Sinh hóa miễn dịch chương 7

CHƯƠNG 7
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
DỰA TRÊN MIỄN DỊCH
Trong những năm gần ñây, có nhiều xét nghiệm ñặc hiệu và rất nhạy dựa
trên kỹ thuật hoá - miễn dịch ñã ñược ñưa vào trong xét nghiệm y khoa với mục
ñích chẩn ñoán ñể có hướng ñiều trị thích hợp, triển khai vacxin ñể phòng bệnh
kịp thời, triển khai các biện pháp vệ sinh - dịch tế học ñể ngăn ngừa lây lan của
mần bệnh. Nguyên lý của chúng ñược dựa trên các phản ứng kháng nguyên kháng thể. Áp dụng nguyên lý này ñể xác ñịnh ñộc tố trong thực phẩm ñã ñược
thực hiện trong khoảng 20 năm trở lại ñây. Hai nguyên nhân thúc ñẩy áp dụng
rông rãi phương pháp này là việc sản xuất ñược kháng thể ñơn dòng và việc phát
triển của phương pháp ELISA. Việc phát triển ñược phương pháp ELISA ñã góp
phần quan trọng ñưa phương pháp phân tích dựa trên miễn dịch học vào ứng
dụng rộng rãi.
7.1. Phản ứng kháng nguyên và kháng thể

Kháng nguyên và kháng thể ñặc hiệu của nó có chứa cấu trúc tương ứng bổ
sung, chính vì thế nó làm cho phần quyết ñịnh kháng nguyên khớp rất khít với vị
trí gắn trên kháng thể. Tại ñó chứng ñược nối với nhau bằng những liên kết yếu
giữa các phân tử.
7.1.1. Phản ứng thuận nghịch và hằng số cân bằng


Một vị trí của kháng thể chỉ kết hợp với môt epitop kháng nguyên, phản
ứng kháng nguyên kháng thể là phản ứng thuật nghịch và có thể biểu diễn như
sau:.
k1

KN + KT

KN - KT
k2

Trong ñó: k1 là hằng số cân bằng phản ứng thuận.
k2 là hằng số cân bằng phản ứng nghịch.
Hằng số cân bằng ñược biểu diễn như sau
K=

k
[ KN − KT ]
= 1
[KN ][KT ] k 2

Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra dưới tác dụng của nhiều
liên kết (Hình 7.1.)
- Liên kết hydro.
- liên kết tĩnh ñiện.
- Liên kết Van der wals (liên kết giữa các ñám mây ñiẹn từ).
- Liên kết kỵ nước.

-

Hình 7.1: Lực hút giữa kháng nguyên - kháng thể


Nhận biết phản ứng KN-KT thông qua các phản ứng sau ñây
- Phản ứng kết tủa.
-

Phản ứng ngưng kết.

- Cố ñịnh bố thể .

- Phản ứng phát huỳnh quang.
- Phản ứng gắn enzyme.
7.1.2. Phản ứng kết tủa
Khi kháng thể ñặc hiệu phảm ứng với kháng nguyên hoà tan ở một nồng ñộ
nhất ñịnh sẽ xuất hiện kết tủa nhìn thấy bằng mắt thường. Phản ứng này dùng ñể
phát hiện kháng nguyên hòa tan khi có kháng thể ñặc hiệu, hoặc ñể phát hiện kháng
thể khi có kháng nguyên hòa tan ñặc hiệu
Phản ứng tối ưu khi ñủ và tương ñồng về nồng ñộ kháng nguyên , kháng
thể (hinh 7.2)
6.2.3. 6.66.3. Phản ứng ngưng kết.
PP +P6'

'
Hình 7.2:. ðồ thị biểu diễn mức kết tủa phụ thuộc vào tỷ lệ KT-KN
KhikKk
Khi tỷ lệ tương ñồng sẽ tạo màng lưới tốt nhất, nếu thừa kháng thế
epitop kháng nguyên bão hoà nhưng không liên kết chéo ñược ñược với


nhau thông qua gắn vị trí kết hợp kháng nguyên. Nếu thừa kháng nguyên
paratop kháng thể bão hoà, nhưng không kết hợp ñược với nhau thông qua
epitop.
7.1.3. Phản ứng ngưng kết
ðiều kiện xảy ra phản ứng là phải có kháng nguyên hữu hình ñó là
những kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu, vi sinh vật.
Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các
kháng thể, tạo thành cụm và nhìn ñược bằng mắt thường.
Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên ñược dùng ñể
ñịnh tính và bán ñịnh lượng kháng thể trong huyết thanh.
Cách tiến hành phản ứng ngưng kết.

- Pha loãng kháng thể có ñộ pha loãng : 1/20; 1/40; 1/80.
- Cho kháng nguyên hữu hình vào các ống nghiệm chứa kháng thể trên.
- Hiệu giá kháng thể là ñộ pha loãng cao nhất mà vẫn xảy ra ngưng kết Ví
dụ trong ống thứ 3 có ñộ pha loãng cao nhất nhưng vẫn phát hiện ñược
phản ứng ngưng kết ta nói hiệu giá của hyết thanh là 80.
7.1.4. Phản ứng kết hợp bố thể
Về nguyên tắc kháng nguyên hoà tan có phản ứng với kháng thể do ñó
sẽ cố ñịnh bố thể. Còn ngược lại sẽ có bố thể tự do. Khi hệ thống chỉ thị của
các hồng càu nhậy cảm như hồng cầu cừu (SRBC) ñược thêm vào, mức ñộ
phân huỷ hồng cầu nhậy cảm (tan hồng cầu nhậy cảm) sẽ tỷ lệ với bố thể tự do.
Dưạ vào kết quả xét nghiệm ta kết luận là mẫu âm tính hoăc dương tính.
Bước 1:Chuẩn bị hai hệ thống (hinh 7.3):
- Hệ thống xét nghiệm bao gồm: Kháng nguyên, kháng thể.
- Hệ thống chỉ thị gồm: Hông cầu cừu và kháng thể kháng hồng cầu cừu.
- Bố thể


Hệ thống chỉ thị

Hê thống xét nghiệm

Hång cÇu
cõu(SRBC)

Bæ thÓ

Kh¸ng thÓ

Kh¸ng thÓ khángSRBC
Kh¸ng

nguyªn
Hình 7.4: Hệ thống xét nghiệm và hệ thống chỉ thi
Bước 2: Bổ sung bố thể vào hệ thống xét nghiệm (hình 7.5)
a) Kháng nguyên không ñặc hiệu với kháng thể có bố thể tự do
b)Kháng nguyên ñặc hiệu với kháng thể không có bố thể tự do (bố thể cố
ñịnh)

Kh¸ng
thÓ

Kh¸ng
thÓ

Kh¸ng
nguyªn
a

Kh¸ng
nguyªn
b

Hình 7.5: Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có bổ sung bố thể


Bước 3: Bổ sung hệ thống chỉ thi.
a) Bố thể tự do có phản ứng với chỉ thị (tạo phức kháng thể hồng cầu
cừu- kháng nguyên kháng hồng cầu cừu- bố thể) (hình 7.6a)
b) Bố thể cố ñịnh không có phản ứng với chỉ thị (do tạo phức hệ KNKT-BT) ( 7.6 b)

KT

HCC

KT, K HCC
KN

a

b

Hình 7.6: Bổ sung hệ thống chỉ thị
Bước 4: Kết quả xét nghiệm.
a) Ân tính: do không có kháng thể cần xét nghiệm, nên không có phức KNKT-BT. Do ñó bố thể tự do kết hợp với hồng cầu nhạy cảm và xảy ra hiện
tượng tan máu (hình 7.7a).
b) Dương tính: Có kháng thể cần xét nghiệm, nên tồn tại phức KN-KT-BT.
Do ñó bố thể cố ñịnh sẽ không có sự kết hợp với hồng cầu nhạy cảm, kết quả
là không có hiện tượng tan máu (hình 7.7b).


a

b

Hình 7.7: Kết quả xét nghiệm
Ứng dụng của phương pháp:
Phương pháp này ñược ứng dụng rộng rãi trong sàng lọc lâm sàng.
ðặc biệt là trong phép thử ñối với xoán khuẩn trong bênh giang mai.
7.1.5. Các yếu tố ảnh hưởn ñến phản ứng kháng nguyên kháng thể
- Ảnh hưởng của kích thước, nồng ñộ của kháng thể.
- Ảnh hưởng của lực ñẩy giữa các kháng nguyên.

- Tác dụng của enzyme.
- Tác dụng của các chất keo.
- Ảnh hưởng ñặc tính kháng nguyên.
- Ảnh hưởng của pH, nhiệt ñộ, thời gian phản ứng.
7.2. Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch
7.2.1. Cơ sở của phương pháp
Trong kỹ thuật này kháng thể hoặc kháng nguyên ñược ñánh dấu bằng
thuốc nhuộm huỳnh quang.
Về nguyên tắc: kỹ thuật ñược dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi
ñược kích thích bởi bức xạ có bước sóng thích hợp sẽ phát sáng:
- Fluorescein phát quang màu vàng lục.
- Rodamin phát quang cho màu ñỏ da cam.


Kháng thể có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là gọi là kháng thể
huỳnh quang hay kháng thể ñánh dấu
7.2.2. Hai phương pháp kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch
Phương pháp huỳnh quang MD trực tiếp (hình 7.8)
Mục ñích của phương pháp: Xác ñịnh vi sinh vật gây bệnh trên bênh phẩm,
Ví dụ như xác ñịnh Streptococcus pyrogenes từ họng bệnh nhân
Các bước tiến hành
- Cố ñịnh tiêu bản trên phiến kính
- Phủ kháng thể huỳnh quang kháng thể lên
- Cho kháng thể huỳnh quang gắn với tế bào
- Rửa loại kháng thể không gắn với tế bào
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, chỉ có vi khuẩn gắn ñặc hiệu
với kháng thể huỳnh quang mới phát sáng và quan sát ñược
Phương pháp huỳnh quang MD gián tiếp
Mục ñích
Phương pháp này thường dùng xác ñịnh kháng thể trong thể dịch của

bệnh nhân. Ví dụ xác ñịnh IgG kháng spirochet có trong huyết thanh hoặc nước
bọt bệnh nhân viêm lợi. Phương pháp này nhạy hơn phương pháp trực tiếp.
Các bước tiến hành.
- Cố ñịnh tiêu bản (kháng nguyên) trên phiến kính.
- Cho kháng thể huyết thanh bệnh nhân phản ứng với kháng nguyên (vi
khuẩn gây bệnh).
- Cho kháng thể có ñánh dấu huỳnh quang ñể kháng thể phản ứng ñặc
hiệu với phức hợp kháng nguyên-kháng thể.
- Rửa những phần không phản ứng ñặc hiệu giữa kháng thể huỳnh quang
với phức hợp kháng nguyên- kháng thể.
- Soi ñọc kết quả bằng ñèn huỳnh quang (ñèn UV).


Hình 6.8. Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch trực tiếp

Mô phỏng phương pháp huỳnh quang gián tiếp
Bước 1:Cố ñịnh tiêu bản trên phiến kính.

Bước 2: Tráng kính vơí kháng thể ñặc hiệu ñể tạo phức hợp KN-KT.


Bước 3:Tráng kháng thể ñặc hiệu với kháng thể có gắn với thuốc nhuộm
huỳnh quang.

Bước 4:Soi ñọc kết quả bằng ñèn hyùnh quang (ñèn UV).
7.3. Thí nghiệm miễn dịch phóng xạ
Nguyên tắc:
Về nguyên tắc tương tự như huỳnh quang miễn dịch, nhưng khác là
kháng nguyên hoặc kháng thể ñựơc ñánh dấu bằng chất phóng xạ (126I ). Thí
nghiệm này do Rosalyn Yalow ñề nghị năm 1960 ñể xác ñịnh nồng ñộ insulin

trong huyết tương. Nhờ phát minh này mà bà ñã nhận giải thưởng Noben năm
1977. Ngày nay phương pháp này ñược sử dung ñể xác ñịnh hoocmon,
globulin miễn dịch, kháng nguyên của virus
Các bước tiến hành.
- Lấy một lượng chính xác kháng nguyên có ñánh dấu bằng chất phóng xạ
(ví dụ 126I )
- Cho lượng kháng nguyên ñánh dấu nói trên tác dụng ñặc hiệu với lượng
kháng thể vừa ñủ.
- Rửa sạch kháng ngyuyên ñánh dấu không bắt cặp với kháng thể.
- ðo ñộ phóng xạ của phức chất kháng nguyên ñánh dấu - kháng thể (A)
- Cũng thí nghiệm như trên nhưng ở ñây ta thêm một lượng kháng nguyên
huyết thanh có những ñặc tính tương tự như kháng nguyên ñánh dấu. Do
cạnh tranh mà kháng nguyên này kết hợp ñặc hiệu với kháng thể, sau ñó
lượng kháng thể dư mới kết hợp với kháng nguyên ñánh dấu.
- Rửa những kháng nguyên ñánh dấu không bắt cặp với kháng thể
- ðo ñộ phóng xạ của phức kháng nguyên ñánh dấu với kháng thể còn lại
(B)


- Từ giá trị A&B ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên huyết thanh cần
nghiên cứu.
7.4. Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA - Enzyme Linker Immunosorbent Assay)
Những xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme là kỹ thuật khá nhạy và
ñơn giản, cho phép xác ñịnh kháng nguyên hoặc kháng thểầm có nồng ñộ rất
thấp (khoảng 0,1 mg/ml). So với phương pháp miễn dịch phóng xạ thì phương
pháp này ñơn giản rẻ tiền an toàn mà vẫn ñảm bảo ñộ chính xác. Các xét
nghiệm ñược tiến hành trên bản nhựa polystyren có 96 giếng ñáy bằng, thể tích
mỗi giếng khoảng 200 µl.
Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA:
Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là tạo liên kết ñặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể.
Sự liên kết ñó cho phép xác ñịnh sự có mặt của kháng thể hoặc kháng
nguyên. Người ta sử dụng kháng thể gắn cộng hợp enzym sau ñó bổ sung cơ
chất, enzym thủy phân cơ chất tạo thành chất làm thay ñổi màu dung dịch. Tùy
thuộc vào cường ñộ màu dung dịch ta suy ra nồng ñộ kháng nguyên hoặc
kháng thể cần nghiêm cứu.
Các enzyme thường dùng là: (galactosidase; glucoxydase; akanline
phosphotasen,...)
Ngoài ra ñể tăng ñộ nhạy của phương pháp người ta sử dụng hệ thống công
hợp biotin -avidin, biotin -sprept.
Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - avadin.
Biotin ( vitaminH) ñược tổng hợp từ sinh vật hoặc thực vật có trọng lượng
phân tử khoảng 244Da . Biotin có ái lực với avidin (là chất có nhiều trong lòng
trắng trứng). Avidin có 4 vị trí trên phân tử liên kết với biotin, và như thế
biotin dễ dàng kết hợp với protein: kháng thể, enzyme và các loại kháng
nguyên khác. Phương pháp này nó sẽ nâng cao ñộ nhạy của xét nghiệm ñặc
biệt là các xét nghiệm miễn dịch mà kháng nguyên ở trong pha rắn.
Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept.
Người ta cũng tìm thấy chất hoạt tính tương tự như avidin từ xạ khuẩn và
như vậy ta có hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept trong xét nghiệm


miễn dịch. Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept (avidin) dùng trong xét
nghiệm miễn dịch ñặc biệt. vai trò của avidin và strept avidin có thể thay ñổi
cho nhau. Ngày nay bộ kít này ñã ñược chế tạo từ các hãng nổi tiếng trên thế
giới..
Các kháng nguyên hoặc kháng thể cần xác ñịnh ñược hấp phụ trực tiếp hoặc
gián tiếp lên bề mặt của giếng nhựa. Sau ñó mặt phẳng của giếng ñược bao phủ
bằng một loại ñệm chứa protein, thường là gelatin hoặc BSA ñể ngăn ngừa sự
liên kết không ñặc hiệu ñối với bản nhựa.

Có nhiều kỹ thuật ELISA , dưói ñây sẽ trình bày kỹ thuật ELI AE tóm bắt
kháng ngyuên và ELISE cạnh tranh (hình 7.9).

Hình 7.9: Kỹ thuật ELI SA
7.5.1. Phương pháp ELI SA tóm bắt khánh nguyên (bánh kẹp)
Phương pháp này dùng ñể xác ñịnh những chất có phân tử lượng lớn. về
nguyên tác kháng thể gắn lên chất mang (thành giếng). Người ta bổ sung
KN, kháng thể thứ 2 ñể KT2 kết hợp với KN (cần phân tích) ở dạng bánh
kẹp. Sau ñó rửa trôi phần không bắt cặp và bổ sung kháng thể cộng hợp


enzyme, cơ chất. Enzyme chuyển cơ chất thành hợp chất màu ñược xác ñịnh
bằng phổ kế. Từ nồng ñộ chất màu ta tính ñược nồng ñộ chất cần phân tích.
Bước 1: Nhỏ KT1 vào giếng ñể cho KT1 bám vào thành giếng (antitoxin).

KT1

Bước 2: Che bản bằng protein

Protein

Bước 3: Nhỏ kháng nguyên ñặc hiệu (toxin) ñể KN bắt cặp với KT1

Kháng nguyên


Bước 4: Bổ sung KT2 ñể tạo phức hợp KT1-KN-KT2

KT2

Bước 5: sung kháng thể cộng hợp enzym ñể enzym ( KT.E) ñể lạo phúc
hợp KT1-KN-KT2- KT .E.

KH-E

Bước 6: Bổ sung cơ chât ñể enzym thủy phân cơ chất tạo thành chất màu


-

Cơ chất

Bước 7: Enzym chuyển cơ chất thành hợp chất màu xanh

Cơ chất

Màu của dung dịch có thể phát hiện bằng mắt hoặc phổ kế, từ mật ñộ quang
ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên ( nồng ñộ ñộc tố).
7.4.2. Phương pháp ELISA cạnh tranh
Nguyên tắc:
Cộng hợp kháng nguyên và protein (hepten) ñược cố ñịnh trên bề mặt
chất rắn. Cho một lượng kháng nguyên tự do và kháng thể cộng hợp enzyme
vào. Kháng nguyên cố ñịnh và kháng nguyên tự do cạnh tranh nhau bám vào


kháng thể. Lượng kháng nguyên tự do càng nhiều thì kháng thể bị kháng
nguyên cố ñịnh giữ lại càng ít. Sau khi rửa trôi các chất còn dư, bổ sung cơ
chất ñể enzyme phân huỷ thành các hợp chất màu. Màu của dung dịch có thể
phát hiện bằng phổ kế, từ mật ñộ quang A1, A2 của mẫu chứng và mẫu
nghiên cứu ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên (nồng ñộ ñộc tố) theo

công thức
C=

A1 − A2
.100;%
A1

Trong ñó: A1 là mật ñộ quang của mẫu chứng.
A2 Mật ñộ quang của mẫu nghiên cứu.
Nếu C ≥ 50% thì ñược coi là dương tính.
Những test thường sử dụng:
Các enzyme ñược dùng ñặc biệt nhiều trong những test nhanh như
spot test , dip test. Ưu ñiểm của test là ñễ sử dụng, rẻ tiền nhanh và ñộ nhạy
cao. Tuy nhiên sử dụng test thì người nghiên cứu cần phải hiểu rõ nghiên
cứu cử mình ñể sử dụng test cho thích hợp.
Ứng dụng:
Kỹ thuật này dùng ñể ñịnh tính hoặc ñịnh lượng các chất có phân tử lượng nhỏ,
ñộc tố của nấm mốc, dư lượng thuốc trừ sâu, dư lượng chất kháng sinh.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Gắn cộng hợp SBA-afatoxi B1(AFB1) (A FB cố ñịnh trên protein
hapten - SBA)

AFB
1
BS
A

AFB1

AFB1

BSA

AFB1
BSA

BSA
Cộng hợp protein
(BSA) và kháng
nguyên (AFB)


Bước 2: Tráng giếng bằng protein

AFB
1
BS
A

AFB
1
BS
A

Protein
tráng giếng

Bước 3: Cho tiếp cộng hợp kháng thể gắn enzyme vào mẫu xét nghiệm và
mẫu chứng ñể tạo phức hợp KN-.KT.E,KN cố ñịnh - KT

AFB

1
BS
A

AFB
1
BS
A

Kháng thể cộng
hợp enzyme

Mẫu chứng không có A FB

Trong mẫu xét nghiệm, nếu kháng nguyên tự do càng nhiều thì kháng
thể gắn với kháng nguyên cố ñịnh càng ít.


AFB
1
BS
A

B1
Kháng thể cộng hợp
enzyme, kháng
nguyên A FB

BS
A

Mẫu nghiên cứu có có A FB tự do

Bước 4: Rửa trôi những kháng thể không bắt cặp với kháng nguyên cố ñịnh
của mẫu chứng và mẫu nghiên cứu.
Như vậy mẫu chứng không có kháng nguyên tự do nên kháng thể cộng hợp
bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại nhiều hơn.

AF
BS

AF
BS

AF
BS

Mẫu ñối chứng và mẫu nghiên cứu sau khi rủa trôi

AF
BS


Bước 5: Bổ sung cơ chất.

AF
BS

AF
BS

AF
BS

AF

Cơ chất

BS

Bước 6:Cơ chất bị enzyme phân huỷ thành hợp chất có màu xanh

AF
BS

AF
BS

AF
BS

AF
BS

Mẫu chứng có màu ñậm hơn mẫu nghiên cứu.
7.5. Kỹ thuật thấm miễn dịch
Ứng dụng:
Kỹ thuật này dùng nhiều trong chuẩn ñoán nhiễm HIV, nhiễm khuẩn
và xác ñịnh kháng thể ñơn dòng.

Kỹ thuật gồm nhiều bước ñược tổng hợp của 3 phương pháp chính (ñiện di
SDS- Page, wethern bot, ELISE)
- ðiện di protein trên gel acrylamit ñể tách protein.
- Chuyển protein từ bảng gel lên màng lai (nitroxenlulose)
- Phủ huyết thanh chứa kháng thể lên màng lai và tiến hành lai
- Rửa những kháng thể không bắt cặp kháng nguyên trên màng lai (
proten)
- Thêm kháng kháng thể cộng hợp enzym ñể kháng thể phản ứng với phức
hợp (kháng nguyên - kháng thể).
- Bổ sung cơ chất ñể enzyme thủy phân cơ chất thành dung dịch màu.
- Xác ñịnh nồng ñộ kháng thể trong huyết thanh thông qua việc ño màu
dung dịch bằng phổ kế.
7.6. Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch.
Thông thường các ñộc tố nấm mốc (AFB1) trong nông sản thực phẩm
rất thấp (ở dạng lượng vết). ðể ñịnh lượng với ñộ chính xác AFB1 ta cần
phải làm giàu mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch. Sắc ký ái lực
miễn dịch ñược dựa trên phản ứng ñặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên
(AFB1). Phương pháp này không những chỉ ñặc hiệu mà còn ñơn giản, dễ
thực hiện và không ñộc hại cho người sử dụng.
Nguyên lý của sắc ký ái lực miễn dịch
Cột sắc ký ái lực miễn dịch ñược minh hoạ trên hình 7.10. Trên những
hạt gel kháng thể ñặc hiệu với chất cần phân tích ñược gắn một cách bền
vững nhưng không mất hoạt tính. Các hạt gel này ñược nhồi trong một cột
nhỏ (cột sắc ký). Khi cho dịch chiết mẫu qua các cột này các chất cần phân
tích (kháng nguyên) sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu ñã qua cột,
ta rửa cột ñể loại bỏ những phần không bắt cặp ñặc hiệu với kháng thể. Sau
ñó sử dụng dung môi ñể kéo kháng nguyên ra khỏi kháng thể. Dung dịch thu
ñược, xác ñịnh bằng phương pháp ELISA hoặc một số phương pháp phân
tích khác.

Hình 7.10: Cột sắc ký ái lực miễn dịch
7.7. Phương pháp ñiện di miễn dịch
1- ðiện di khuyếch tán miễn dịch
Nguyên tắc.
Kỹ thuật này dựa trên hiện tượng khuyếch tán kháng nguyên và kháng
thể nhưng không phải là khuyếch tán tự nhiên mà người ta sử dụng dòng ñiện
ñể hướng dẫn cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau nhanh hơn. Kháng
nguyên chuyển ñộng từ cực âm sang cực dương, kháng thể chuyểng ñộng
ngược lại cho ñến khi kháng nguyên gặp kháng thể tạo thành các vòng cung kết
tủa có thể nhìn ñược bằng mắt hoặc thông qua thuốc nhuộm ñặc hiệu.
Cách thực hiện.
- Chuẩn bi gel agar hoặc gel agarose (1% trong ñệm barbitone pH = 8,2).
- Trải gel trên phiến kính dày khoảng 3mm.
- ðục hai giếng cách nhau khoảng 1cm theo chiều dài của phiến kính.
- Chuyển phiến kính vào buồng ñiện di có chứa dung dịch ñệm barbitone
pH = 8,2.
- Cho mẫu phân tích chứa kháng nguyên ở phía cực âm ( khoảng 5÷10µl).
- Cho một lượng tương ứng kháng thể ở phía cực dương.
- Tiến hành ñiện di ở ñiện thế 8v/1cm trong vòng 30 phút.


- Nếu có phản ứng kháng nguyên kháng thể thì sẽ xuất hiện các vòng cung
kết tủa có thể nhìn ñược bằng mắt hoặc thông qua thuốc nhuộm CBB,
0,025% (Coomassie briliant blue).
2- ðiện di hội tụ ñẳng ñiện
Kỹ thuật này cho phép tách biệt ñược các protein theo ñiểm ñẳng ñiện
của chúng ở tại các vị trí pH khác nhau trên bản gel. Gradient pH ñược tạo
ra trong bản gel sẽ ñược hình thành giữa cực âm và cực dương trong quá

trình ñiện di. Kết quả là các protein sẽ di chuyển do sức hút của các nhóm
ñiện tích ñối với cực dương và cực âm cho ñến khi các protein khác biệt ñiện
tích này sẽ ñạt tới ñiểm ñẳng ñiện của chúng thì dừng lại.
Dãy pH trên bản gel ñược duy trì ổn ñịnh khi ta sử dụng một hợp chất
ñiện di lưỡng tính và ñược gọi là các ampholit mang. Những ion lưỡng tính
này có ñiểm ñẳng ñiện xác ñịnh ñược lựa chọn và phân bổ ñều thành một
dãy pH mong muốn. Hỗn hợp ampholit này ñược bán sẵn từ các hãng nổi
tiếng trên thế gới.
Người ta có thể sử dụng gel polyacrylamit ñể ñiện di, ñối với những
phân tử quá kồng kềnh ta có thể sử dụng gel agarose .
Sau khi chuẩn bị xong: mẫu phân tích, khuôn gel, ... ta ñặt vào buồng
ñiện di, nối ñiện cực vào bộ nguồn và tiến hành ñiện di. Thời gian ñiện di
phụ thuộc vào thang pH, thường người ta ñiện di qua ñêm ở nhiệt ñộ 40C.
3- ðiện di hai chiều (2D-Page)
ðiện di hai chiều trên gel polyacrylamit ñược dùng ñể mô tả phương
pháp tách tách các phân tử protein theo hai chiều ðiện di 2 chiều có ñộ phân
giải cao, bao gồm có ñiện di hội tụ và ñiện di protein SDS - Page. ðiện di
hai chiều là một công cụ hết sức hữu íc trong nghiên cứu cơ bản và trong
nghiên cứu lâm sàng.
Nhờ ñiện di hai chiều (2D-Page) các kháng thể tinh chế có thể ñược
chuyể thấm miễn dịch ñể phát hiện kháng nguyên và các epitop tương ứng.
ðiện di hai chiều kết hợp với nhuộm bạc cũng cho phép ñánh giá chính xác
mức ñộ tinh sạch của một loại protein nhất ñịnh.(xem phần mô phỏng)


+ Yêu câu pyê