Khoá luận tốt nghiệp phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất đồi đại lải

x/uuí//ííĩ/ỉ /f)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//tiff

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

MỎ DẦU
1. L ý do chọn đ ề tài
Vi sinh vật (M icroorganism s) là tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ,
muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. v s v phân bố rộng
khắp mọi nơi trên Trái Đất, từ đáy biển sâu đến độ cao

hàng nghìn mét trong

không khí, từ trong cơ thể thực vật, động vật đến các vật liệu khô cằn như
kính, sắt... đều phát hiện thấy sự sống của v s v . Tuy nhiên đất vẫn là nơi cư
trú phổ biến nhất của các nhóm v s v kể cả thành phần và số lượng. Bởi thế
chúng đóng vai trò quan trọng, trước hết là đối với quá trình hình thành và
phát triển của đất. Chính nhờ những v s v tự dưỡng đầu tiên m à thành phần
của đá mẹ bị phân huỷ dần thành đất. Sự hoạt động tiếp theo của các nhóm
v s v khác đã hình thành và tích luỹ chất mùn làm nên độ phì nhiêu của đất.
v s v tham gia m ạnh mẽ vào quá trình chuyển hoá vật chất trong đất, góp phần
khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Hầu hết các khâu của các
chu trình chuyển hoá vật chất trong đất đều có sự tham gia của v s v .
Trước hết là nhóm v s v tham gia vào quá trình phân huỷ cellulose- một
hợp chất hữu cơ có khá nhiều trong đất, thành phần chính cấu tạo nên cơ thể
thực vật. ở cây bông cellulose chiếm 90% trọng lượng khô, ở các loài cây gỗ
khác cellulose chiếm 40-50% . Có nhiều nhóm v s v có khả năng phân giải
cellulose cư trú trong đất như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn.
Đáng chú ý nhất là xạ khuẩn (.Actinom ycetes). Chúng phân bố rộng rãi trong
đất, tham gia vào nhiều quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ: cellulose,
tinh bột... góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính

này được ứng dụng trong quá trình chế biến, phân huỷ rác, xử lý các bã thải
nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm.
Từ những lý do trên với mục đích tìm hiểu, làm quen với phương pháp nghiên
cứu v s v nói chung, phương pháp nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose nói

/tờé> i u ’p /ĩạ /tĩ

2

1


x/u u í //ííĩ/ỉ /f)? f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

riêng, tôi chọn đề tài “Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất đồi Đại Lải” .
2. M ục tiêu của đ ề tài
- Phân lập, khảo sát m ật độ phân bố của xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose ở ba độ sâu: 5cm, lOcm, 20cm tại địa điểm là đồi Đải Lải thuộc
phường Đ ồng Xuân - thị xã Phúc Yên - tỉnh Vĩnh Phúc.
- Đưa ra m ột số nhận xét dẫn đến nguyên nhân có sự tập trung của xạ khuẩn
phân giải cellulose tại các vị trí.
- Thử hoạt tính enzym cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập được.
- N ghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của m ột số chủng thuộc chi M icro m o n o sp o ra .
- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của một số chủng thuộc chi M icrom onospora.

3. N ội dun g của đê tài
Nội dung của đề tài “Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose trong đất đồi Đại Lải” để tìm hiểu đặc điểm, sự phân bố của xạ
khuẩn, khẳng định được vai trò của chúng trong đất, đồng thời tìm hiểu các
điều kiện ảnh hưởng: độ ẩm, độ pH, loại đất... tới sự phân bố của xạ khuẩn
phân giải cellulose.
4. Ý nghĩa của đê tài
Đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học cho các phương thức canh tác, cày xới,
cải tạo đất, bón phân... theo hướng lợi dụng v s v phân giải cellulose, tăng
cường các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ để làm giàu dinh dưỡng cho
đất, tăng năng suất cho cây trồng. M ặt khác đề tài cho phép tuyển chọn những
chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh, từ đó có thể tạo ra một
chế phẩm v s v chứa các chủng xạ khuẩn này phục vụ cho việc ủ rác sinh học.

/tờé>Jỉĩ'p/ỉợ/fỉ

2

2


x/u u í //ííĩ/ỉ /f)? f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose

Tất cả các nhóm v s v phân giải cellulose đều thuộc nhóm dị dưỡng,
hoại sinh. Chúng có khả năng này nhờ có hệ enzym cellulose ngoại bào.
Trong đất các nhóm v s v này gồm nhiều loại khác nhau: vi khuẩn, niêm vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm m ố c...
Vi nấm là nhóm có khả năng phân giải cellulose vì nó tiết ra môi trường
một lượng lớn enzym đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính phân
giải các cellulose đáng chú ý là Tricoderm a. Hầu hết các loài thuộc chi
Tricoderm a sống hoại sinh trong đất và đều có khả năng phân giải cellulose.
Chúng tiến hành phân giải các tàn dư của thực vật để lại trong đất góp phần
chuyển hoá một lượng hữu cơ khổng lồ. Trong nhóm vi nấm, ngoài
Tricoderm a còn có nhiều giống khác có khả năng phân giải cellulose như:
Aspergillus, Fusarium, M u c o r... Nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân huỷ
cellulose, tuy nhiên cường độ không mạnh bằng vi nấm. Do số lượng enzym
tiết ra môi trường của vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần các loại enzym
không đầy đủ, ở trong đất thường có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra 4 loại
enzym trong hệ enzym cellulose. Nhóm này tiết ra m ột loại enzym, nhóm
khác tiết ra các loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong
mối quan hệ hữu sinh.
N hóm vi khuẩn hiếu khí đại diện là: Cellulomonas, Pseudomonas,
A ch ro m on ob ater, Bacillus... N hóm vi khuẩn kị khí C lostridium , đặc biệt là
những cầu khuẩn thuộc chi Rum inococcus có khả năng phân giải cellulose
thành đường và axit hữu cơ, sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Chính nhờ
nhóm này m à trâu bò có thể sử dụng được cellulose có trong cỏ, rơm rạ làm
thức ăn.

/tờé>Jỉĩ'p/ỉợ/fỉ

2

3

x /u u í /ffự /ỉ /f)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Niêm vi khuẩn (M yxobacteriales) là những vi khuẩn Gram (-) có khuẩn
lạc nhày ướt, tế bào hình que, nhỏ bé (0,3 - 0,4x 0,7 - 10|j,m), hơi uốn cong,
thường có đầu nhọn, có thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các
vi khuẩn khác. Niêm vi khuẩn phân giải cellulose được tìm thấy trong các
giống: Prom yxobacterium , Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium. Chúng
sống trong môi trường ít axit và ít kiềm. Trên bề mặt các vật liệu chứa
cellulose, niêm vi khuẩn phát triển trong dạng các thể nhày không có hình xác
định, lan rộng, có màu vàng, da cam hay đỏ. M àu sắc khuẩn lạc thường tương
ứng với các chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay ít. Xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose mạnh, nó tiết ra đầy đủ 4 thành phần của hệ enzym
cellulose. Vì vậy nó có khả năng phân giải cellulose m à không phải sống
trong mối quan hệ hỗ sinh với bất kì loài nào khác. Xạ khuẩn phân giải
cellulose gồm các giống: Proactinomyces, Actinom yces, M icrom onospora,
Streptom yces...
1.2. Sơ lược về xạ khuẩn
1.2.1. Vị trí của xạ khuẩn trong hệ thông sinh giới
Xạ khuẩn (Actinom ycetes) là m ột nhóm v s v lớn trong giới Bacteria.
Chúng thuộc nhóm v s v Gram (+) và là nhóm chuyển tiếp giữa Nấm {Fungi)
và vi khuẩn (Bacteria). Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn (A ctinom ycetes)
được tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có hệ sợi phát triển,
có cơ quan sinh sản riêng) và nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ sợi kém phát
triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu). X ạ khuẩn có hệ sợi ngắn như họ
M ycobacteriaceae

và

Actinom ycetaceae,

hoặc

hệ

sợi

dài

như

họ

Streptomycetaceae. Xạ khuẩn được Bergey xếp vào bộ riêng Actinom ycetales
(Bergey’s M anual, 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), Giới Bacteria,
Ngành Firmicutes, Lớp A ctinobacteria, Lớp phụ Actinobacteriaceae...
Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc nhóm v s v nhân
nguyên thuỷ (Prokaryota) thuộc giới khởi sinh (M o n e ra ) trong hệ thống phân

/tờé> i u ’p /ĩạ /tĩ

2

4

/ ' ĩ ỉ —(Vif///

x/uuí/ffự/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

‘HP/ểiÁ <77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

loại 5 giới hay trong hệ thống phân loại 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới vi
khuẩn chuẩn (E ubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ.
Bộ

xạ

khuẩn

gồm

10

họ:

Actinom ycetaceae,

Actinoplanaceae,

p erm atophilaceae,

F rankiaceae,

M icrom onosporaceae,

Therm om onosporaceae,

M icobacteriaceae,

N ocarddiceae

và

Streptom ycetaceae.
1.2.2. Đ ặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.2.2.1. Đ ặ c điểm hình thái của xạ khuẩn
Tuỳ loại môi trường m à xạ khuẩn có hình thái khác nhau. Trên môi
trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc. Tuỳ theo loài, môi
trường nuôi cấy m à kích thước màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như: đỏ,
da cam, vàng, nâu, tím, hồng, x ám ... Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì,
có dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo và thường có cấu trúc ba lớp:
lớp ngoài có cấu trúc các sợi bền chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong và lớp trong
có cấu trúc tương đối xốp. Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hướng sinh trưởng
trong môi trường tạo ra hệ sợi cơ chất (HSCC) và ngoài mặt môi trường tạo ra
hệ sợi khí sinh (HSKS). Đường kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi trong khoảng
0 ,2 -l,0 |im đến 2,0-3,0|um. Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh,
không có vách ngăn. M àu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng,
da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đ en... HSCC có thể sinh ra các sắc tố tan trong nước
hoặc trong các dung môi hữu cơ. HSKS ở tận cùng thường là các chuỗi bào tử
có dạng xoắn, lượn sóng, thẳng, vòng... Đây là một đặc điểm khá quan trọng
để phân loại xạ khuẩn. Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục,
hình que, hay hình trụ... Cấu trúc bề mặt bào tử có thể là nhẵn {Smooth), có
gai (Spinny), khối u (W arty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc {Hair- like)...
Hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những chỉ

tiêu quan trọng để định loại xạ khuẩn.

/tờé> i u ’p /ĩạ /tĩ

2

5


x /u u í /ffự /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

‘HP/ểiÁ <77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng m àng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trường hay thành dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên
máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng
sợi bông hoặc cặn xốp. Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành
những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1 min đến 2- 3min.
1 .2 2 .2 . Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu tạo tương đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào,
màng tế bào chất, vật chất nhân sơ và các hạt dự trữ. Xạ khuẩn thuộc nhóm
v s v Gram (+). Thành tế bào dày khoảng 20nm có vai trò duy trì hình dạng hệ
sợi và bảo vệ tế bào, được cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptide, các gốc
N

- Acetylglucosam ine

liên

kết với N

- Acetylm uram ic

(hoặc

N

-

Glycolylm uram ic ví dụ như chi M icrom onospora).
Căn cứ vào kết cấu hoá học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4
nhóm sau:
•

N hóm 1 (Type I): Có chứa L-D iam inopim elic (L-ADP) và glycine.
Gồm

có

các

chi

Streptomyces,

Streptoverticillium,

Chairia,

Nocardỉoider.
• N hóm 2 (Type II): Có

chứa M eso-D iam inopim elic (M eso-ADP) và

glycine. Gồm các chi

M icrom ospora, Actinoplans, Ampullariella,

D actilosporangium.
•

N hóm 3 (Type III): Có chứa M eso- Diaminopimelic (Meso-DAP). Gồm
có Actinom adura, Actinobigfida, D erm atophilus, Geodermatophilus,
Nocarcliopsis, M icron ob ispo ra ...

•

N hóm 4 (Type IV): Có chứa M eso-D iam inopim elic (Meso-DAP). Gồm
có

N ocardia,

Oerskovia,

Prom icrom onospora,

Rhodococcus, M ycrob acteriu m ...

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ Ä

2

6

Pseudonocardỉa,


‘H
P/ểiÁ<77ĩ////f/ cư
/ff/ĩ

x /u u í /ffự /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

1.2.2.3. Đ ặc điểm sinh lý, sinh hoá của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu,
axít hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất khác để làm nguồn cacbon. Còn
nitrat, nitrit, muối amon, ure, axit amin, pepton, cao men, cao thịt... để làm
nguồn nitơ. ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là
khác nhau. Phần lớn xạ khuẩn là v s v hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho
sinh trưởng và phát triển là 25 - 30°c. Đ a số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi
trường có pH là 6,8 - 7,0, m ột số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường
kiềm. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các sinh vật
khác của nhóm nhân sơ là có tỉ lệ G + X cao (>70%), trong khi đó vi khuẩn
khá thấp (25% - 45%). M ột trong những đặc điểm đáng lưu tâm của xạ khuẩn
là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại
trong phân tử ADN. Điều này đã gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất
sinh lí, sinh hoá của xạ khuẩn (khả năng đồng hoá các nguồn cacbon, khả
năng đồng hoá các nguồn nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả

năng phân giải cellulose...)*
1.2.3. Phán bô của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm v s v phân bố rộng rãi trong tự nhiên. X ạ khuẩn có
thể phân lập từ đất, nước, không khí, bùn, rác... Đặc biệt trong đất xạ khuẩn
chiếm số lượng rất lớn (Kuster, 1986). Theo W aksm an thì trong đất xạ khuẩn
chiếm 9% - 45% tổng số các v s v . Và trong 1 gam đất có chứa tới 2900024.000.000 mầm xạ khuẩn. Tuy nhiên tuỳ các vùng đất khác nhau trên thế
giới m à có sự biến đổi lớn về số lượng xạ khuẩn trong đất. Số lượng xạ khuẩn
ở miền N am bán cầu bao giờ cũng cao hơn m iền Bắc bán cầu. Ngoài ra số
lượng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu
của đất, mức độ che phủ của thực vật... Đất giàu dinh dưỡng, hữu cơ , khoáng
thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo dinh dưỡng. Trong 1 gam đất canh
tác có thể phân lập được 5.000.000 CFƯ/g xạ khuẩn. Đất vùng sa mạc khô

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

1


‘HP/ểiÁ <77ĩ/ ///f/ cư
/ff/ĩ

x /u u í /ffự /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

nóng, nghèo dinh dưỡng có số lượng xạ khuẩn ít hơn, dao động trong khoảng
10.000 - 100.000 CFU/g.
Xạ khuẩn là nhóm v s v ưa trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố
của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào độ pH của đất. ở các đất có độ pH
trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khuẩn cao hơn so với các vùng đất

có độ pH quá kiềm hoặc quá axit (chua). Đ ồng thời số lượng xạ khuẩn còn
phụ thuộc vào các thời điểm trong năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần
phải chú ý tới các điều kiện như thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy
mẫu, độ ẩm, nhiệt độ...
1.2.4. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là m ột trong nhiều loại v s v có ý nghĩa quan trọng trong tự
nhiên bởi vai trò tích cực trong việc tham gia vào các quá trình chuyển hoá
những hợp chất trong đất, nước. Xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh,
có 60% -70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng này như: Atinoplanes,
Streptoverticinnium, Streptom yces... các chất kháng sinh có giá trị do chúng
sinh ra được sử dụng rộng rãi trong y học. M ặt khác xạ khuẩn có khả năng
phân giải cellulose trong bã thải nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm nhằm
ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ.
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn
1.2.5.1. Sơ lược lịch sử p h ân loại xạ khuẩn
Trước thế kỉ XIX, người ta xếp xạ khuẩn vào giới nấm {Fungi), v ề sau,
các nghiên cứu cho thấy chúng có nhân nguyên thuỷ, kích thước bề ngang nhỏ
như vi khuẩn nên người ta xếp vào giới vi khuẩn (E ubacteria).
Foster là người đầu tiên phân lập m ột loài xạ khuẩn từ tuyến mắt của
người và được John miêu tả năm 1874. Và đến năm 1977, Harz mô tả đầu tiên
một loài xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, đựợc phân lập từ bệnh “nấm sao”
của trâu bò và đặt tên là A ctinom yces bovis. N ăm 1914, Krassinilcov lần đầu
tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân biệt các loài khác nhau và sơ bộ
/tờé>iu’p/ĩạ/tĩ

2

8

x /u u í /ffự /ỉ /f)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

phân loại 17 chủng thuộc chi Actinom yces. Ô ng coi các đặc điểm sinh lý là
mấu chốt trong nguyên tắc phân loại. W aksm an và Curtis (1979) đã đề cập
đến các dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình. Các ông coi đặc
điểm hình thái của bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các cơ thể.
Năm 1926, Millard và Burr đã tìm ra 17 loài mới, Jensen (1930-1931)
tìm ra được 2 loài mới. Đến năm 1934, Dutche tìm ra 13 loài mới. Baldacci và
cộng sự nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936-1953 công bố một khoá phân loại
chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC và một số đặc điểm trung gian
khác.
W aksm an và Henrici (1953) đã đưa ra m ột hệ thống phân loại, đến năm
1961 được sửa đổi lại. Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn đựơc xếp thành
nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi
Streptomyces. Krassinilcov từ năm 1941-1949 đã phát hiện trên 38 loài mới.
Năm 1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống
công bố năm 1949, trong đó xạ khuẩn được phân thành 6 họ gồm 26 chi.
Năm 1957, Gause và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ
thống phân loại mới này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng m àng bào
tử và cuống sinh bào tử. Hệ thống này được chỉnh lý và tái bản năm 1983.
Càng ngày, số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn càng nhiều như hệ thống
phân loại của Prihan (1972), N onom ura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ thống
phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988). Và để thống nhất trong cách
mô tả, ISP (Iternational Streptomyces Project) đã nêu lên phương pháp môi
trường mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966).
1.2.5.2. M ộ t sô phư ơng ph á p cơ bản trong p h â n loại xạ khuẩn hiện nay
1 .2 .5 2 .1 . D ự a vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Hầu hết các chi xạ khuẩn được mô tả hiện nay phân chia khác nhau tuỳ
thuộc vào sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như: màu

/tờé>iu’p/ĩạ/tĩ

2

9


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

sắc của HSKS, HSCC và màu sắc của sắc tố tan, hình dạng cuống sinh bào tử,
hình dạng và kết cấu bề mặt bào tử...
Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy người ta chia xạ
khuẩn thành 4 nhóm chính sau:
N hóm /: Gồm các xạ khuẩn có bào tử rõ rệt. Đặc trưng của nhóm này là
sinh sản bằng bào tử, có hệ sợi phân nhánh thành HSKS và HSCC.
N h ó m 2: Gồm các xạ khuẩn có các bào tử nang. Đặc trưng của nhóm
này là hệ sợi phân chia theo hướng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc
tương tự nang bào tử.
N hó m 3 : Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocarclia. Đặc trưng của nhóm
này là sinh sản bằng cách phân đốt hệ sợi.
N hóm 4 : Gồm các xạ khuẩn có dạng tương tự C orynebacterium và dạng
hình cầu. T ế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu, thường không có hệ sợi.
Theo tài liệu của ISP được nêu lên bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969
và 1972) và trong cuốn “B ergey’s M anual” được xuất bản lần thứ 8, người ta

chia xạ khuẩn thành 6 kiểu (Section) căn cứ vào hình dạng cuống sinh bào tử:
Section S: Type “ Spira” = chuỗi bào tử xoắn.
Section SR A : Type “ Spira Retinaculum A pertum ” = Chuỗi bào tử xoắn
có khoá, có móc.
Section SRF: Type “Spira Rectus Flexbilis” = Chuỗi bào tử xoắn, cong
đến thẳng.
Section RA: Type “Retinaculum A pertum ” = Chuỗi bào tử có móc, có
khoá.
Section R A R F : Type “Retinaculum Apertum Rectus Flexbilis” = Chuỗi
bào tử có khoá, thẳng, lượn sóng.
Section RF : Type “Rectus Flexbilis” = Chuỗi bào tử thẳng đến lượn
sóng.

/tờé>iu’p/ĩạ/tĩ

2

10


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Trước đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy được coi là dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn nhưng do chính cùng một loài có
thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái do biến dị tự nhiên hay những loài
khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy ngày nay trong phân
loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác như: đặc điểm sinh lý,

sinh hoá, miễn dịch học, sinh học phân tử.
1.2.5.2.2. Đ ặ c điểm hoá phân loại
Trong 20 năm trở lại đây việc sử dụng các thông tin về thành phần hoá
học của tế bào đã được ứng dụng rộng rãi để phân loại Procaryota. Hoá phân
loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
Type thành t ế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
dây nối peptit, đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế
bào.
Type Peptidoqlucan (PG).
Type phospholipit.
Trong các đặc điểm trên, type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn. Theo hướng phân loại sinh hoá, người ta chia thành
tế bào xạ khuẩn thành 4 type sau:
Type /: Thành tế bào có LL- D A P và glixerin.
Tỵpe 2: Thành tế bào có m- DAP và glixerin.
Type 3: Thành tế bào có m- DAP.
Type 4: Thành tế bào có m- DAP, đường arabinose, galactose.
1.2.5.2.3. Đ ặ c điểm sinh lý, sinh hoá
Khi phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hoá như: khả năng sử dụng nguồn c và N, nhu cầu về nhân
tố sinh trưởng, khả năng sinh các enzym dezoxyribonuclease, nitrat reductase,
phosphatase, catalase, amylase, protase, cellulase...; nhu cầu về oxi, pH, nhiệt
độ tối ưu, khả năng chịu mặn, khả năng sinh chất kháng sinh...

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

11

x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Tuy nhiên, theo Hopwood và cộng sự (1975) thì hầu hết các đặc điểm
sinh lý, sinh hoá rất dễ biến dị do mức độ ổn định di truyền không cao. Vì
vậy, ngày nay để phát hiện những loài mới trên cơ sở khác nhau về đặc điểm
sinh lý, sinh hoá, người ta cũng sử dụng các phương pháp như: phương pháp
phân loại số dựa trên sự giống nhau giữa các v s v theo một số lớn các đặc
điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý- hoá sinh; phương pháp
nghiên cứu chủng loại phát sinh và phương pháp sinh học phân tử như lai axit
nucleic A D N và A R N , protein và đặc biệt là so sánh trình tự A R N 16S...
*

Phân loại số: Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về mức độ giống

nhau giữa v s v trong m ột số lớn các đặc điểm chủ yếu là đặc điểm hình thái,
sinh lý, sinh hoá để so sánh các chủng với nhau từng đôi một theo công thức
sau:
SAB= S*lOO/(nS +nd)
Trong đó:
SAB: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể
nS: Tổng số các đặc điểm dương tính của hai chủng so sánh
nd: Tổng các đặc điểm dương tính của chủng này m à âm tính của chủng
kia
Kết quả của sự so sánh này được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tuỳ thuộc vào
mức độ giống nhau mà các v s v được xếp vào các nhóm.
*

N ghiên cứu về phát sinh chủng loại: N hờ sự sắp xếp phát sinh chủng

loại m à các v s v được xếp vào hệ thống phân loại gần như tự nhiên hơn. Các
nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng
cách tiến hành so sánh các cao phân tử A D N , A R N , protein m à quan trọng
hơn cả là sự sắp xếp các nucleotit của rA RN 16S. Mức độ giống nhau giữa hai
cá thể so sánh thể hiện mối quan hệ giữa chúng.

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

12


x/uuí//ííĩ/ỉ /f)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

1.3. C ellulose và Cellulase
1.3.1. C ellulose
Cellulose là một polysaccarit m ạch thẳng gồm từ 1400-12000 gốc ß-Dglucose liên kết với nhau bởi các liên kết ß-1 ,4-glucosit. Trong phân tử
cellulose các phân tử ß-D-glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành. Hai
phân tử khác nhau quay góc với nhau 180°. Cellulose là loại hợp chất hữu cơ
dồi dào trong tự nhiên chiếm tới 40% -50% hydratcacbon. Cellulose có cấu
trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5|um với đường kính 3nm. Các sợi này
liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các liên kết Vandervan tạo thành
các bó sợi nhỏ có đường kính 10-40nm gọi là vi sợi (microfibrin). Các vi sợi

có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của cellulose, cellulose
dạng m ixen gồm hai vùng:
•

V ùng kết tinh (Crystolline regions): Có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn
cản sự hấp thụ nước và ít chịu tác động phân giải. Vùng này chiếm 3/4
cấu trúc cellulose.

•

V ùng vô định hình (Amorphous regions): Có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ
bị trương lên và dễ bị phân giải.

Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi hấp thụ
nước. Cellulose bị thuỷ phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ khá
cao, hoặc bị phân giải bởi các cellulose sinh ra từ nhiều loại sinh vật.

H ìn h 1.1. Cấu trúc không gian lập thể của cellulose

''iOại/ĩờ£átĩ’p/tợ/it Ä

2

13


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

1.3.2. Cellulase
Enzym cellulase xúc tác cho quá trình chuyển hoá cellulose thành các
sản phẩm hoà tan, dễ sử dụng (hấp thu). Hệ thống cellulase bao gồm 3 loại
chính sau:
• Endo-P-glucanase

hay

1,4-P-D-glucan

glucan

hydrolase,

cellobiohydrolase (CBH), CMC- ase (Cx): Enzym này tấn công vào các điểm
khác nhau trên chuỗi cellulose của CMC, cellulose trương phồng, các cellooligosaccarit. Chúng phân cắt các chuỗi cellulose m ột cách ngẫu nhiên, sản
phẩm tạo thành là glucose và các oligosacarit (có thể từ 3-6C hoặc nhiều hơn).
Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exo glucanase
hoạt động. Bởi vậy cellulose vùng kết tinh được phân giải triệt để, hiệu quả.
• Exo-P-glucanase hay 1,4-P-D-glucan cellobio hydrolase, Avicelase:
enzym này tấn công vào đầu không khử (non-reducing end) của cellulose và
kết quả là tạo ra các cellobiose.
• P-glucosidase hay cellobiose: Thuỷ phân cellobiose và một vài cellooligosaccarit thành glucose. Hoạt tính của P-glucosidase m ạnh nhất trên
cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi.
1.3.3. H ệ enzym p h â n giải cellulose
Sở dĩ m ột số nhóm v s v phân giải được cellulose là nhờ phức hệ enzym
cellulose gồm 4 enzym khác nhau tác dụng với các mối liên kết của đại phân
tử cellulose. Đầu tiên enzym cellobiohydrolase (enzym C|) có tác dụng cắt đứt
liên kết hydro, biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng

cellulose vô định hình không có cấu trúc lớp. Enzym thứ hai là endoglucanase
có khả năng

cắt đứt các liên kết P-l,4-glucozit tạo thành những chuỗi dài.

Enzym thứ ba là exogluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành
disaccarit gọi là cellobiose. Cả hai loại enzym endoglucanase và exogluconase

/ĩờứ J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

14

—
cftft/t


<7/ỉ/ ///f/ c

x /u u í /ffậ /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ/ /từế*

gọi chung là Cx. Enzym thứ tư là ß-glucosidase tiến hành thuỷ phân cellobiose
thành glucose.

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ Ä

2

15

—cf/ftA


x/uuí//ííĩ/ỉ /f)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//tiff

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. N guyên liệu
Các m ẫu đất lấy từ đất đồi Đại Lải thuộc phường Đ ồng Xuân- thị xã
Phúc Yên- tỉnh Vĩnh Phúc.
2.1.2. H oá chất
Các hoá chất: K H 2P04, M g S 0 4. 7 H 20, N H 4C1, K N 0 3, N aN 03, (N H 4)2S 0 4,
N H 4N 0 3, NaCl, NaOH, HC1, F e S 0 4. 7H 20, C aC 03...
Tinh bột tan, cao nấm men, pepton, thạch, cazein, CM C (Cacboxyl
Methyl Cellulose), cao thịt...
2.1.3. D ụ n g cụ và thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, bàn trang, pipet, đèn cồn, bình tam giác,
giá đựng ống nghiệm.
- Thiết bị: Tủ ấm vi sinh (Heraeus- Đức), tủ sấy (Heraeus- Đức), nồi hấp
(TO M Y - Nhật), cân Sartorius, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, máy đo pH hãng
Horiba.
2.1.4. M ô i trường p hân lập xạ khuẩn
- M T Czapeck-tinh bột:
Tinh bột tan

: 20g

C aC 03

: 3g

KC1

:0 ,5 g

F e S 0 4.7H20

: 0,01 g

M g S 0 4.7H20

:0 ,5 g

Thạch aga

: 20g

N aN 03

:3 g

Nước cất

: 1 lít

k 2h p o

: lg

pH

: 7,0

4

- M T Czapeck-glucose:
Glucose

:3 0 g

F e S 0 4.7H20

: 0,0 lg

KC1

:0 ,5 g

Thạch aga

: 20g

C aCO,

:3g

Nước cất

: 1lít

/tờé>iu’p/ĩạ/tĩ

2

16


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

M g S 0 4.7H20

:0 ,5 g

N aN 03

3g

K 2H P 0 4

: lg

pH

6,8

- M T Czapeck (nguyên gốc)
Sacarose

30g

KCl

0,5g

FeSO,

0,0 lg

N aN 03

3g

K 2H P 0 4

Ig

Nước cất

lOOOml

M g S 0 4.7H20

0,5g

Thạch aga

20g

pH

7,2-7,4

- M T Gause I
Tinh bột tan

:2 0 g

NaCl

: 0,5g

KNO3

:0 ,lg

FeS04

: 0,0 lg

:0 ,5 g

Thạch aga

: 20g

: 0,05g

Nước cất

: lOOOml

pH

: 7,4

k 2h p o

4

M g S 0 4.7H20

* M T nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả năng phân giải celluloí
- Môi trường 1:
Pepton

: 5g

Nước cất

: lOOOml

Cao thịt bò

: 3g

pH

: 6,8-7,0

NaCl

: 5g

Thạch aga

: 20g

Glucoza

: lg

Nước chiết đất: lOOml

K 2H P 0 4

: 0,5g

Nước cất

: 900ml

Thạch aga

: 20g

pH

: 6,5- 7,0

- Môi trường 2:

Chuẩn bị nước chiết đất:
Ikg đất+ 1 lít nước sạch
Hấp khử trùng 30 phút trong nồi hấp
Bổ sung thêm lg C a C 0 3 rồi lọc lấy nước trong

/títe

ỉ

<
W
ị>
ì/2

17-


x/uuí/ffự/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

2.2.

‘H
P/ểiÁ<77ĩ////f/ cư
/ff/ĩ

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương ph áp lấy mẫu (N guyễn Thành Đ ạ t 1990)
Trên mỗi loại đất dùng dụng cụ lấy đất ở các độ sâu theo thứ tự 5cm,
lOcm, 20cm. Sau mỗi lần lấy m ột mẫu đất thì lấy khoảng lOOg cho vào túi
nilon, trên túi có ghi độ sâu lấy mẫu sau đó buộc túi lại để tránh bay hơi nước
và tránh các v s v lạ xâm nhập vào. Các mẫu đất lấy ở m ột địa điểm cho chung
vào 1 túi, có ghi đầy đủ ngày lấy mẫu nơi lấy mẫu, loại đất, đặc điểm sinh
cảnh. M ẫu sau khi được thu thập cần phải tiến hành phân lập ngay. Nếu chưa
phân lập được thì phải bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-5°C.
2.2.2. X ác định độ ẩm của đất
Đất thu được cho vào túi nilon buộc chặt đem về phòng thí nghiệm cân,
sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở 105°c đến khô kiệt nước. Độ ẩm tuyệt đối của đất
được tính theo công thức:
w% = -100%
b
Trong đó:

w % : Độ ẩm tuyệt đối.
a: Khối lượng nước
b: Khối lượng đất khô tuyệt đối
2.2.3. X ác định p H của đất
* Nguyên tắc
Dùng một m uối trung tính dễ phân li (ví dụ KC1 để trao đổi với ion H +
bám trên keo đất theo phương trình phản ứng:

2H+
+ nKCl -» (PHH P)nK ++ CaCl2+ M gC l2+ A1C13+ 2HC1 + (n-9) c r

A l3+
M g 2+
Ca2+

Sau đó xác định ion H+ bằng phương pháp đo độ pH bằng máy.

/ĩfM
' Jỉĩ'p/ỉợ/fỉ

2

18


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Cách tiến hành: Cân lOg đất khô trong không khí, cho vào bình tam

giác có dung tích 250ml, rót thêm vào đó 50ml dung dịch KCl IN, lắc đều
trong 30 phút. Để yên cho lắng trong, lọc gạn trên giấy lọc xếp nếp. Lấy phần
nước trong đem đo pH trên máy đo hãng H oriba (độ chính xác đến 0,01).
2.2.4. C huẩn bị m ôi trường p hân lập và bảo quản

Đầu tiên, bao gói các dụng cụ thí nghiệm đã được rửa sạch và làm khô.
Tiến hành khử trùng bằng nồi hấp (ở áp suất 0 ,8 -la tm trong thời gian 3045 phút) rồi đưa sang tủ sấy. Cùng với thời gian đó tiến hành cân các hợp chất
để làm môi trường, chọn môi trường Czapeck-tinh bột, bình đựng môi trường
phải đảm bảo đã được rửa sạch và khử trùng trước đó, độ cao của môi trường
trong bình chỉ chiếm 2/3, sau đó nút bông và bao miệng bình. Tiếp theo cho
bình đựng m ôi trường vào nồi hấp, khử trùng theo phương pháp Pasteur. Giấy
lọc được cắt tròn có diện tích bằng diện tích đáy hộp petri, rồi cho vào hộp
lồng bao gói cẩn thận đem khử trùng cùng với các dụng cụ thí nghiệm. Tất cả
các dụng cụ thí nghiệm và môi trường hấp, sấy liên tiếp trong 3 ngày:
Ngày 1: Để tiêu diệt v s v
Ngày 2: Để tiêu diệt các bào tử
Ngày 3: Đảm bảo điều kiện vô trùng
Môi trường sau khi khử trùng đổ ngay ra hộp petri đã khử trùng, bề dày
của môi trường trong mỗi hộp petri khoảng 3- 4mm là đủ. Sau khi đông, trên
bề mặt thạch thường có một số giọt nước cần tiến hành sấy khô bề mặt thạch
trước khi cấy bằng cách: Cho nhiệt độ tủ sấy lên cao để khử trùng tủ, sau đó
hạ xuống đến 80°c thì đưa các đĩa thạch vào, úp ngược hộp petri lại rồi ghếch
đáy hộp kênh trên thành của nắp hộp để dễ thoát hơi nước và tránh bụi rơi vào
bề mặt thạch. Tắt tủ ấm và đợi cho khi nào nhiệt độ tủ hạ xuống nhiệt độ
phòng thì đậy từng hộp petri lại và lấy ra. Cũng có thể sấy khô mặt thạch ở
nhiệt độ 60-70°C trong vòng 15 phút.

/ĩfM' J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

19


‘H

P/ểiÁ<77ĩ////f/ cư
/ff/ĩ

x /u u í /ffự /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

Để có môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng ta rót 3- 4 ml môi
trường vào m ỗi ống nghiệm, đậy nút bông và khử trùng như phương pháp nêu
trên. Sau khi khử trùng xong đặt nghiêng ống nghiệm đựng môi trường khi
đang còn nóng.
2.2.5. Phư ơng ph áp phân lập xạ khuẩn từ m ẫu đất
Mỗi m ẫu đất cân lấy lOg cho vào cối sứ nghiền kĩ, trộn đều. Sau đó cho
vào bình tam giác vô trùng có dung tích 500m l chứa sẵn lOOml nước cất vô
trùng, lắc đều trong 10-15 phút để lắng. Dùng pipet hút lấy lOOml dung dịch
đất này cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất đã khử trùng, lắc trộn
đều, lúc này ta có dịch đất với độ pha loãng 10'2. Lại lấy tiếp lm l dịch pha
loãng ở nồng độ 10'2 cho sang ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã vô trùng thu
được dung dịch pha loãng có nồng độ 10'3. Cứ tiếp tục như vậy với những ống
nghiệm tiếp theo ta có dung dịch đất với độ pha loãng 10'4, 10'5, 10"6... Tuỳ
theo m ật độ phân bố của xạ khuẩn trong mẫu đất m à ta chọn dịch đất có độ
pha loãng thích hợp. Ở đây tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10'5. Dùng pipet
vô trùng hút 0,5ml dung dịch đất có độ pha loãng 10'5 nhỏ lên bề mặt thạch
trong hộp petri, lấy bàn trang thuỷ tinh gạt đều giọt dịch này lên khắp bề mặt
thạch. Sau đó đặt m ột miếng giấy lọc đã vô trùng lên trên và dùng bàn trang
thuỷ tinh vô trùng làm cho giấy lọc dính sát vào bề mặt thạch. Với độ sâu
5cm, lOcm, 20cm, ở mỗi độ sâu tiến hành cấy vào 5 đĩa petri như vậy có 15
đĩa petri. Sau đó dùng giấy báo gói các hộp petri, đánh dấu và đưa vào giữ
trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-30°C. Sau 7 ngày m ang các hộp petri ra qua sát
khuẩn lạc trên môi trường thạch. Ta có thể thấy những chỗ xuất hiện khuẩn
lạc giấy lọc bị bào m òn, nhìn thấy cả sợi giấy. Đ ếm số lượng các khuẩn lạc xạ
khuẩn mọc trên khoang giấy lọc.

* Cách đếm khuẩn lạc
Dùng bút chì chia đáy hộp thành nhiều phần sau đó lần lượt đếm số
lượng khuẩn lạc theo từng phần nhỏ. Cũng có thể dùng những thiết bị đặc biệt

/ỉếM' J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

20


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

để đếm số lượng khuẩn lạc một cách thuận lợi hơn. Các thiết bị này có thể chỉ
là một bản gỗ chia ra thành nhiều ô nhỏ có thể lắp m ột kính lúp phía trên,
cũng có thể lắp m ột bút điện hoặc máy bấm đặc biệt giúp cho việc ghi một
cách tự động. Số lượng xạ khuẩn trong lg đất khô được tính theo công thức:

Trong đó :
X : Số lượng xạ khuẩn trung bình trong l g đất đó
a : Số lượng khuẩn lạc trung bình trên m ột hộp petri
b : Đ ộ pha loãng của dung dịch đất phân lập
c : Số ml dịch đất phân lập trên một hộp petri
d : Số gam đất khô từ một gam mẫu đất phân lập
Cấy truyền những khuẩn lạc xạ khuẩn m ọc riêng biệt không bị nhiễm
sang các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Czapeck- tinh bột. Các giống
này được gói lại bằng giấy báo và được đưa vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 28-

30°c. Sau 5-7 ngày mang ra kiểm tra lại, nếu thấy ống nghiệm nào không mọc
hoặc bị nhiễm thì loại bỏ hay cấy truyền lại để cuối cùng ta được các ống
nghiệm có các chủng xạ khuẩn thuần chủng.
2.2.6. Phư ơng ph áp bảo quản và sử dụng g iốn g (N guyễn Thành Đ ạ t , 1974)
Dùng que cấy vô trùng tách xạ khuẩn từ các khuẩn lạc riêng rẽ sang các
ống môi trường thạch nghiêng Gause I đã chuẩn bị sẵn. Sau 7-14 ngày nuôi
cấy, lấy ra kiểm tra và loại bỏ những ống nhiễm sau khi đã tách loại xạ khuẩn
sang các ống khác, cuối cùng thu được các ống giống thuần. Các ống giống
thuần được bảo quản ở tủ lạnh 2- 4°c. Cấy truyền định kỳ 1 tháng một lần.
Trước khi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý- hoá sinh cần phải hoạt
hoá các chủng xạ khuẩn và cấy truyền giữ giống.

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

21


x /u u í /ffự /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ//tờế>

‘HP/ểiÁ <77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

2.2.7. Phư ơng p h á p x ử lý sô liệu bằng thông kê toán học
Tính giá trị trung bình
_

n V

X=M=Ẽ ^ i=l n
Trong đó:
M: Giá trị trung bình tổng thể
Xịi Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ 1 —> n
n: Số lần thí nghiệm
2.2.8. Phương p h á p quan sát hình thái xạ khuẩn (Krassinỉcov 1970, Gause
1983 , W aksm an 1961)
2.2.8.1. Phư ơng p h á p x ẻ rãnh thạch
Cấy xạ khuẩn lên môi trường dinh dưỡng trong hộp petri bằng cách trải
dày bằng que trang. Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp petri. Đặt
một hoặc hai lá kính vô trùng lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp hộp petri
để vào tủ ấm 28°-30°C trong 7-14 ngày. Lấy ra quan sát và chụp ảnh cuống
sinh bào tử, hệ sợi dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400-1000 lần.
2 .2 .8 2 . Phư ơng p h á p khối thạch
Đổ m ôi trường Gause I vô trùng vào hộp petri sao cho thành một lớp
mỏng (1-1,5m m ). Đổ khô môi trường, dùng khoan nút chai (0 = 0,9mm)
khoan các khối thạch. Đặt các khối thạch lên lam kính vô trùng đã chuẩn bị
sẵn, đặt trong hộp petri vô trùng (trong mỗi hộp petri có m ột cục bông ẩm).
Cấy xạ khuẩn lên khối thạch. Đặt vào tủ ấm 28°-30°C trong 7-14 ngày. Quan
sát hệ sợi và cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại
400-1000 lần.
2.2.9. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường G ause I thạch đĩa hoặc thạch
nghiêng. Quan sát hình thái và mô tả màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn theo thang
màu chuẩn của Bondarsev (1954), qua đó sơ bộ phân nhóm xạ khuẩn.

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

22


x /u u í /ffậ /ỉ /t)? f/f//ỉỉ'ip ếTợ/ /từế*

<7/ỉ/ ///f/ c

2.2.10. X ác định hoạt tính enzym cellulase
Cấy chấm điểm xạ khuẩn trên môi trường thạch đĩa có các cơ chất
tương ứng. Sau 7 ngày thử hoạt tính enzim bằng thuốc thử đặc trưng và đo
vòng phân giải (D-d, mm) với D: V òng phân giải cơ chất, d: Đường kính xạ
khuẩn. Xác định hoạt tính enzim cellulose bằng môi trường chứa 0,5% bột
giấy và CMC, thử bằng thuốc thử lugol.

/ĩfM' J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

23


x/uuí//ííĩ/ỉ /t)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//từế*

<77ĩ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn
Theo phương pháp lấy mẫu như trên tôi đã thu thập được 3 mẫu đất ở 3 độ
sâu khác nhau trong khu vực đất đồi Đại Lải:
1. Độ sâu 5cm
1. Độ sâu 10cm
2. Độ sâu 20cm
Sau khi thu mẫu tôi đã tiến hành xác định độ ẩm, độ pH của các mẫu
đất phân lập xạ khuẩn (theo phương pháp của N guyễn Lân Dũng) tại phòng thí
nghiệm vi sinh, khoa sinh- KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2. Căn cứ vào mật độ
xạ khuẩn trong các mẫu, tôi chọn dịch đất có độ pha loãng 10'5 của các mẫu
đất để phân lập, mỗi mẫu đất được phân lập trên 5 hộp petri. Sau 5 - 7 ngày lấy
ra quan sát những khuẩn lạc mọc được trên giấy lọc tức có khả năng phân giải
cellulose vì giấy lọc có cấu tạo từ cellulose, các v s v này đã tiết ra hệ enzym
cellulose để đồng hoá nên phát triển được trên giấy lọc.
Theo lý thuyết, trên môi trường Czapeck, cả xạ khuẩn, nấm mốc và một
số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại v s v này đều có khả năng phân
giải cellulose. Nhưng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này: khuẩn lạc vi
khuẩn thường nhày, ướt và nhẵn; khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn
chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, trường hợp không có sợi khí
sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo; khuẩn lạc của nấm mốc cũng có nhiều màu
sắc như m àu sắc khuẩn lạc của xạ khuẩn nhưng khác ở chỗ nó phát triển
nhanh hơn thường to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần, dạng xốp hơn do kích
thước sợi nấm to hơn. Thường thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích
thước 5-1 Omm, trong khi đó khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5-2mm.

(%

//

J ỉĩ'p /ỉợ /fỉ

2

24

—cftft/t


x/uuí//ííĩ/ỉ /f)?f/f//ỉỉ'ip sTợ//tiff

<77ỉ/ ///f/ c ư
/ff/ĩ

B ảng 3.1. Sự phân bố của xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải

Tháng

8

9

10

Độ

Độ

Số lượng khuẩn

Số lượng xạ

SỐ lượng

sâu

ẩm

lạc trung bình

khuẩn trong

xạ khuẩn

(cm)

%

trong 1 hộp petri

1g đất khô

trung bình

5

7,1

6,0

1

2,10.105

10

7,2

6,05

1

2,15. 105

20

7,3

6,05

1,3

2,56. 105

5

7,6

6,1

1,2

2,56. 105

10

7,7

6,08

1,2

2,60. 105

20

7,9

6,1

1,3

3,02. 105

5

8,1

6,2

1,4

3,45. 105

10

8,2

6,2

1,6

3,85. 105

20

8,3

6,2

1,8

4,26. 105

pH

2,27. 105

2,71. 105

3,85. 105

Q ua kết quả phân lập xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Đại Lải
được thống kê ở bảng 3.1 có thể rút ra một số nhận xét sau:
Sự phân bố của một số nhóm xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi
Đại Lải là rộng. Số lượng của các nhóm này trong lg đất khô dao động từ
2,10.105- 4 ,2 6 .105. Theo những kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn đã được
khẳng định từ trước tới nay của nhiều tác giả trong và ngoài nước thì xạ khuẩn
là v s v hoại sinh, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển
của xạ khuẩn là 25-30°C, độ ẩm thích hợp từ 40-55% , độ pH trung tính hoặc
kiềm nhẹ. Trên cơ sở này tôi phân tích lý giải sự khác nhau của mật độ xạ
khuẩn phân giải cellulose trong các mẫu đất như sau:
Đ ất đồi Đại Lải là loại đất feralit đỏ vàng, bị xói mòn, rửa trôi mạnh,
kết von và trơ đá. Loại đất này rất nghèo chất dinh dưỡng, ít cây cối mọc
được, chỉ có bạch đàn, keo lá tràm và m ột lớp cỏ mọc thấp, thưa thớt. Đất lại

/tờé> i u ’p /ĩạ /tĩ

2

25