Ebook phân tích hóa học thực phẩm phần 2 hà duyên tư (chủ biên)

Chương 7

CH ẤT THƠM

7.1. GIÓI THIỆU

Chất thcrm của một sàn phẩm thực phẩm là một tổ hợp gồm rất nhiều chất
hoấ học khác nhau (như hợp chất amine, những hợp chất dị vòng chứa nitơ hoặc lưu
huỳnh, những rượu, aldehyt, xeton, những hợp chất cacbiiahydro, tecpen...) chúng
có với lượng vô cùng nhỏ (vài mg/kg sản phẩm) hoặc ở trạng thái vết mà con người
có thể cảm nhận được qua khứu giác.
Những tiến bộ m ới của phương pháp phân tích lý - hoá, những cô' gắng của
nhiều nhà khoa học để thiết lập những quan hệ giữa sự có mặt hoặc không có của
một vài hợp chất bay hơi với chất lượng của sản phẩm đang trên đà phát triển.
Những chất thơm phải là những chất bay hơi và có nồng độ nhất định để cảm
nhận được bằng cảm giác. Ngưỡng cảm nhận của các chất rất khác nhau, có những
chất với nồng độ vô cùng nhỏ nhưng cường độ mùi thơm lại lớn hcfii so với những
chất có nồng độ cao hơn, và chất đó là chất chính đặc trưng cho m ùi của sản phẩm
đó. Cùng một hợp chất thơm, nhưng nằm trong môi trường khác nhau sẽ cảm nhận
khác nhau. Chẳng hạn trong m ôi trường có lip it thì cường độ m iii thcrm sẽ thay đổi
so với môi trường không có lip it.
Để phân tích những chất thơm trước hết phải tiến hành chiết chúng ra khỏi
các sản phẩm thực phẩm.

187


7.2. NHỮMG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CHẤT THƠM

Nghiên cứu những hợp chất bay hơi cùa chấl thơm rất phức tạp bới vì trong
một sản phẩm thực phấm có rất nhiều chất bay hơi. Những chất này có nhữiig tính

chất lý học và hoá học rất khác nhau (áp suất hơi, tính có cự c...) và nồng độ của
chúng trong sản phẩm cũng rất khác nhau. Hiện nay để phân tích chất thơm bàng
phương pháp sắc kí khí, nhất thiết phái tách nhimg hợp chất bay hơi ra khỏi phần
không bay hơi. Có

Iiliiề ii

phương pháp tách chiết khác nhau, và hiện nay khó có thể

nói là phương pháp nào tốt nhất vì mỗi phương pháp tách chiết thích hợp cho một
vài hợp chất có trong thành phần chất thơm, có nghĩa là hiệu suất tách chiết từng
cấu từ chất bay hơi tiiỳ thuộc vào phương pháp tách chiết (bảng 7.2).
Báng 7.2. Hiệu suất thu hổi (%) của một số chất theo phương pháp tách chiết

Nhóm hoá hoc

Không gian đầu

Chưng cất

Trích li lỏng- lỏng

74,5

2,1

23,4

Sexquitecpen

5,3

1,8

6,1

Rượu béo mạch thẳng

1,4

17,9

14,2

Rượu tecpen

7,8

57,2

36,7

Lonon và dẫn suất

2,2

8,0

13,9

Các xeton khác

3,9

2,2

2,6

Tecpen

V ì vậy tùy thuộc vào thành phần và lính chất của các hợp chất thơm có trong
sản phẩm mà dùng những phương pháp tách chiết khác nhau.
7.2.1. PHƯƠNG PHÁP KHÒNG GIAN ĐẦU (PHƯƠNG PHÁP HEADSPACE)
Phương pháp này dùng một khí trơ (nitơ, acgon, CO 2) với tốc độ nhất định đi
qua dung dịch phân tích, khí trơ sẽ kéo theo hơi của nhữiig chất bay hơi có trong
dung dịch. H ơi này sẽ được đưa trực tiếp vào CỘI của máy sắc kí khí nhờ hệ thống
van tự động để phân tích hoặc thu hồi chất thơm bằng các cột hấp thụ.
Nồng độ của chất bay hơi trong pha hơi phụ thuộc vào bản chất của chất
bay hơi và bản chất của môi trường chứa chất bay hơi. V í dụ trong dung dịch chứa
chất thơm, nếu cho thêm đường saccaroza, glucoza hoặc fructoza, sẽ làm tăng áp

188


suất hơi của những chất bay hơi. Ngược lại nếu có thêm axit citric ihì áp suất hơi sẽ
giảm xuống. Nồng dộ của các chất trong pha hơi còn phụ thuộc vào hệ số hoạt độ
cỉia các chất hoặc hệ số phân chia cứa chất bay hơi.
1 ’rường hợp khi phân tích chất thơm cùa một sản phám, nồng độ chất thơm

quá nhò cần phải cò đạc bằng cách:

- Ngưng lụ hơi của các chất thơm bàng cách làm lạnh, theo phương plìáp
này thì nước cũng bị ngưng tụ;
- Hấp phụ hơi thu được bằng cột có c h ứ a các chất hấp phụ, những chất hấp
thụ thường dùng là than hoạt tính, chromosorbe 102, Porapak Q (polyme cua e th ylvinylbenzen-divinylbenzen), Tenax G .c (polyme của 2.6 diphenyl-p-phenylen
oxyl). Sau đó phải tiến hành quá trình nhả hấp phụ, lức là giải phóng chất thơm ra
khỏi c ộ t hấp phụ b ằ n g c á c h đ u n n ó n g cột hấp phụ và c h o k h í trơ đi q u a CỘI hấp phụ

theo chiểu ngược lại với tốc độ nhất định; khí Irơ sẽ kéo theo hơi của ch ít thơm và
hơi của nhữiig chất này được ngưng tụ trong một ống làm lạnh bằng khí nitơ lỏng
( -196"C).
Phương pháp Head- space có ưu diểm là phân tích nhanh, thiết bị đơn giản
không đắt tiển. Nhim g phương pháp này khõng thích hợp với những chất bay hơi có
nồng độ rất nhỏ.
Hình 7.2.1. Lấy chất thơm ra

^

^

khỏi cột hấp thụ;
1. cột hấp phụ chất thơm;
2. ống teílon;
3. binh chứa N2 lỏng (-196”C);
4. chất thơm ngưng tụ:
5. điện trở đun nóng :
6. phòng đun nóng.

189

7.2.2

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT NHỮNG CHẤT BAY HƠI TRONG DUNG

DỊCH BẰNG CHƯNG CẤT
Nguyên tấc của phương pháp này rất đơn giản; tách những chất bay hơi cc
trong sản phẩm ra khỏi phần không bay hơi bàng chimg cất theo hơi nước. Đế’ trárứ
cho chất thơm khỏi bị biến đổi tính chất ở nhiệt độ cao, người ta thường tiến hànl
chưng câì ở nhiệt độ thấp tức là chimg cất ở áp suất chân không. Chimg cất theo hơ
nước có thể chưng cất ở áp suất thường như chưiig cất tinh dầu trong các cây, qu;
có chứa tinh dầu hoặc chimg cất ở áp suất chân không như chưng cất chất thơn
trong sản phẩm thực phẩm.
Chimg cất ở nhiệt độ cao thường làm cho những hợp chất thơm bị thay đổ
tính chất như chúng bị biến tính hoá học, bị oxy hoá để biến thành những hợp chá
khác. Chẳng hạn người ta thấy lượng mitxen trong tinh dầu chanh thu hồi bằnị
phương pháp chưiig cất ít hơn so với lượng tinh dầu chanh thu được từ

bằnị

phương pháp ép lạnh, vì dưới tác cÌỊing của nhiệt m itxel có thể chuyển thành linalol
nerol và geraniol.
Có nhiều loại thiết bị chưng cất tinh dầu, sau đây là nguyên lý của một

S(

thiết bị thường dùng.

Thiết bị chưng cất dạng quay (Rotavơpor) kiểu Biiclti (Hình 7.2.2a)
Dung dịch để cất (nếu mẫu phân tích là sản phẩm rắn, nghiền nhỏ và chí
thêm nước vào), được đặt trong bình cầu 4, bình cầu này quay được nhờ mô to

Bình cầu 4 được đặt trong nồi cách thuỷ giữ ở nhiệt độ 45-50"C. Để giữ cho thiết b
làm việc ở nhiệt độ thấp, áp suất ở trong thiết bị được điều chinh vào khoảnj
VOmmHg. Hơi cùa những chất thơm cùng hơi nước ở bình 4 bốc lên và được ngưn]
tụ trên thành ống sinh hàn 7 và được thu vào bình cầu 6 ; bình này được đặt tron]
chậu nước đá (để tránh sự bay hơi của các chất dễ bay hơi). M ột ống thu hồi 5 đượ
đặt trong bình chứa nitơ lỏng (-196"C) được lắp vào giữa rotavapor và bơm châi
không nhằm thu hồi những chất dễ bay hơi nhất.

190


Hình 7.2.2a. Thiết bị

chưng cất dạng quay:
1. bình chứa N2 lỏng:
2. bơm chân không:
3. mô tơ;
4. 5, 6. bình cầu;
7. ống sinh hàn.

Sau khi kết thúc thí nghiệm, có thể phân tích riêng hai phần chất thcrm thu
được ở hai bình 6 và 5 hoặc trộn lẫn cả hai phần đem cô đặc và tiến hành phân tích
bằng sắc ký khí. Lượng những chất bay hơi thu được trong bình 6 thu được thường
bằng khoảng 80% so với lượng châì ban đầu. Hiệu suất của những chất bay hơi thu
được phụ Ihuộc vào thời gian chưng cất, lượiìg dung dịch ban đầu, nhiệt độ chưng
cất.

Thiết bị chưng cất chán không (Hình 7.2.2h)

191

H ình 7.2.2b. Mô hình thiết bị chưng cất chân không:

1, bình đựng mẫu;

4. ống thu hồi chất bay hơl đặt trong N2 lỏng;

2 , bình chứa nước chưng;

5 . ống

thu hồi dạng xoắn đặt trong

lỏng

3, ống làm lạnh ở 0°C;
Mẫu phân tích được đặt trong bình cầu 1. Bình này được đun nóng trong bình
cách thuỷ ở nhiệt độ từ 40-50"C. Để tạo cho sự bốc hơi được đều, trong bình 1 đặt
một thanh từ vào nồi cách thủy được đun bằng máy điện lừ, thanh từ sẽ quay làm
cho dung dịch được khuấy trộn, hơi chất thcfm cùng với hơi nước bay hơi qua ống
sinh hàn 3, được ngimg tụ và rơi xuống bình cầu 2.
Những chất dễ bay hơi hơn lại tiếp lục qua ống sinh hàn thẳng đimg 3 và
được ngimg tụ trong cốc ống thu hồi 4, 5 đặt trong các bình chứa nitơ lỏng
(-196"C). Sau khi kếi thúc thí nghiệm đem trộn nước ngimg tụ tại bình 2 và 4 rồi
đem cô đặc và đem phân tích chất thơm bằng sác ký khí.
7.2.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY
Phương pháp trích ly là phirơng pháp cổ điển được dùng trong nghiên cứii
chất thcrm. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hoà tan của các hợp chất
có trong sản phẩm vào các dung môi hữu cơ.

192


Phương pháp này thường được dùng đối với những sản phẩm đã được loại bỏ
lip it hoặc những sản phẩm không béo. Nó rất thích hợp trong việc nghiên cứii chất
thơm của các loại rượu. Tuy nhiên việc sử dụng dung m ôi để trích ly cũng có thể
gày ra sự không chính xác do trong quá trình trích ly có thế tạo ra những chất mới,
hoặc có thể làm cho mẫu phân tích bị nhiễm tạp chất, vì vậy dung môi đê trích ly
đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao.
Trong phương pháp trích ly việc chọn dung môi để chiết chất thơm rất quan
trọng. Nhiều nghiên cứu về trích ly những hỗn hợp chất thơm cho thấy hiệu suất thu
hồi đối với tìmg chất trong hỗn hợp thay đổi rất nhiều lu ỳ thuộc vào loại dung môi
để trích ly.
Dung m ôi trích ly chất thơm thường phải đảm bảo những yêu cẩu sau:
- Dung m ôi phải có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ sôi của những chất bay hơi
cần nghiên cứu, nhầm dễ dàng loại bỏ dung môi khi chưng cất và tránh sự tổn thất
của những hợp chất dễ bay hơi.
- Dung m ôi không hoà tan nước và rượii etylic.
- Tính có cực (hằng sô' điện môi) của dung môi phải phù hợp với những chất
thơm nghiên cứu, nhầm đạt hiệu suất trích ly cao, mỗi dung môi nhất định có tính
đặc hiệu đối với một số loại hợp chất hiìii cơ tạo thành chất thơm.
- Dung m ôi phải có khả năng dễ làm sạch.
- Dung m ôi phải có ít m ùi nhằm dễ dàng cho việc đánh giá mùi của chất
thơm sau khi trích ly (bảng 7.2.3)

Bảng 7.2.3. Những dung môi thường dùng trong trích ly chất thơm
Nhiêt đò sôi °c

Tỷ trọn g (d)

Dicloromethan

40

1,325

Ete dietylic

34

0,714

Hexan

69

0,659

Pentan

36

0,626

Trichloroíluoro methan

24

1,49

Tên d u n g m ôi

(Freon II)

193


Hoặc dùng hỗn hợp hai dung m ôi để trích ly dichloromethane/penlan (1:2);
dichloromethane/penian (3:7); hoặc dichloromethane/hexan.
Thiết *bị dùng để trích ly các chất thơm có trong các dung dịch ihirờng dùng
là thiết bị kiểu Soxhlet. Có hai loại, loại dùng cho dung m ôi hCm cơ nặng hơn nước
và loại dùng cho dung m ôi hữii cơ nhẹ hơn nirớc.

Tlìiết bị trích ly dìiỉìg cho dung môi ỉỉhẹ lìơn nước
Bình mẫu 4 được đun nhẹ ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi của dung môi một
ít (40"C đối với ete diethyl). H ơi dung môi bay hơi và được ngưng tụ ở ống sinh hàn
1 rồi rơi vào một cái phễu dẫn xuống tận đáy của tháp trích ly 3, tại đây có chứa
chất lỏng cần trích ly. Dung m ôi nhẹ hơn nước sẽ nổi lên qua lớp dung dịch phân
tích, hoà tan nhữiig chất thcrm có trong dung dịch phân tích và rơi xuống bình cầu 4
qua ống thông 6 , và cứ tuần hoàn như vậy cuối cùng la thu được chất chiết trong
bình cầu 4.

Hình 7.2.3a, Thiết bị

trích ly lỏng:
1. ống sinh hàn;
2. nước vào;
3. tháp trích ly;
4. bình mẫu;

5. bể nhiệt;
6. Ống thông.

Tlìiết bị trích ly dùng cho dung môi tiặng lỉơti nước
Dung m ôi nặng hcm nước được đựng trong bình 4 và được đun nóng trong
nồi cách thuỷ 5 (45"C đối với diclorometan). H ơi bay lên ngưng tụ trên thành ống
sinh hàn 1 (ống sinh hàn được làm lạnh bằng nước đá 0‘’C) rồi rơi xuống tháp trích

194


ly 3 qua ống thuỷ tinh 2. Trong tháp có chứa dung dịch mẫu phãn lích, Dung môi đi
qua lớp dung dịch chứa chấl thơm, nó hoà tan chất thơm rồi lắng xuống đáy tháp và
lại chảy sang bình 4, và cứ tuần hoàn như vậy, cuối cùng thu được dung m ôi và chất
thơm tại bình 4.

Ẳ

Hinh 7.2.3b. Thiết bị trích ly

-2

dùng cho dung môi nặng
hơn nước:
1. ống sinh hàn;
2. ống:

5 4 0

3. tháp trích ly;

o s

.

.

.

4. nổi cách thuỷ;
5. bể điều nhiệt.

7.2.4.PHƯƠNG PHÁP LIKENS - NICKERSON
Phương pháp L IK E N S - NICKERSO N là phưcmg pháp kết hợp đồng thời vừa
chưng cất vừa trích ly.
Thiết bị chiết Likens - Nickerson (hình 7.2.4). Dung dịch phân tích được đặt
trong bình cầu 1. M ộ t lượng nhỏ dung m ôi được đặt trong bình cầu 2.

cả hai

bình

này đều được đun nóng trên nổi cách thuỷ đến nhiệt độ sôi. H ơi dung m ôi ở bình 2
và hơi nước kéo theo chất thơm ở bình 1 sẽ gặp nhau ở buồng 3 và được ngưng tụ
trên ống sinh hàn rồi chảy xuống ống xiphông 5, ở đây do sự khác nhau về tỷ trọng,
dung m ôi sẽ hoà tan các chất thcnn và nước sẽ tách ra, dung m ôi chứa chất thcím sẽ
quay trở về bình 2 , còn nước quay về bình 1 .

195

Thời gian chiết tuỳ thuộc vào mẫu phân tích, khoảng từ 30 phút đến vài giờ.
Thường phương pháp phân tích này hay thực hiện ở áp suất khí quyển, nhưng để
tránh hiện tượng các chất bị oxy hoá trong quá trình chiết, người ta thực hiện ở áp
suất thấp.
Hiệu suất tách chiết của phương pháp này tuỳ thuộc vào loại dung môi, vào
nhiệt độ và thời gian chưng cất, vào độ pH của dung dịch chứa các chất thơm.
Phương pháp chưng cất và trích ly đồng thời có ưu điểm nhanh, hiệu suất cao
(>95%), chiết được những chất bay hơi có trong dung dịch ờ nồng độ loãng và tốn
ít dung môi. Dung dịch chiết được nhiều khi không cần cô đặc.

Hình 7.2.4. Thiết bị chiết Likens-

Nickerson (loại dung môi nhẹ hơn nước):
1. bình cầu đựng dung dịch phân tích;
2. bình đựng dung môi;
3. buồng hỗn hợp hơi dung môi và hơi
nước kéo chất thơm;
4. ống sinh hàn;
5. ống xi phông.

7.2.5. CÔ ĐĂC
Sau khi chiết các chất thcrm bằng phương pháp chưng cất hoặc trích ly bằng
các đung môi hữu cơ, dung dịch thu được cần được cô đặc trước khi đưa vào phân
tích bằng máy sắc ký khí.
Thường đối với phương pháp chưng cất theo hơi nước, dung dịch nirớc có
chứa chất thcfm thường có nồng độ loãng, để cô đặc trước hết là tiến hành chiết lấy

196

những chất thơm trong dung dịch nước bằng dung m ôi hữu cơ, sau đó cấl cho bay
hơi dung m ôi bằng cột Vigreux.
Dung dịch sau khi trích ly được đựng trong bình cầu 2. Sau đó lắp thiết bị
như hình vẽ 7.2.5. Bình 2 được đun nóng đến nhiệt độ sôi, hơi dung môi sẽ qua cột
Vigreux rồi qua ống sinh hàn và được ngưng tụ rồi rơ i xuống bình thu hồi dung môi
4. Đun như vậy cho đến khi ở bình cầu 1 còn lại thể tích khoảng 2ml.

Hình 7.2.5. Hệ thống cô

đặc dung mòi sau khi
trích ly:
1. cột Vigreux;
2. bình cầu;
3. dung dịch để cô đặc;
4. binh thu hổi dung môi;
5. đường nước vào.

7.2.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĐOẠN VÀ NHẬN BIẾT
Dung dịch chiết được là hỗn hợp các cấu tử chất thcrn. Để tách được các cấu
tử chất thơm, người ta dùng phương pháp chưng cất phân đoạn, các phương pháp
sắc ký. Hiện nay để phân tách từng cấu tử chất thcfiĩi, phương pháp hay dùng nhất là
phương pháp sắc ký khí (hình 7.2.6a).

197


C ó iiạ Ix n ii

IU .H I

Hình 7.2.6a. Nguyên lý phương pháp sắc ký khí

Hỗn hợp chất thơm sau khi chiết được bằng các phương pháp trên được cô
đặc và được đưa vào máy sắc ký khí để tách tìmg cấu tử chất thơm. T iiỳ từng loại
hợp chất bay hơi mà người ta sử dụng các máy sắc ký có cột và detectơ khác nhau,
thông dụng nhất là loại detectơ ngọn lửa ion hoá.
Căn cír vào phổ sắc ký người ta định lượng được các hợp chất bay hơi có
trong dung dịch mẫu phân tích. Thành phần của hỗn hợp chất thơm được thể hiện
dưới dạng tín hiệu cùa detectơ hay còn gọi peak trên sắc ký đồ. Để xác định tên gọi
của từng peak, cần dựa vào thời gian luxi của chất chuẩn đã được phân tích trên
cùng chương trình phân tích. Định lượng thành phần trong hỗn hợp, có thể dựa vào
tỷ lệ phần trăm diện tích peak hoặc bằng phương pháp xây dimg đường chuẩn, kết
hợp với detectơ khối phổ (hình 7.2.6b).

198


Hinh 7.2.6b Nguyên iý hoạt động của detectơ khối phổ

7.3. PHẦN THỰC HÀNH

Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu là chỉ số đặc trưng về chất lượng của
nguyên liệu đó. Để xác định hàm lượng tinh dầu có thể dùng phưcfng pháp chưng
cất với các loại thiết bị khác nhau.

Bài I. C h im g cất tỉnh dầu theo phương pháp Clevende
a. Dụng cụ, lioá chất
- Thiết bị Clevende
- Bếp điện

- Nước cất

b. Cách tiến liànlì
Mẫu nguyên liệu (hoa hồi đã được nghiền nhỏ hoặc lá hương nhu...đã được
thái nhỏ) được cân khoảng 25-50g (tuỳ thuộc vào lượng tinh dầu trong nguyên liệu
nhiều hay ít) cho vào bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3a. Đặt bình cầu lên
bếp điện. Qua ống sinh hàn 3 rót vào bình cầu 150-200ml nước cất rồi đun. Nước
trong bình sôi. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu sẽ theo ống dẫn hơi lên ống sinh hàn
và ngưng tụ lại chảy xuống ống thu tinh dầu, ở đây do tinh dầu không hoà tan trong

199


nirớc và tùy theo khối lượng riêng của nó lớn hơn hoặc nhỏ hơn khối lượng riêng
của nước mà chìm xuống dưới (hình 7.3a A ) hoặc nổi lên trên (hình 7.3a B), hoặc,
còn nước chưng theo ống xiphóng b hồi lini vào bình cầu 1. Thời gian chưng cất
kéo dài cho tới khi thấy lượng trong ống ihu c không đổi thì ngừng cất (khoảng 2-3
giờ tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu).
Sau khi chimg cất kết thúc, để nguội, đọc lirợiig tinh dầu trong ống thu.

a. Tính kết quả:
Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, tính theo % khối lượng nguyên liệu
được xác định bằng công thức sau:
E% =

a.7 .100
m

trong đó:
a: thể lích tinh dầu có trong ống thu;

ỵ:

khối lượng riêng của rinh dầu;

m: khối lượng pơuyên liệu nghiên cứu.
Nếu tính hàm lượng tinh dầu theo khối lượng chất khô tuyệt đối thì:

200


Et% =

a.y.ioo
m
100

(lOO- w)

trong đó:
W - hàm ẩm của nguyên liệu;
Các ký hiệu khác như trẽn.

Bài 2. Chưng cất tính dăii theo phương pháp Ghinbe
Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu
hoặc trong nước chưng, loại nhẹ hơn nước.

a. Dụng cụ, hoá clìấí
Bình cầu 500ml;

Bếp điện;

Ống sinh hàn;

Nước cất.

Ống Ghinbe;

b. Cách ĩiển lìàỉìlì
Cân 30-40g nguyên liệu đã nghiền nhỏ hoặc 250-300ml nước chưng cho vào
bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3b:

Hinh 7.3b. Thiết bị Ghinbe:

1. bình cầu;
2. ống Ghinbe;

ống Ghinbe

3. ống sinh hàn;
4. bếp điện.

201


Nếu xác định hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, qua ống sinh hàn rót vào
bình cầu 250-300ml nước cất. Đun sôi bình cầu trên bếp điện. Hỗn hợp hơi nước và
tinh dầu bay lên ống sinh hàn 3 ngưng tụ lại chảy vào ống Ghinbe. Tinh dầu nằm ở
trên còn nước chưng theo ống xiphông chảy về binh cầu. Thời gian chimg cất kéo
dài khoảng 2-3 giờ. K h i thấy nước tinh dầu trong ống Ghinbe không thay đổi thì
ngừng cất, để nguội. Lấy ống Ghinbe ra đọc lượng tinh dầu.

d. Tíitli kết quả
Cách tính kết quả như bài 1.

Bài 3. Phân tích thành phần tỉnh dầu bằng phư ơng p h á p sắc ký khí
1. Nguyên tắc
K h i bơm mẫu vào buồng bơm mẫu, dưới tác dụng cùa nhiệt độ làm bay hơi
các cấu tử của dung m ôi và của các cấu tử cần phân lích. Dòng khí mang sẽ dẫn các
cấu tử bay hơi vào cột tách sắc ký, tại đày diễn ra sự tương tác giữa các chất hấp
phụ được phủ bên trong cột và các cấu tử nên các cấu tử bị giữ lại trên cột. Tuỳ theo
tính chất của các cấu tử mà tương tác với chất hấp phụ khác nhau nên thời gian lim
của các cấu tử cũng khác nhau. Dòng khi mang vẫn được đưa liên tục vào cột tách
và nó sẽ mang những cấu tử đã tách ra khỏi cột tách qua ngọn lửa hyđro do đó làm
thay đổi độ dẫn điện của ngọn lửa. Dctector sẽ ghi lại sự thay đổi này và đưa ra sắc
ký đồ của cấu tử cần phân tích
2. Dụng cụ, rliiết bị
a. Dụng cụ
Càn phân tích 10-4g;

ố n g thuỷ tinh.

X ylanh 1 |,il;
b. Thiết bị
Thiết bị ký sắc ký kh í GC 2010, Shimadzu, Nhật Bản;
Điều kiện chạy máy ;
K h í mang: n it ơ ;
Vận tốc dòng: 1,25 m l/ p h ú t;

202

Detector: detector ion hoá ngọn lửa (FID );
Cột tách:

DB W ax, 60 m

X

0,25 mm

X

0,25 um;

Chế độ chia dòng: 1 :50;
Chương trình nhiệt độ: 70 "c (2 phút), 2"c/phút, 230 "c (20 phút);
Nhiệt độ injector và detector: 250 ”C;
Thể tích mầu: 0,2 |.il.

3. Hóa chất, thuốc thử
a. Hoá chất, thuốc thử
Q íc loại dung m ôi và chất chuẩn thuộc nhóm monoterpen, sesquiterpen độ
tinh khiết 99,9%;
K hí nitơ 99,999%.
1. Kết quả
lín hiọu săc ký

Hình 7.3.3. sẳc ký đổ tinh dầu Citrus kumquat
(DB Wax, 60m

X

0,25 mm

X

0,25 um)

203


B ả n g 7.3.3. Một số thành phần tinh dẩu mẫu Citrus kumquat

204

STT

Thành phần

Thời gian lưu

Hàm lượng
(% diên tích peak)

1

p - Pinen

7,2

0,250

2

Sabinen

8,6

0,107

3

3 - Caren

8,8

0,192

4

Mycren

9,2

1,627

5

a -Phellandren

9,7

0,055

6

Limonen

11,5

94,817

7

p - Phellandren

11,9

0,101

8

z-

13,0

0,013

|3 - Ocimen

9

Terpinolen

14,0

0,004

10

Octanal

14,5

0,172

11

Tetradecan

14,8

0,059

12

Z- Limonen oxyt

16,8

0 ,0 0 4

13

Menthon

17,6

0,010

14

Citronellal

20,0

0 ,0 3 5

15

Decanal

20,8

0 ,1 2 3

16

/7-Cubeben

23,3

0,012

17

Octanol

25,3

0,011

18

Terpinen - 4 - ol

27,4

0,029


Chương 8

VITAMIN

8.1. GIÓI THIỆU
Các vitam in được chia làm hai nhóm
- Nhóm hoà tan trong chất béo gồm các vitamin A, D...
- Nhóm hoà tan trong nước gồm vitamin nhóm B ( B l, B2...) và vitamin c.
N ói chung các loại thịt, cá, trứrig, sữa có đủ các vitam in hoà tan trong chất

béo và vitam in hoà tan trong nước. Riêng gạo và trứng có chứa nhiều vitamin A, D
cũng như B l, B2... Ngũ cốc chủ yếu chứa vitamin nhóm B nhưng hoàn toàn không
có vitam in c . Trong ngũ cốc chỉ có ngô vàng chứa khoảng 0,4mg caroten trong
lOOg. Các loại hạt họ đậu là nguồn cung cấp vitamin nhóm B rất tốt và một lượng
nhỏ caroten, còn vitam in nhóm B và vitamin c ở hàm lượng rất thấp. Các loại rau
quả có đầy đủ caroten, vitam in nhóm B với lượng rất ít nhưng lại chứa khá nhiều
vitam in c.
Ngày nay một số vitam in còn được gọi theo bản chất hoá học của chúng, ví
dụ; Vitam in c là axit ascorbic, BI là thiamin, B2 là riboílavin...
Trong chương này, chúng tôi chỉ trình bày một sô' phưcmg pháp xác định
caroten, vitam in A , vitam in c và vitamin B l, B2.

205


8.2. CAROTEN VÀ VITAMIN A
V itam in A chỉ được tổng hợp trong cơ thể người từ caroten của thực vật do
thức ăn đưa vào cơ thể. Dưới tác dụng của men carotenaza, caroten tạo nên vitamin
A. Trong thực vật tồn tại cả ba loại đồng phân của caroten: a, p và y-caroten, trong
đó quan trọng nhất là P-caroten.
Do tác dụng của vitam in A và caroten đối với cơ thể rất giống nhau nên khi
phân tích cần xác định caroten riêng hoặc xác định lổng lượng caroten và vitam in
A. Thông thường đối với thực phẩm nguồn gốc thực vật người ta quy hoàn loàn ra
caroten, đới với thực phẩm nguồn gốc động vật thì quy hoàn toàn ra vitam in A trên
cơ sờ 3 caroten bằng 1 vitam in A.

Bài 1. Xác định caroten bằng phương ph áp sắc ký cột
a. Nguyên tắc
Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột
rồi đem so màu.

b. Dụng cụ, lioá chất
- Cân phân tích
- Bình định mức V = 50ml, lOOml
- Cối sứ
- M áy so màu
- Cột sắc ký: dài 30cm, o = Icm
- Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm. Rửa cát qua rây
bằng nước máy, rồi dùng HC l (tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm. Rửa
cát cho tới hết axit. Rửa lại bằng nước cất, sấy khô.
- Benzin: nhiệt độ sôi 70 - 80"C.
- Chấp hấp phụ; Nhôm oxyt (A I 2O,) loại dùng cho sắc ký, sấy ở 100"C
trong 1 giờ, bảo quản trong bình làm khô có chất chống ẩm silicagen.
- Natrisuníat khan (Na 2S0 4 ).

206


-

Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn: Cân chính xác 0,145g azobenzen cho

vào bình định mức dung tích lOOml, thêm rượu etylic 96% đến vạch mức, lắc kỹ.
K hi thí nghiệm, đem dung dịch này pha loãng gấp 10 lần bằng rượu etylic 96%.
Dung dịch này để ở chỗ tối, màu sẽ không biến đổi.

c. Cách tiến hành
Cân 5 gam mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ, nghiền kỹ với 5
gam cát sạch trong 30 phút. Đê làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10 gam Na2S0 4
khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa.

Phần dưới của cột sắc ký được nhồi bông thấm nước. Sau đó cột được nhồi
nhôm oxyt khoảng 2/3 cột. Dùng đũa thuỷ tinh nén nhôm oxyt cho chặt. Trên cùng
lại đặt 1 lớp bông dày 1 cm.
Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký. Cho benzin vào cột
đến khi thấy lớp bột không thấm benzin nữa. Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột
được rửa chầm chậm bằng benzin đến khi không còn thấy những giọt màu vàng
chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. Cần chú ý cho benzin phủ ngập lớp bột vì
caroten để bị oxy hoá bởi không khí.
Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc
lOOml (tuỳ thể tích nước hứng được) và thêm benzin đến vạch mức, lắc nhẹ. Dung
dịch caroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã
pha loãng 10 lần). Trong Im l dung dịch có mầu giống dung dịch azobenzen tiêu
chuẩn chứa 0,00235 mg caroten.

c. Tính kết CỊiiả
Hàm lượng caroten (tính theo mg trong lOOg sản phẩm) được tính bằng công
thức:

x=

0,00235.lOO.V.D,,
in

trong đó:
V - dung tích bình định mức chứa dung dịch caroten trong benzin, ml;
G - lượng mẫu cân, g;

207

D,,. - mật độ quang hoặc chiều cao thước (trên máy Dubốt) của dung dịch
azobenzen tiêu chuẩn, mm;
D „ - mật độ quang, hoặc chiều cao thước (trên máy D iibốt) của dung dịch
caroten, mm.

Hình 8.2. Cột sắc ký xác định caroten
B à i 2 . X á c đ ịn h v ita m ỉn A b ằ n g p h ư ơ n g p h á p s o m à u

a. Nguyên tắc
V itam in A là một alcohol cao cấp chưa no có công thức hoá học như hình
sau và thường kết hợp với axil béo (palinitic và stearic) tạo thành este phức tạp. V ì
vậy khi muốn xác định vitam in A phải xà phòng hoá các sản phẩm, rồi xác định
vitam in A trong phần không xà phòng hoá. Vitam in A được tách ra khỏi dung dịch
không xà phòng hoá bằng cloroform khan và nó cho phản ứng với antimon (III)
clorua tạo sản phẩm màu xanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn.
HsC^ ^CHa
/^ \

H2C

ọ ----- (CH=CH-CCH3=CH)2-CH20H

H2Ò^

c—

c
H2

208

CH3
V it a m in A


iì. Dụiiị’ cụ, lioá chất
- Cân phân tích;
- Bình nón dung tích 250ml;
- Phều chiết;
- Ông làm lạnh;
- Nồi cách thiiỷ, cốc thuỷ tinh dung tích 250ml, bình định mức dung tích
25ml, 500ml;
- Ong nghiệm dung tích lOml, 22 cái, giá để ống nghiệm;
- Dung dịch màu tiêu chuẩn được chuẩn bị như sau: cân 75g đồng sunfat
(CUSO4.5 H 2 O) và 3,5g coban nitrat Co(NO ,)2 cho vào bình định mức dung tích
500ml, thêm nước đến vạch mức, lắc kỹ cho tan hết. Từ dung dịch này tạo dãy màu
tiêu chuẩn theo bảng 8.2.4.
Bảng 8.2.4. Dãy dung dịch màu tiêu chuẩn

sốm l

SỐ ống

Sô đơn

Số ống

Số ml

Số đơn

nghiệm

DD gốc

Nước

vi màu

Nghiệm

DD gốc

Nưóc

vi màu

1

20

0.0

9.2

12

20

31,6

4.0

2

20

0.4

9.0

13

20

41.2

3.5

3

20

1.6

8.5

14

20

55.4

3.0

4

20

3.0

8.0

15

20

742

2.5

5

20

4.5

7,5

16

20

104,2

2.0

6

20

6.3

7,0

17

20

131,0

1,75

7

20

8.7

6.5

18

20

175,0

1.5

8

20

11.6

6.0

19

20

190,0

1,25

9

20

14,6

5.5

20

20

240,0

1.0

10

20

19,0

5.0

21

20

330,0

0,75

11

20

24,4

4,5

22

Nước cất

-

-

- Giấy quì, natri suníat khan: đã sấy ở 100"C trong 1 giờ
- C loroform (C H C l,): Rửa 5 lần bằng nước cất tỷ lệ 2 nước : 1 cloroíorm
trong phễu chiết rồi làm khô bằng natri simfat khan sau đó chưng cất để thu dịch
tinh chế.

209


Dung dịch antimon ( III) clorua (SbClO bão hoà: SbCl, được rửa bằng cách
khuấy trong cloroíorm đến khi nuớc rửa không màu, SbCli đã rửa được để trong
bình làm khô (có chứa axit suníuric đặc) qua 2 ngày, sau đó hoà tan SbCl, trong
cloroform đến bão hoà.
- Ete etylic tinh khiết
- K ali hyđroxit dung dịch 20% trong rượu etylic

b. Cách tiến hành
Cân 10 đến 20 g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung

dịch kali hyđroxit 20% trong rưcru etylic. Đậy bình bằng nút bấc có gắn ống làm lạnh
và đun hồi lưu trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 85 - 90"C trong 2 giờ để xà phòng hoá.
Dung dịch đã xà phòng hoá được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu
chiết. Thêm vào phễu chiết 50ml ete etylic và lắc kỹ (để tránh tạo huyền phù, cần
chiết dịch lúc nguội và lắc mạnh) chiết phần không xà phòng hoá ra (lớp trên) vào
một phễu chiết thứ hai. Lại thêm 25ml ete etylic vào phần xà phòng hoá, tiếp tục lắc
và chiết lấy lớp trên vào phễu chiết thứ hai. Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3 - 4
lần m ỗi lần 2 0 m l nước cất cho đến khi nước rửa có phản ứng trung tính (thử bằng
giấy quỳ). Làm khô nước chiết đã rửa bằng 6 gam natrisunfat khan trong 30 phút.
Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đun đuổi ete trên nồi cách thuỷ.
Hoà tan cặn không xà phòng hoá thu được bằng cloroform (sau khi đã đuổi
hết ete) và chuyển vào bình định mức dung tích 25m l, thêm cloroíonn cho đến
vạch, lắc nhẹ.
Cho vào 1 ống nghiệm (khô, sạch, cùng màu, cùng kích thước như ống
nghiệm chứa dung dịch tiêu chuẩn) đúng 0 ,2 m l dung dịch trong bình định mức
trên, thêm vào 1 - 3 giọt anhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl, bão hoà lắc nhanh và
để không quá 1 0 giây đem đo màu với ống tiêu chuẩn trong 2 0 giây.

c. Tính kết quả
Hàm lượng vitam in A tính theo đơn vị màu của ống tiêu chuẩn có màu trùng
với màu của ổng nghiệm chứa dung dịch mẫu. Nếu màu của ống mẫu nằm giữa
màu của 2 ống tiêu chuẩn thì lấy trị số trung bình. Cuối cùng hàm lượng vitam in A
(mg trong lOOg sản phẩm) tính bằng công thức:

210


X=

n .v

G.4

n - số đơn vị màu tìm được khi so màu;
V - dung tích bình định mức chứa dung dịch không xà phòng hoá trong
cloroíorm , ml;
G - lượng mẫu cân, g;
4 - hệ số thực nghiệm để tính ra mg%.

8.3. NHÓM VITAMIN

c, BI

VÀ B2

B ài 3 . Xác định vitamin c
a. Nguyên tắc
V itam in

c (axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật. Nó

tham gia vào nhiều quá trình oxy hoá khử xảy ra trong cơ thể người. Trong phân tử
ascorbic chứa nhóm dienol (-C O H =C O H -) có tính khử mạnh. V itam in

c dễ bị oxy

hoá thành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch.
0 = c --------

0 = 9 -----■2H

c — OH
c — OH

1

ò= 0

Ó

c

HỌ----------

HC

I.

HO— ỘH

HO— CH

L

CH2OH

Axit ascorbic

o

CH2OH

Axit dehydro ascorbic

A x it dehydroascorbic cũng như axit ascorbic là chất hoạt động sinh học
mạnh và chống xuất huyết.
Dựa trên tính khử-m ạnh của axit ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt
phương pháp hoá học để định lượng nó. Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và
hay dùng nhất là phương pháp cho axit ascorbic khử m uối natri của 2 ,6
diclophenolindophenol. Màu xanh đen của chất chỉ thị này (dạng oxy hoá) khi gặp
axit ascorbic sẽ chuyển thành không màu (dạng khử).

211