Bài 2 - KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

BAØI 2
KỸ THUẬT PCR
(Polymerase Chain Reaction)


Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại
nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà
không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp
này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki
hoàn thiện năm 1988.


I. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP
PCR là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm
trong ống nghiệm. Phương pháp này được thực hiện invitro với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase. Sự
khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt được
lặp lại.
PCR


II. CÁC THÀNH PHẦN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC
HIỆN PHẢN ỨNG







Sîi khu«n (DNA hoÆc cDNA)
C¸c måi (Oligonucleotide primers)

DNA polymerase chÞu nhiÖt (Taq)
dNTP’s
Dung dÞch ®Öm
Ion Mg++



III. TIN HNH PHN NG
1. Biến tính ADN: 94-95oC, 30-60 giây.
2. Bắt cặp của mồi vào sợi khuôn: 45-60oC, 30-60 giây.
3. Phản ứng kéo dài chuỗi: 72oC, 60 giây/1kb.
3 bước trên hình thành 1 chu kỳ. Phản ứng PCR được tiến
hành trong khoảng 25-40 chu kỳ.
Trong kỹ thuật PCR thông thường người ta thực hiện bước
biến tính ADN trước khi bước vào chu kỳ. Bước này thư
ờng được thực hiện ở 94-95oC, 2-3 phút.


Ph¶n øng PCR - b­íc b¾t cÆp cña c¸c måi
vµo sîi khu«n
5’

3’

3’

5’

45 - 60ºC
5’

3’

3’

5’


Ph¶n øng PCR - b­íc kÐo dµi chuçi
5’

3’

3’

5’

72ºC
5’
3’

5’
5’

3’
5’


Phản ứng PCR - sản phẩm được hình thành sau 3 bước
Biến tính

Bắt cặp & kéo dài chuỗi
5

5
5
5
5

5
5
5


S¶n phÈm cuèi cïng cña ph¶n øng PCR



IV. LỢI ÍCH CỦA PHẢN ỨNG PCR





Thời gian thực hiện rất nhanh. Chỉ cần
khoảng 3 giờ để khuếch đại trình tự DNA
trong khi với phương pháp tạo dòng ta mất
khoảng 1 tuần;
Đơn giản và ít tốn kém;
Độ tinh sạch của mẫu không cần cao;

V. CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ
THUẬT PCR
1. Nhân phân tử RNA bằng kỹ thuật PCR
 Cần có các đoạn mồi kết hợp được với
khuôn RNA, sau đó tổng hợp các phân tử
DNA nhờ enzyme reverse trancriptase theo
kỹ thuật PCR.
 Enzyme Tth DNA-polymerase có thể thực
hiện cả phản ứng sao chép ngược và phản
ứng tăng số lượng. Quá trình này cần có ion
mangan.


2. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA)


Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo các
bước sau:
–
–
–

Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy
PCR;
Điện di trên gel;
Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần
mềm thông dụng. Các số liệu thu được cho thấy

sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu
nghiên cứu.


VI. CÁC HẠN CHẾ CỦA PHƯƠNG
PHÁP PCR
1. Kích thước của trình tự cần khuếch đại
Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp
PCR không hoạt động được với những đoạn
DNA lớn hơn 3kb. Việc sử dụng PCR đối với
các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt.


2. Sự ngoại nhiễm.
3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase.
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai
khá cao (10-4)