECH (Hàn Quốc)
Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
Kính hiển vi quang học LABOMED ( Mỹ)
Tủ lạnh Electrolux,
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn...và
nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.1.2.2. Hoá chất
- Glucose (Cty dược trung ương MEDPLANTEX Hà Nội – Hải
Phòng), Saccharose.
- Agar ( Cty TNHH Hải Long – Hải Phòng)
- Rượu ethanol, acid acetic ( Cty hóa chất Đức Giang - Hà Nội)

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

12

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

- Dihyroxyaceton, Blue Bromophenol 0.04% (xuất xứ: Trung Quốc)
-,Pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2, H2SO4 (xuất xứ: Trung Quốc)
- KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH (xuất xứ: Trung Quốc)
- Lugol, Fucshin, Tím Gentian, Phenolphtalein (xuất xứ: Trung Quốc)
2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4 : 3g

Pepton: 5g

Thạch agar: 20g

MgSO4.7H2O: 2g

KH2PO4:

2g

Nước máy : 1000ml

2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3g
KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2g

pH: 5,0 – 6,0

Acid acetic : 2%

Nước dừa: 1000 ml
2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3)
Glucose: 20 g
(NH4)2SO4: 3g
KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2g

pH: 5,0 – 6,0

Acid acetic : 2%

Nước dừa: 1000 ml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Acetobacter
Phân lập vi khuẩn theo phương pháp của Winogradski và Beijerinck
[11] – Phân lập sau khi đã làm giàu.
Nguồn vật liệu: Mẫu màng lên men giấm tự nhiên từ các nguồn bia hơi
Hà Nội, rượu vang, dịch quả (chuối), nguồn vô cơ (saccharose và ethanol).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

13

SV: Nguyễn Thị Lan

Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Tiến hành phân lập: Vớt mẫu màng đã được rửa qua cho vào ống
nghiệm chứa nước cất thanh trùng. Lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút
thu được huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác
nhau từ 10-1 đến 10-12. Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3 đến
10-12 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp Petri, dùng que chang
chang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 5-7 ngày. Dựa vào
sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc
trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch
nghiêng bảo quản trong tủ 40C. Để tiện cho việc tuyển chọn, chúng tôi tạm
gọi mỗi khuẩn lạc được tách ở trên là một chủng vi khuẩn acetic.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái – nuôi cấy của các
chủng A.xylinum
2.2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi
Làm tiêu bản các chủng vi khuẩn theo phương pháp nhuộm Gram. Sau
đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH-2
với độ phóng đại 1000 lần.
2.2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [1]
Cấy các chủng vi khuẩn nghiên cứu lên các hộp petri có chứa môi
trường đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C. Sau 7 ngày quan sát
khuẩn lạc của các chủng. Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận các đặc điểm
sau đây:
- Hình dạng khuẩn lạc: Tròn, dạng amip, dạng rễ cây, dạng không đều...
- Đặc tính quang học: Trong, bán trong, không trong, lóng lánh, đục, huỳnh
quang.
- Màu sắc: Ghi màu sắc khuẩn lạc và xem có tiết sắc tố vào môi trường hay
không

- Bề mặt: Bóng, xù xì, gấp nếp, gồ ghề.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

14

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

- Cấu trúc khuẩn lạc: Đồng nhất, dạng hạt nhỏ, dạng hạt lớn...
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng
Acetobacter xylinum
2.2.3.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase [11]
Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi
bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +).
Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -).
2.2.3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hoá rượu ethanol thành
acid acetic [11]
Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm:
Cao nấm men: 10g

Rượu ethanol : 10%-15% (vol/vol)

Nước máy: 1000ml

pH : 6,8-7.0

Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml
Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 1210C
trong 20 phút, để nguội khoảng 30oC cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá,
nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp. Quan sát thấy môi trường chuyển sang
màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính.
2.2.3.3. Xác định khả năng oxy hoá acid acetic [11].
Sử dụng môi trường sau để khử khả năng oxy hoá acid acetic của vi
khuẩn tuyển chọn.
Thành phần: Cao nấm men: 10g
Thạch: 20g
pH :

Calcium acetate: 10g
Nước máy: 1000ml

7,0-7,2

Phân phối môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121oC trong
20 phút, để nguội khoảng 40-45oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới
hoạt hoá (18-24h) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng:

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

15

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetate
bị oxy hoá, canxi giải phóng ra tạo màu trắng sữa), nếu không là âm tính.
2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong
vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt mầu của
màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch Lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá
thành màu xanh lam.
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng khô của màng BC
Mẫu màng cần xác định trọng lượng được lọc lên giấy lọc. Giấy đã được sấy ở
1050C trong 2 giờ đến khi trọng lượng không đổi và xác định trọng lượng trước khi
lọc. Giấy lọc cùng với mẫu được đặt trong đĩa petri, làm khô trong tủ sấy cũng trong
1050C. Sau 2 giờ để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân lại. Trọng lượng khô của
màng là hiệu số của trọng lượng giấy lọc có và không có mẫu màng.
2.2.5. Phương pháp xác định khả năng thấm hút nước của màng BC
(g/100cm3)
- Đặt mẫu màng nghiên cứu vào hộp Petri sấy ở nhiệt độ 400C trong 24 giờ
[11]. Cân khối lượng màng.
- Thả mẫu màng ngập trong nước. Sau 12 giờ thu màng, cân khối lượng
màng.
- Lượng nước hút được là hiệu số của khối lượng màng sau 12 giờ và khối
lượng màng ban đầu.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

16

SV: Nguyễn Thị Lan

Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. 1. Phân lập chủng Acetobacter xylinum
Nguyên liệu được sử dụng để phân lập vi khuẩn A.xylinum gồm 4 nguồn
được chia làm 2 nhóm:
- Nhóm có nồng độ rượu cao: Rượu vang, bia Hà Nội.
- Nhóm có nồng độ đường cao: chuối, nguồn vô cơ (saccharose và
ethanol)
Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum
1.Làm giầu mẫu nguyên liệu
2.Phân lập, thu các chủng vi khuẩn từ mẫu màng
3.Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid
4.Tuyển chọn các chủng có khả năng oxy hóa ethanol thành acid

5.Tuyển chọn các chủng có khả năng oxy hóa acetate

6.Tuyển chọn các chủng có khả năng tạo màng trên bề mặt môi trường

7.Kiểm tra bản chất cellulose của màng
Hình 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn A.xylinum

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

17

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Khâu 1 trong qui trình, làm giầu mẫu nguyên liệu là để cho các vi
khuẩn trong không khí có điều kiện phát triển, sinh sản, tăng số lượng trên
môi trường chứa nguyên liệu ta đã chuẩn bị để thu được nhiều tế bào vi khuẩn
dùng cho các khâu phân lập, tuyển chọn tiếp theo. Mục tiêu của các khâu 2, 3,
4, 5 là phân lập, thu các chủng thuộc chi Acetobacter, loại bỏ các chủng thuộc
chi Gluconobacter và khâu 6,7 là tuyển chọn các chủng A.xylinum từ các
chủng thuộc chi Acetobacter. Cụ thể:
3.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu
Bước 1: Xử lý nguyên liệu
- Bia, rượu vang được pha loãng; chuối được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn
tuỳ loại.
- Nguyên liệu sau khi xử lý bổ sung nước với lượng thích hợp.
Bước 2: Lên men etylic
Lên men etylic dịch nguyên liệu nhờ nấm men có sẵn trên bề mặt nguyên
liệu. Nguyên liệu được cho vào bình đậy chặt từ 5 đến 7 ngày. Sau đó mở hé
miệng đuổi khí CO2 1lần/ngày rồi đậy chặt.
Bước 3: Lên men acetic
Sau 8 ngày bỏ nắp bình, dùng vải màn đậy kín miệng bình để ở nhiệt độ
thích hợp ở những vị trí khác nhau. Sau khoảng 5 đến 7 ngày trên bề mặt môi
trường xuất hiện một lớp màng dày, mỏng khác nhau.

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

18

SV: Nguyễn Thị Lan


Khóa luận tốt nghiệp

K33 Khoa Sinh – KTNN

Chuối

Bia Hà Nội

Hình 3. 2. Một số mẫu màng thu được sau khi làm giàu nguyên liệu

3.1.2. Phân lập vi khuẩn Acetobacter
Bước 1: Vớt mẫu màng, rửa qua bằng nước cất. Tiến hành phân lập vi
khuẩn Acetobacter trên môi trường 1 theo phương pháp của Winogradski 1,
[2].
Kết quả phân lập được 14 chủng, trong đó:
- 3 chủng từ rượu vang ký hiệu R1, R2, R3.
- 5 chủng từ bia Hà Nội ký hiệu B1, B2, B3, B4, B5
- 4 chủng từ chuối ký hiệu C1, C2, C3, C4
- 2 chủng từ nguồn vô cơ ký hiệu VC1, VC2
Nhận thấy nhóm vi khuẩn acetic có khả năng hình thành màng trên môi
trường dịch thể, do đó khi vớt mẫu màng rửa bằng nước cất vô trùng đã loại
bỏ phần lớn vi sinh vật không mong muốn 11.Mặt khác môi trường 1 dùng
để phân lập được acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát
triển của các chủng vi sinh vật khác 11.
Bước 2: Từ các chủng đã phân lập được tiếp tục sơ tuyển Acetobacter

bằng cách cấy thuần trên môi trường 2 có bổ sung thêm CaCO3 (7g/l). Các
chủng Acetobacter có khả năng sinh acid acetic, acid này phân giải CaCO3

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Thùy Vân

19

SV: Nguyễn Thị Lan