xây dựng quy trình phát hiện clostridium perfringens trong thực phẩm bằng kĩ thuật pcr (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và chân thành, tôi xin cảm ơn:
Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh đã cung
cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
Thầy PGS.TS. Trần Linh Thước và ThS. Nguyễn Tiến Dũng đã luôn tận tâm
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Thầy Long, các bạn Huệ, Na, Phượng, Ánh, Thanh, Loan của Trung tâm Khoa
học và Công nghệ Sinh học, Phòng Thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự
nhiên Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực nghiệm.
Nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn sở Giáo dục và Đào tạo Tp. Hồ Chí
Minh, Ban Giám Hiệu Trường Trung học phổ thông Trần Phú đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành tốt khóa học này.

Thành phố Hồ Chí Minh tháng - 2005
Nguyễn Thị Ngọc Yến

3


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
AOAC

: Association of Official Analytical Chemist (Hiệp Hội các nhà

hóa học phân tích nhà nước)
Bp

: base pair (cặp base)

CFU

: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

KDa

: Kilo Dalton (1.000 da)

DNA

: Deoxyribonucleic acid

dNTP

: 2'- Deoxynucleoside - 5'- triphosphate (nucleotide dùng để tổng

hợp DNA)
ELISA

: Enzyme - linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm hấp phụ

miễn dịch gắn enzim)
ISO

: International Standards Organization (Tổ chức Tiêu chuẩn quốc

NordVal

: Nordic System for Validation of Alternative Biological Method

tế)

(hệ thống Nordic đánh giá phương pháp sinh học thay thế)
PCR

: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng hợp bằng

polymerase)
TAE

: Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)

Taq

: Thermus aquaticus

TE

: Tris - EDTA

4


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... 3
T
0

T
0

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... 4
T
0

T
0

MỤC LỤC ............................................................................................................ 5
T
0

T
0

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 9
T
0

T
0

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................ 11
T
0

T
0

1.1.NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ............................................................................... 11
T
0

T
0

1.2.KHÁI QUÁT VỀ GIỐNG CLOSTRIDIUM ................................................. 11
T
0

T
0

1.2.1.Đặc điểm chung [4], [20] ........................................................................... 11
T
0

T
0

1.2.2.Các tác hại do Clostridium [4], [17] .......................................................... 12
T
0

T
0

1.3.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ............. 12

T
0

T
0

1.3.1.Lịch sử phát hiện [2], [10] ......................................................................... 12
T
0

T
0

1.3.2.Đặc điểm sinh học ...................................................................................... 13
T
0

T
0

1.3.2.1.Hình thái sinh tí tế bào [l1] [2] .......................................................... 13
T
0

T
0

1.3.2.2.Đặc điểm nuôi cấy [1]......................................................................... 13
T
0

T
0

1.3.2.3.Đặc điểm sinh hóa [8], [9] .................................................................. 14
T
0

T
0

1.3.2.4.Phân loại [10], [16]............................................................................. 14
T
0

T
0

1.4.NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C. PERERINGENS ..................................... 15
T
0

T
0

1.4.1. Nguyên nhân và triệu chứng ngộ độc thực phẩm do C. perfringens [5],
T
0

[9] ......................................................................................................................... 15

T
0

1.4.2.Độc tố đường ruột của C. perfringens [9], [11] ........................................ 16
T
0

T
0

1.4.3.Các chỉ tiêu về c. perfringens trong thực phẩm [4].................................. 17
T
0

T
0

1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG THỰC
T
0

PHẨM ...................................................................................................................... 19
T
0

5


1.5.1.Phương pháp nuôi cấy [4], [8] .................................................................. 19
T

0

T
0

1.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [6], [7] ......................... 20
T
0

T
0

1.5.4.So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp ........................................ 20
T
0

T
0

1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH
T
0

TRONG THỰC PHẨM ......................................................................................... 21
T
0

1.6.1.Nguyên tắc của kĩ thuật PCR [3], [4] ........................................................ 21
T
0

T
0

1.6.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR [3], [4] .................................... 22
T
0

T
0

1.6.3.Ưu và nhược điểm cua phương pháp PCR trong phát hiện vi sinh vật gây
T
0

bệnh trong thực phẩm ........................................................................................ 24
T
0

1.7.XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ ................... 25
T
0

T
0

1.7.1.Các khái niệm [13], [14] ............................................................................ 25
T
0

T
0

1.7.2.Các bước xác nhận hiệu lực [13], [14] ..................................................... 26
T
0

T
0

1.7.3.Các thông số kĩ thuật trong qui trình xác nhận hiệu lực phương pháp
T
0

định tính vi sinh vật ............................................................................................ 27
T
0

1.7.4.Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực .......................................................... 29
T
0

T
0

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 30
T
0

T

0

2.1.VẬT LIỆU ......................................................................................................... 30
T
0

T
0

2.1.1.Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 30
T
0

T
0

2.2.2.Hóa chất và môi trường ............................................................................. 30
T
0

T
0

2.1.2.1.Hoá chất .............................................................................................. 30
T
0

T
0

2.1.2.2.Môi trường .......................................................................................... 32
T
0

T
0

2.1.3.Nguyên vật liệu .......................................................................................... 33
T
0

T
0

2.2.PHƯƠNG PHÁP .............................................................................................. 34
T
0

T
0

2.2.1.Phương pháp thu và xử lí mẫu ................................................................. 34
T
0

T
0

2.2.2.Pha loãng mẫu ........................................................................................... 34
T

0

T
0

6


2.2.3.Đồng nhất mẫu .......................................................................................... 34
T
0

T
0

2.2.4.Xác định mẫu âm tính ............................................................................... 35
T
0

T
0

2.2.5.Định lượng Clostridium perfringens ........................................................ 35
T
0

T
0

2.2.6.Phương pháp phân lập và khẳng định C. perfringens từ các mâu thực

T
0

phẩm .................................................................................................................... 36
T
0

2.2.7.Phương pháp loại bỏ ôxi ra khỏi môi trường nuôi cấy............................ 37
T
0

T
0

2.2.8.Gây nhiễm C. perfringens lên mẫu thực phẩm ........................................ 38
T
0

T
0

2.2.9.Thu và xử lí khuôn DNA cho phản ứng PCR .......................................... 39
T
0

T
0

2.2.10.Điều kiện của phản ứng PCR ................................................................. 39
T

0

T
0

2.2.11.Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gelagarose ........................ 39
T
0

T
0

2.2.12.Khảo sát các điều kiện tối ưu của phản ứng PCR ................................. 39
T
0

T
0

2.2.13.Khảo sát thời gian tăng sinh tối thiểu phát hiện C. perfringens trong
T
0

mẫu thực phẩm ............................................................................................... 40
T
0

2.2.14.Xác định tính chuyên biệt của cặp mồi PL ............................................. 40
T
0

T
0

2.2.15.Khảo sát độ nhạy phát hiện C. perfringens bằng PCR .......................... 40
T
0

T
0

2.2.16.Xác định giới hạn phất hiện C. perfringens ........................................... 41
T
0

T
0

2.2.17.Xác định các thông số kĩ thuật tương đổi của phương pháp PCR so với
T
0

phương pháp nuôi cấy ........................................................................................ 41
T
0

2.2.18.Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện C. perfringens trong các mẫu
T
0

thực phẩm ............................................................................................................ 42
T
0

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................... 43
T
0

T
0

3.1.XÂY
T
0

ĐỰNG

QUY

TRÌNH

PHÁT

HIỆN

CLOSTRIDIUM

PERFRINGENS ..................................................................................................... 43
T
0

3.1.1.Tính chuyên biệt của cặp mồi phái hiện Clostridium perfringens bằng
T
0

phương pháp PCR .............................................................................................. 43
T
0

3.1.2.Khảo sát các điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR ................................... 44
T
0

T
0

7


3.1.2.1.Xác định nồng độ Mg2+ tối ưu ........................................................... 44
T
0

P

P

T
0

3.1.2.2.Xác định nồng độ mồi tối ưu ............................................................. 45
T
0

T
0

3.1.2.3.Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu ........................................................ 46
T
0

T
0

3.1.3.Thời gian tăng sinh cần thiết đề phát hiện C. perfringens trong thực
T
0

phẩm bằng phản ứng PCR ................................................................................. 47
T
0

3.1.4.Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện C. perfringens ......... 48
T
0

T
0

3.1.5.Quy trình PCR phát hiện C. perfringens trên mẫu thực phẩm ............... 49

T
0

T
0

3.2.XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ
T
0

PHÂN TÍCH C. PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM ............................... 52
T
0

3.2.1.Phân lập và định danh các chủng C. perfringens trong thực phẩm ....... 52
T
0

T
0

3.2.2.Giới hạn phát hiện của C. perfringens trên mẫu thực phẩm .................. 56
T
0

T
0

3.2.3.Xác định các thông số kĩ thuật tương đối của phương pháp PCR so với
T

0

phương pháp nuôi cấy ........................................................................................ 58
T
0

3.3.ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PGR ĐỂ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM C.
T
0

PERFRINGENS TRÊN MẪU THỰC TẾ ........................................................... 61
T
0

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 63
T
0

T
0

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 63
T
0

T
0

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 64
T

0

T
0

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 65
T
0

T
0

CÁC TÀI LIỆU TRONG NƯỚC ......................................................................... 65
T
0

T
0

CÁC TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI........................................................................... 65
T
0

T
0

8


MỞ ĐẦU

Trong nền kinh tế xã hội phát triển như hiện nay, đời sống vật chất và tinh thần
của người dân được nâng cao. Điều này kéo theo các yêu cầu về chất lượng và vệ sinh
thực phẩm cũng khắt khe hơn. Người tiêu dùng không chỉ đòi hỏi cao về chất lượng
dinh dưỡng, cảm quan của thực phẩm mà còn về mức độ an toàn vệ sinh của thực
phẩm đó. Tuy nhiên, thực tế cho thấy tình trạng ngộ độc thực phẩm trong những năm
gần đây lại xảy ra khá nhiều, chủ yếu là các vụ ngộ độc tập thể ở các công ty, xí
nghiệp, trường học, khu chế xuất., gây không ít hoang mang đối với người tiêu dùng.
Trong số các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, vi sinh vật thường chiếm tỉ lệ gây
ngộ độc cao nên việc kiểm nghiệm chúng trong thực phẩm rất được quan tâm. Vì vậy,
vấn đề cấp bách hiện nay là cần phải có các phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm
hữu hiệu hơn nhằm ngăn ngừa tình trạng ngộ độc hoặc có thể giảm các ca ngộ độc đến
mức thấp nhất. Ngoài ra cũng cần có các phương pháp xét nghiệm tìm nguyên nhân
gây ngộ độc để có biện pháp điều trị kịp thời.
Để đáp ứng các nhu cầu trên, nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhanh có thể tự
động hóa đang từng bước được phát triển và phổ biến rộng như: phương pháp phân
tích miễn dịch (ELISA, IMS...), phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò,
phương pháp phát hiện dựa ữên kĩ thuật phát quang sinh học [4]. Góp phần vào việc
nghiên cứu các quá trình phát hiện nhanh mầm bệnh vi sinh có trong thực phẩm,
Trung tâm Khoa học và Công nghệ cùng với Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã
tiến hành các quy trình khảo sát phát hiện E. coli, Salonella, Vibrio, Staphylococcus
aureuSy Shigella trong thực phẩm. Hiện nay, chúng tôi tiếp tục hướng nghiên cứu này
trong việc khảo sát quy trình phát hiện Clostridium perfringens gây bệnh trong thực
phẩm bằng phương pháp PCR.
Ngộ độc thực phẩm do C. perfringens gây ra tuy không nguy hiểm như ngộ độc
thịt nhưng lại xảy ra khá phổ biến, đặc biệt tại những nước phát triển như Mỹ, Phần
Lan. Tại Mỹ, C. perfringens là tác nhân thường xuyên gây ngộ độc thực phẩm và
được xếp vào hàng thứ ba sau Salmonella spp và Staphylococcus aureus. Tại Phần
Lan, số vụ ngộ độc do C. perfringens gây ra chiếm 20% trong tổng số ca ngộ độc
9

thống kê từ năm 1975 đến năm 1999 [12].
Các trường hợp ngộ độc do C. perfringens gây ra phần lớn có liên quan đến các
loại đồ hộp, là những sản phẩm tạo điều kiện kị khí và là môi trường thuận lợi cho vi
khuẩn này phát triển và sinh độc tố. Vì vậy, trong các chỉ tiêu vi sinh đối với thực
phẩm đóng chai, đóng hộp đều không cho phép sự hiện diện của loại vi khuẩn này.
Từ trước đến nay, ở nước ta việc phát hiện C. perfringens trong thực phẩm vẫn
thường dựa trên các phương pháp nuôi cấy vi sinh, sinh hóa truyền thống. Các phương
pháp này tuy có độ ổn định cao nhưng hạn chế về mặt thời gian, tốn công lao động
nên có thể làm tăng chi phí sản xuất, tồn đọng hàng hóa... Do những hạn chế đó, việc
phát hiện nhanh, nhạy và chính xác vi khuẩn này trong thực phẩm là hết sức cần thiết
và quan trọng.
Với sự phát triển nhanh chóng của các kĩ thuật sinh học phân tử nhiều phương
pháp phát hiện nhanh vi sinh vật trong thực phẩm đã được thiết lập. Các phương pháp
phân tích mới đều có xu hướng rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ nhạy, độ đặc
hiệu, giảm bớt công lao động, có thể thay thế phương pháp truyền thống trong việc
phát hiện và đánh giá mức độ an toàn vi sinh của thực phẩm. Tuy nhiên, những
phương pháp mới này vẫn còn một số nhược điểiĩí nhất định, chưa đạt được tất cả các
yêu cầu trên, vì thế chúng chưa đưf c phổ biến rộng rãi. Trong đó, phương pháp PCR
(Polymerase Chain Reaction) được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm nhất. Có rất
nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã và đang cố gắng thiết lập và hoàn thiệa qui
trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kĩ thuật PGR, nhưtig cho
đến nay những phương pháp này vẫn chưa được ứng dụng lịộng rãi và chưa được xem
như phương pháp chính thức sử dụng để xét Nghiệm C. perfringens trong hệ thống
phân tích đo lường. Để một phương pháp mới trở thành có giá trị và được sử dụng
rộng rãi thì phương pháp nậy cần được xác nhận hiệu lực.
Do đó, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện C.
perfringens trong thực phẩm bằng kĩ thuật PCR nhằm khắc phục hạn chế của phương
pháp tỊruyền thống đồng thời xác nhận hiệu lực sơ bộ phương pháp này tạo cơ sộ cho

bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để đưa phương pháp này trở thành phương pháp chính
thức cho việc xét nghiệm C. perfringens trong thực phẩm.
10


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
Ngộ độc thực phẩm là khái niệm chung để chỉ các triệu chứng gây ra do sử dụng
thực phẩm bị nhiễm khuẩn, virut, chất độc từ môi trường hoặc chất độc tự nhiên có
trong bản thân thực phẩm [15].
Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra ở nhiều người, gây ra những triệu chứng
giống nhau sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau tùy
thuộc vào khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người. Các
triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau
nhức người, sốt và đau đầu. Những triệu chứng này có thể thay đổi tùy vào tác nhân
gây ngộ độc là tế bào hay độc tố của vi khuẩn [4].

1.2.KHÁI QUÁT VỀ GIỐNG CLOSTRIDIUM
1.2.1.Đặc điểm chung [4], [20]
Giống Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử,
phân bố khắp mọi nơi trong tự nhiên như đất, rác, thực vật, trong đường ruột của
người và động vật. Các vi khuẩn này là loài kị khí không bắt buộc, không có
superoxide dismutase, peroxidase và catalase. Clostridium là các tác nhân gây ngộ độc
thực phẩm nguy hiểm ở người. Hai loài liên quan đến ngộ độc thực phẩm là
Clostridium perfringens nhóm A, là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường xuyên
hơn loài C. botulinum, là loài ít gây ra những vụ ngộ độc nhưng hậu quả nghiêm trọng
hơn [10].
Các chủng Clostridium đều có khả năng thủy giải saccharide và protein trong các
hoạt động thu lấy năng lượng. Những chủng có khả năng thủy giải saccharide có khả

năng lên men các loại đường tạo axit hữu cơ và rượu. Chủng có khả năng phân giải
protein sẽ chuyển hóa không hoàn toàn các axit amin tạo ra mùi khố chịu.
Clostridium thường được phân loại dựa vào hình dạng tế bào, vị trí bào tử và các
đặc điểm sinh lí như:
11


- Tế bào có dạng hình que thẳng hay hơi cong với hai đầu tròn, thon hay tù.
- Bào tử hình bầu dục, hình tròn, nằm ở giữa, cuối hay gần cuối tế bào.
- Chủng Clostridium thuộc nhóm ưa lạnh, ưa nhiệt vừa hoặc ưa nhiệt.
1.2.2.Các tác hại do Clostridium [4], [17]
Clostridium vừa là tác nhân gây hư hỏng thực phẩm vừa là tác nhân gây bệnh
cho người và động vật. Do phân bố rộng rãi cho nên vi khuẩn dễ xâm nhiễm vào thức
ăn và dễ gây ra ngộ độc. Các loại thức ăn đã nấu chín, thức ăn còn thừa khi ăn không
được đun lại, thức ăn nguội là nguyên nhân chủ yếu gây ra ngộ độc thực phẩm do
Clostridium.
Clostridium thường nhiễm vào các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng như thịt, sữa,
cá... làm cho thực phẩm có màu đen và gây ra mùi khó chịu. Ngoài ra, trong quá trình
tăng trưởng, vi khuẩn tạo và tiết ra độc tố gây độc cho người. Ví dụ, C. botulinum gây
ngộ độc thịt, C. perfringens gây hoại thư sinh hơi và nhiễm độc thực phẩm.
Hiện nay, Clostridium là nhóm vi khuẩn kị khí gây bệnh được nghiên cứu nhiều
nhất. Trong hầu hết các trường hợp, Clostridium đều là tác nhân gây bệnh cơ hội,
chúng thường gây bệnh khi đã có các vi khuẩn khác xâm nhiễm mở đường.

1.3.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
1.3.1.Lịch sử phát hiện [2], [10]
Vào cuối những năm 1890, hai nhà khoa học F.w Andrewes và E. Klein đã phát
hiện ra vi khuẩn Clostridium welchii (hiện nay được gọi là Clostridium perfringens)
trong thức ăn gây đau bụng và tiêu chảy nhẹ cho người.
Năm 1892 người ta phát hiện C. perfringens gây bệnh hoại thư sinh hơi, viêm

ruột và sốt hậu sản.
Năm 1933 nghiên cứu của Hobbs cho rằng ăn thực phẩm nhiễm C. perfringens
có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm.
Năm 1948 có nhiều trường hợp tử vong do viêm ruột và dạ dày xảy ra ở Đức có
liên quan đến C. perfringens nhóm C.
12


Cuối những năm 1960 và 1970 đã có đầy đủ thông tin để nhận định về ngộ độc
C. Perfringens.
1.3.2.Đặc điểm sinh học
1.3.2.1.Hình thái sinh tí tế bào [l1] [2]
C. perfringens là trực khuẩn Gram (+), có vỏ, sinh bào tử, không có tiên mao,
kích thước khoảng 0,8 – 1x4 - 8µm. (Hình 1)
C. perfringens thuộc loại vi khuẩn ôn nhiệt có nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 45°c. Ở nhiệt độ 45°c thời gian thế hệ (thời gian nhân đôi) là 7 - 9 phút. Do đó, C.
perfringens được xem là vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất trong các loài vi
sinh vật. Tuy nhiên, chúng không thể tăng trưởng trong môi trường có nồng độ muối
NaCl từ 6 - 8% hoặc nhiệt độ nuôi cấy thấp hơn 12°C.

1.3.2.2.Đặc điểm nuôi cấy [1]
C. perfringens là loài vi khuẩn kị khí nhưng không đòi hỏi điều kiện kị khí
nghiêm ngặt như các loài Clostridium khác. Vì vậy, một số chủng C. perfringens vẫn
có khả năng phát triển trong môi trường có ít ôxi. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37°C,
pH khoảng 6-7,5.
Khi được nuôi cấy trên môi trường rắn, C. perfringens tạo khuẩn lạc tròn, nhẩn
ướt. Trong môi trường thạch sâu, khuẩn lạc của C. perfringens có hình hơi ườn hoặc
bầu dục. Trong môi trường lỏng, trực khuẩn mọc nhanh làm đục đều môi trường và
sinh bọt khí. Trên môi trường thạch máu, xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu.
13

1.3.2.3.Đặc điểm sinh hóa [8], [9]
C. perfringens có khả năng lên men các loại đường như glucose, lactose,
saccharose, làm đông tụ sữa, làm tan gelatin do chúng sản sinh enzym gelatinase, tinh
bột và glycogen. Trong quá trình tăng trưởng trực khuẩn sinh khí H2S và các khí có
mùi hôi khác. Ngoài ra, C. perfringens còn có khả năng khử nitrate thành nitrite.
1.3.2.4.Phân loại [10], [16]
C. perfringens có khả năng tiết ra khoảng 20 loại độc tố, trong đó có 4 độc tố
chính là alpha, beta, epsilon, iota. Dựa vào các loại độc tố chính được tạo ra, người ta
xếp C. perfringens thành 5 nhóm là C. Perfringens nhóm A, B, c, D và E (Bảngl).
Trong đó, C. perfringens nhóm A hiện diện phổ biến nhất trong môi trường và là tác
nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm. C. perfringens nhóm C gây hoại tử ruột non.
Ngộ độc thực phẩm do C. perfringens nhóm C gây ra rất độc nhưng hiếm xảy ra. Ở
một số chủng C. perfringens, gen tạo độc tố nằm trên nhiễm sắc thể, một số chủng
khác gen này lại nằm trên plasmid của vi khuẩn. Gen plc tạo độc tố alpha
phospholipase c ở cả 5 nhóm C. perfringens đều nằm trên nhiễm sắc thể có trình tự
ATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGA
CATGTTAAGTTTGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAAT
AAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATGTTAA
AAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCT
AAAACTAGGGAAATCAATATACTATAGTCATGCTAGCAT.

Gen này mã hóa

cho một protein có 398 axit amin.
Gen mã hóa độc tố đường ruột (enterotoxin) của C. perfringens có thể nằm ữên
nhiễm sắc thể hay trên plasmid. Ở các chủng C. perfringens gây ngộ độc thực phẩm
cho người thì gen tạo độc tố đường ruột nằm trên nhiễm sắc thể, trong khi đó ở các
chủng C. perfringens gây bệnh ở động vật thì gen này lại nằm trên plasmid. Độc tố
đường ruột là một protein có 391 axit amin và được hình thành trong quá trình tạo bào

tử của vi khuẩn.

14


1.4.NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C. PERERINGENS
1.4.1. Nguyên nhân và triệu chứng ngộ độc thực phẩm do C. perfringens [5], [9]
C. perfringens còn có biệt danh là "vi khuẩn quán ăn" vì hầu hết các vụ ngộ độc
do vi khuẩn này gây ra thường liên quan đến thức ăn hàng quán, căn tin đã được chế
biến trước đó hàng giờ và không được bảo quản đúng cách. Vi khuẩn C. perfringens
có thể tồn tại dưới dạng tế bào sinh dưỡng hay bào tử. Khi thức ăn được đun chín, các
tế bào sinh dưỡng có thể chết đi nhưng bào tử của chúng vẫn còn sống sót. Khi nhiệt
độ trở nên thuận lợi, bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng tăng trưởng và tạo ra
độc tố gây ngộ độc.
Các trường hợp ngộ độc thực phẩm xảy ra đều do c. perýringens nhóm A, một
vài trường hợp đo C. perfringens nhóm c gây ra. Ngộ độc thực phẩm do C.
perfringens nhóm A được gây ra bởi độc tố đường ruột mà vi khuẩn này tiết ra trong
quá dinh hình thành bào tử ở màng ruột.
Bào tử của c. perfringens có thể nhiễm vào thịt tươi, rau sống. Việc đun nấu thức
ăn bình thường không diệt được bào tử của vi khuẩn. Khi thức ăn này được để nguội
một thời gian đủ dài trong điều kiện không được bảo quản lạnh, bào tử của vi khuẩn
bắt đầu tăng trưởng. Nếu thức ăn không được đun nóng lại trước khi ăn thì các tế bào
sinh dưỡng của C. perfringens sẽ theo thực phẩm vào ruột non, tạo độc tố và gây ngộ
15


độc.
Các triệu chứng do C. perfringens nhóm A gây ra thường là tiêu chảy, đau thắt
vùng bụng trong vòng 8-24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm khuẩn. ít có
trường hợp bị sốt, buồn nôn hay ói mửa. Bệnh thường chấm dứt sau 2-3 ngày và

không gây tử vong.
C. perfringens nhóm c gây ra triệu chứng của bênh ở một non như! nôn mửa,
đau bụng và tiêu chảy ra máu. Khi mật độ vi khuẩn lên đến l06 tế bào/g thực phẩm,
P

P

bệnh thường dẫn đến tử vong do hậu quả của triệu chứng viêm ruột và nhiễm trùng
máu. Độc tố đường ruột của C. perfringens được hoạt hóa nhanh trong ruột gây ra
hiện tượng hoại thư sinh hơi gây mất nước trong ruột non. Độc tố tác động lên tế bào
biểu mô gây đau bụng cấp tính và nôn mửa trong 8-16 giờ.
1.4.2.Độc tố đường ruột của C. perfringens [9], [11]
Độc tố đường ruột của C. perfringens (CPE - C. perfringens enterotoxin) rít
nhạy với nhiệt độ và pH nên dễ bị phân hủy ở nhiệt độ 60°C trong vòng 5 phút hay bị
mất hoạt tính do pH thấp ở dạ dày. Tuy nhiên, độc tố này lại được tạo ra nhanh chóng
ồ ruột non nhờ môi trường pH thuận lợi. Độc tố đường ruột được vi khuẩn C.
perfringens tiết ra sau khi bào tử được hình thành 10-12 giờ.
Về mặt cấu trúc phân tử, CPE là một polypeptid mạch đơn có trọng lượng phân
tử gần bằng 3,5kDa, bao gồm 319 axit amin có điểm đẳng điện là 4,3. Độc tố được
chia làm 3 vùng (Hình 2):
- Đầu C: có nhiệm vụ gắn kết vào các thụ thể trên màng tế bào.
- Vùng giữa: mang độc tính.
- Đầu N: vẫn chưa rõ hoạt tính.

16


Sau khi được tạo ra ở ruột non, đầu C của độc tố sẽ gắn vào các thụ thể protein
trên màng tế bào ruột và tạo thành một phức hợp giữ chặt CPE trên bề mặt màng tế
bào. Phức hợp này sẽ thay đổi cấu hình liên kết với một protein màng khác có trọng

lượng 70 kDa tạo thành phức hợp lớn kị nước. Phức hợp lớn hình thành các cấu trúc
lỗ màng làm gia tăng tính thấm của màng. Điều này dẫn đến hậu quả là các phân tử
nhỏ trong tế bào chất bị thoát ra ngoài gây gián đoạn nhanh chóng quá trình trao đổi
chất bên trong tế bào. Mặt khác, do sự mất cân bằng trong tính thấm của tế bào, nước
vào trong tế bào nhiều hơn gây ra hiện tượng vỡ tế bào (Hình 3).

1.4.3.Các chỉ tiêu về c. perfringens trong thực phẩm [4]
Giới hạn cho phép của C. perfringens trong thực phẩm được qui định bởi Bộ Y
tế (Bảng 2). Bảng này cho thấy, việc cho phép sự hiện diện của vi khuẩn C.
17


perfringens trong một số mặt hàng thực phẩm là rất thấp và thậm chí không cho phép
sự hiện diện của vi khuẩn này.
Bảng 2. Tiêu chuẩn C. perfringens cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998

18


1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG
THỰC PHẨM
1.5.1.Phương pháp nuôi cấy [4], [8]
Các phương pháp nuôi cấy truyền thống để xét nghiệm C. perfringens được xây
dựng dựa trên những đặc điểm về vi sinh, sinh hóa của vi khuẩn và gồm một số bước
như sau:
- Nuôi cấy và phân lập
Mẫu thực phẩm được đồng nhất và dịch đồng nhất được pha loãng đến nồng độ
thích hợp. cấy 0,1 ml dịch pha loãng vào môi trường thạch sâu Iron Sulfite Agar (ISA)
(hay trải, ria trên đĩa petri). Đổ thêm lên bề mặt một lớp môi trường ISA. Ủ kị khí ở
37°C trong 24 giờ. Trên môi trường ISA, khuẩn lạc đặc trưng của C. perfringens s sẽ

có màu đen, hình tròn. Tuy nhiên, một số chủng Clostrdium khác cũng tạo khuẩn lạc
có đặc điểm tương tự nên cần phải qua bước khẳng định sinh hóa.
- Kiểm tra khẳng định sơ bộ
Cấy một khuẩn lạc đặc trưng của C. perfringens trên môi trường ISA sang môi
trường thioglycolate broth. Ủ ở 37°C trong 24 giờ, sau đó tiến hành nhuộm gram và
quan sát hình thái tế bào dưới lánh hiển vi.
Chuyển 1ml dịch nuôi cấy từ môi trường thioglycolate broth sang môi trường
iron-milk ở 46°C. Sau 2 giờ cấy, cứ cách mỗi giờ kiểm tra sự lên men ữong môi
trường.
- Kiểm tra khẳng định: thử phản ứng sinh hóa trên các môi trường motilitynitrate và lactose-gelatin, thử hoạt tính catalase và khả năng di động để có kết luận
cuối cùng là C. perfringens. Đây là trực khuẩn Gram dương, không di động, tạo khuẩn
lạc màu đen trên môi trường ISA, khử nitrate thành nitrite, cho thử nghiệm catalase
âm tính, lên men lactose sinh axit và hơi, làm tan gelatin.
Có thể sử dụng cơ chất MÚP (Methylumbelliferylphosphate) để bổ sung thêm
vào môi trường ISA trong bước nuôi cấy phân lập để khẳng định C. perfringens mà
không cần qua bước khẳng định sinh hóa. MUP là cơ chất của phosphatase là chất chỉ
19


thị đác trưng đối với C. perfringens. Phosphatase sẽ phân cắt MUP tạo thành 4
methylumbelliferone và chất này sẽ phát huỳnh quang dưới đèn UV.
1.5.2.Phương pháp ELISA (Enzyme - Linkeđ Immunosorbent Assay) [18,19]
Phương pháp ELISA cho phép phát hiện được 5 độc tố quan trọng của C.
perfringens là alpha, beta, epsilon, iota và độc tố đường ruột. Nguyên tắc của phương
pháp là sử dụng một kháng thể đơn dòng liên kết đặc trưng Với độc tố của tế bào vi
khuẩn.
1.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [6], [7]
Việc phát hiện C. perfringens trong thực phẩm thường tập trung vào phát hiện
gen tạo độc tố đường ruột vì đây là tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm.
Năm 1997, Patrick Fach và Michel R. Popoff đã thành công trong việc phát hiện

vi khuẩn C. perfringens tạo độc tố đường ruột trong thực phẩm bằng kĩ thuật PCR.
'Trong phần nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng đồng thời hai cặp mồi (PL3, PL7) và
(P145, P146) để phát hiện sự hiện diện của hai gen pỉc mã hóa cho độc tố alpha
phospholipase C và gen cpe mã hóa cho độc tố đường ruột. Cả hai gen này đều nằm
trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn C. Perfringens.
1.5.4.So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp
Phương pháp truyền thống phát hiện C. perfringens trong thực phẩm gặp nhiều
giới hạn về thời gian, cần 3-5 ngày.
Phương pháp ELISA thường cho kết quả nhanh và độ nhạy cao trong các trường
hợp xét nghiệm độc tố đã có sấn trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, hạn chế của
phương pháp này là đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các
protein ữong thực phẩm. Mặt khác, mẫu cần nguyên vẹn, không bị biến tính để tránh
trường hợp cho kết quả âm tính giả. Trong phương pháp này, mẫu cần được tăng sinh
trong môi trường và điều kiện đặc biệt để chủng hình thành bào tử và tạo độc tố. Điều
này làm giảm hiệu quả sử dụng của phương pháp.
Trong khi đó, các phương pháp phát hiện C. perfringens dựa trên kĩ thuật sinh
học phân tử thường có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Mặc dù các phương pháp này vẫn
đòi hỏi bước tăng sinh để tăng mật độ tế bào của vi khuẩn nhưhg phương pháp này
20


không cần đến giai đoạn tạo độc tố. Do đó, thời gian thực hiện của phương pháp này
ngắn hơn các phương pháp khác. Ngoài ra, phương pháp này không đòi hỏi độ tinh
sạch của mẫu cao. Vì thế, hiện nay các kĩ thuật sinh học phân tử đặc biệt là kĩ thuật
PCR đang được khuyến khích sử đụng rộng rãi trong việc phát hiện C. perfringens
trong thực phẩm.

1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH
TRONG THỰC PHẨM
1.6.1.Nguyên tắc của kĩ thuật PCR [3], [4]

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp
DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích ĐNA ban đầu. Phương pháp này cho phép
nhân số lượng bản sao của khuôn thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của DNA
polymerase và một cặp mồi đặc hiệu. Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rộng rãi để
phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm.
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy
định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động
của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự
bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở
hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase
trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân
lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium
bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin
tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo
cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi
ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR nhân bản sao DNA là một chuỗi gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau,
mỗi chu kì gồm 3 bước (Hình 4).
21


- Bước 1: (biến tính, denaturation): được thực hiện ở nhiệt độ cao để hai mạch
của DNA bị biến tính và tách thành mạch đơn. Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn T m của phân tử, thông thường là ở 94 - 95°C trong vòng 30 - 60 giây.
R

R

- Bước 2: (lai, anealation): các cặp mồi bắt cặp vào khuôn. Trong bước này, nhiệt
độ được hạ thấp hơn T m của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn.
R

R

Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70°C tùy thuộc vào T m
R

R

của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây.
- Bước 3: (tổng hợp, elongation): ĐNA polymerase xúc tác việc tổng hợp DNA
bằng cách hình thành mạch mới bổ sung với mạch khuôn. Ở bước này, nhiệt độ được
tăng đến 72°c giúp cho DNA polymerase tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này
tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến
nhiều phút.
Trong phản ứng PCR, một chu kì gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều
lần. Mỗi chu kỳ làm táng gấp đôi số lượng bản sao. Đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân. Sau 30 - 40 chu kì, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng l06 bản sao.
P

P

Sau phản ứng PCR, mẫu được điện di trong gel agarose và được nhuộm bằng
ethidium bromide. Vạch DNA mục tiêu được phát hiện bằng cách soi dưới tia UV ở
bước sóng 312nm.
1.6.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR [3], [4]

- DNA bản mẫu
22


Phản ứng PCR không đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu, có thể thực hiện trên DNA
không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần. Mặc dù vậy, để đạt được kết quả
tối ưu, cần sử dụng DNA bản mẫu có độ tinh sạch cao. Ngoài ra, nồng độ DNA sử
dụng ương mỗi phản ứng thường rất thấp để tránh tình trạng nhân bản sao không
chuyên biệt (khuếch đại kí sinh).
- DNA polymerase
Đây là enzym có vai trò trong việc kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ
mồi ban đầu. Do phải hoạt động trong giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao nên yêu cầu
trước tiên đối với enzym là phải chịu được nhiệt độ. Hiện nay, có rất nhiều loại DNA
polymerase được sử dụng rộng rãi trên thị trường nhưng việc sử dụng loại enzym nào,
với nồng độ bao nhiêu sẽ tùy thuộc vào yêu cầu của từng phản ứng và hoạt tính của
enzym đó. DNA polymerase thường được dùng nhất là Taq DNA polymerase. Enzym
này được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus và có khả năng chịu được nhiệt độ
cao.
- Mồi và nhiệt độ bắt cặp của mồi
Đối với phương pháp PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
Do đó, cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không
trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự nucleotide của mồi được lựa chọn sao
cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược cũng như không có sự tự bắt cặp
bên trong bản thân mồi, hình thành các cấu trúc kẹp tóc. Thành phần các nucleotide
trong mồi phải cân bằng nhau. Nhiệt độ bắt cặp (T m ) giữa 2 mồi không quá chênh
R

R

lệch. Ngoài ra, kích thước của các mồi không quá lớn, thường vào khoảng 20 - 30

base.
- Các thành phần khác
+ dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate): là một hỗn hợp gồm 4 loại
nucleotide dATP, dGTP, đCTP và dTTP. dNTP cung cấp năng lượng cho phản ứng
PCR nhờ các nối phosphate giàu năng lượng và được gắn vào đầu 3'- OH của
nucleotide trong mồi bằng liên kết phosphodiester. Nồng độ dNTP sử dụng tùy thuộc
vào điều kiện phản ứng chung nhưng nếu sử dụng ở nồng độ cao dễ dẫn đến hiện
23


tượng khuếch đại kí sinh.
+ Dung dịch đệm và MgCl 2
R

Dung dịch đệm thường đi kèm với Taq DNA polymerase, tạo sự ổn định hoạt
động của enzym.
Ion Mg2+ cũng là một trong những thành phần ảnh hưởng tới kết quả phản ứng
P

P

PCR. ở một nồng độ tối ưu, lon này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu
và tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5mM) sẽ
P

P

làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức
chế.
+ Số lượng chu kì phản ứng: sau một số chu kì nhất định, các thành phần ương

phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản
ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà tự bắt cặp với nhau,
dẫn đến tình trạng hiệu quả khuếch đại giảm. Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực
hiện phản ứng không quá 40 chu kì.
+ Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng: để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa
các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ. Đồng thời, để tránh
các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả các dụng cụ mới cho phản ứng PCR.
1.6.3.Ưu và nhược điểm cua phương pháp PCR trong phát hiện vi sinh vật gây
bệnh trong thực phẩm
So với các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm khác, phương
pháp PCR có một số ưu điểm như:
- Thời gian cho kết quả nhanh
- Có thể phát hiện được các vi sinh vật khó nuôi cấy
- Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn trường hợp huyết
thanh học, không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát
hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
- Cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của vi sinh vật
24


gây bệnh hoặc gây ngộ độc.
Mặc dù vậy, phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm như:
- Hoạt tính của Taq DNA polymerase có thể bị ức chế bởi thành phần phức tạp
của mẫu thực phẩm.
- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên
đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh làm giàu để có được mật độ vi sinh
vật đủ để phát hiện bằng phương pháp PCR.
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có
thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.

1.7.XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ
1.7.1.Các khái niệm [13], [14]
- Xác nhận hiệu lực (validation )
Xác nhận hiệu lực của một phương pháp thay thế là quá trình thực nghiệm, tiến
hành so sánh, thống kê, tính toán các thông số dựa trên dữ liệu kết quả thu được từ
phương pháp thay thế và kết quả thu được từ phương pháp tham chiếu cho cùng một
mục đích sử dụng. Từ đó chứng minh kết quả phân tích nhận được từ một phương
pháp thay thế tương đương hay vượt trội so với kết quả nhận được từ phương pháp
tham chiếu.
- Phương pháp thay thế (alternative method)
Phương pháp thay thế là phương pháp mới hay phương pháp cải tiến từ phương
pháp tham chiếu. Đây cổ thể là phương pháp phát hiện, phân tích hay đo lường các đối
tượng phân tích.
- Phương pháp tham chiếu (reference method)
Phương pháp tham chiếu là phương pháp phân tích hay đo lường được các tổ
chức có thẩm quyền của quốc gia hay quốc tế công nhận. Do đó, phương pháp tham
chiếu có giá trị về mặt pháp lí và được sử dụng rộng rãi bởi nhiều phòng thí nghiệm
khác nhau trên phạm vi quốc tế.
25