Chọn lọc và nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (2)

BỘ CÔNG THƯƠNG
TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
……………………*……………………

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI
CẤP BỘ NĂM 2009
TÊN ĐỀ TÀI:

CHỌN LỌC VÀ NHÂN GIỐNG 6 DÒNG KEO TAI TƯỢNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG
CƠ QUAN CHỦ TRÌ:

VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

ThS. PHẠM ĐỨC HUY

CỘNG TÁC VIÊN VIÊN:
NGUYỄN BÍCH THỦY
ĐƠN VỊ: PHÒNG QUẢN TRỊ-BỘ CÔNG THƯƠNG

7744
01/3/2010
PHÚ THỌ, THÁNG 11/2009


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BAP: 6-Benzylaminopurine
NAA: 1-Naphtalene acetic acid
IBA: 3-Indolbutiric acid
Hvn (m): Chiều cao vút ngọn
D1.3(cm): Đường kính ở vị trí 1,3m
Dt (m): Đường kính tán lá
Vcây (dm3): Thể tích thân cây
N: Số lần lặp của thí nghiệm


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Thứ thự bảng

Trang

Bảng 01

Sinh trưởng của 20 cây trội chọn lọc

15

Bảng 02

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả của
giai đoạn đưa mẫu vào in vitro

16

Biểu đồ 01. Tỷ lệ mẫu sống ở các công thức khử trùng mẫu

16

Bảng 03

Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân chồi
của 6 dòng

18

Bảng 04

Phân nhóm về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến
hệ số nhân chồi

19

Bảng 05

Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến giai đoạn tạo chồi của 6
dòng Keo tai tượng

20

Biểu đồ 02

Tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi ở các độ tuổi khác nhau

21

Bảng 06

Ảnh hưởng của mùa lấy mẫu đến hiệu quả của giai
đoạn đưa mẫu vào in vitro

21

Bảng 07

Phân tích phương sai về mùa cắt mẫu.

22

Bảng 08

Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi
hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng

23

Bảng 09

Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân
chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu của 6 dòng Keo tai tượng

25

Bảng 10

Ảnh hưởng phối hợp của BAP, NAA và kinetin đến hệ
số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu của 6 dòng Keo tai

tượng

27


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
TÓM TẮT

1

I. TỔNG QUAN

2

1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài

2

1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2

1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài

2

1.2.2. Mục tiêu của đề tài

3

1.3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu

4

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu

4

1.3.2. Nội dung nghiên cứu

4

1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu

4

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

4

1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

5

II. THỰC NGHIỆM
2.1. Phương pháp nghiên cứu

7
7

2.1.1. Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội

7

2.1.2. Xử lý cây mẹ tạo chồi

7

2.1.3. Tiêu chuẩn mẫu cấy

7

2.1.4

8

Thử nghiệm tuổi mẫu và mùa lấy mẫu

2.1.5. Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy

8

2.1.6. Thử nghiệm môi trường cơ bản

9

2.1.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hiệu quả quá trình tạo chồi

9

2.1.8. Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến nhân nhanh chồi

10

2.1.9.

Ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA và kinetin đến hiệu quả
nhân nhanh chồi

10

2.1.10. Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy

11

2.1.11. Thu thập và xử lý số liệu

11

2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

13

2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận

14

2.3.1. Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội

14

2.3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống

15

2.3.3. Thử nghiệm lựa chọn môi trường cơ bản cho nhân nhanh chồi

17

2.3.4.

Ảnh hưởng tuổi mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa mẫu vào
in vitro

19

2.3.5.

Ảnh hưởng của mùa lấy mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa
mẫu vào in vitro

20

2.3.6.

Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ

chồi hữu hiệu.

22

2.3.7.

Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi
và tỷ lệ chồi hữu hiệu.

24

2.3.8.

Ảnh hưởng phối hợp của BAP, NAA và Kinetin đến hệ số
nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu.

27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

30

III

3.1. Kết luận

30

3.2. Kiến nghị

31

IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO

32

PHẦN PHỤ BIỂU


TÓM TẮT
Đề tài “Chọn lọc và thử nghiệm nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào” dự kiến thực hiện trong 2 năm 2009 và 2010.
Năm 2009 đề tài thực hiện một số nội dung thuộc 2 lĩnh vực:
Thứ nhất là tiến hành chọn cây trội, xác định màu sắc gỗ của cây trội và
tiến hành xử lý tạo chồi phục vụ nuôi cấy mô tế bào. Đề tài đã chọn được 6 cây
mẹ ưu trội nhất từ 20 cây trội của Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã chọn
trước đây. Đã xác định được màu sắc lõi gỗ của 6 cây mẹ cung cấp vật liệu nhân
giống bằng phương pháp khoan tăng trưởng.
Thứ hai là thử nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đưa mẫu
vào in vitro và giai đoạn nhân nhanh chồi. Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro (cấy
mẫu từ tự nhiên vào ống nghiệm) đã xác định được khử trùng bằng HgCl2 0,1%
với thời gian 16 phút cho tỷ lệ sống cao nhất bình quân đạt 15,6%. Thời gian cắt
mẫu vào mùa hè có tỷ lệ mẫu sống cao hơn hẳn khi cắt mẫu vào mùa thu. Môi
trường cơ bản thích hợp nhất là môi trường MS. Giai đoạn nhân nhanh chồi đã
xác định được môi trường cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất
đối với từng dòng là:
- Dòng 1: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,5mg/l
BAP + 1,2 mg/l NAA, pH=6. Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,6
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 18,9%
- Dòng 2, 3, 6 và dòng số 13: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5

g/l agar + 1,2mg/l BAP + 0,9 mg/l NAA, pH=6. Hệ số nhân chồi của các
dòng lần là: 1,5 lần; 1,6 lần; 1,6 lần và 1,4 lần. Tỷ lệ chồi hữu hiệu là
24,8%; 22,7%; 22,0% và 22,4%.
- Dòng 14: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 0,9mg/l
BAP + 0,6mg/l NAA, pH=6. Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,7
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 26,7% .

1


I.

TỔNG QUAN.

1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài.
- Căn cứ quyết định số 6363/QĐ-BCT, ngày 02/12/2008 của Bộ Công
thương về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ năm
2009 với Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.
- Căn cứ hợp đồng số 085.09.RD/HĐ-KHCN ngày 04/03/2009 của Bộ
Công thương về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ
năm 2009 với Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy.
- Căn cứ quyết định số 14/VNC-QĐ.KHTH ngày 05 tháng 03 năm 2009
của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ
nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ năm 2009.
1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài.
Keo tai tượng (Acacia mangium Wild) đã và ngày càng được trồng rộng
rãi ở hầu hết các vùng sinh thái của nước ta và là loài cây ưu tiên trồng rừng ở cả
9 vùng sinh thái trên toàn quốc. Đối với vùng Trung tâm Bắc Bộ hiện nay thì đây
là loài cây được trồng phổ biến và có diện tích rừng trồng lớn nhất trong số các

loài cây trồng rừng kinh tế.
Năm 1996 Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên
cứu cây nguyên liệu giấy đã chuyển hóa 10,6 ha rừng trồng khảo nghiệm từ
nguồn hạt nhập nội xuất xứ Carlwell tại Hàm Yên – Tuyên Quang thành rừng
giống. Hiện nay, rừng giống chuyển hóa này đã cho hiệu quả rõ rệt, rừng trồng
từ nguồn hạt của rừng giống sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao hơn rõ
rệt so với rừng trồng đại trà ở Vùng Trung tâm Bắc Bộ. Tuy nhiên, sản lượng hạt
của rừng giống còn thấp, nguồn hạt giống không đủ cung cấp cho trồng rừng của
Tổng công ty giấy nói riêng cũng như trồng rừng trong khu vực. Một số cây sinh
trưởng và phát triển tốt, có thể tích thân cây lớn lại không ra hoa kết quả. Đồng
thời sử dụng hạt giống từ của cây trội còn có những hạn chế do thu phấn mang
lại. Nhân giống vô tính những cây trội này đảm bảo giữ được những đặc tính ưu
trội của chúng và dễ dàng lưu giữ nguồn gen quý.
2


Cũng như các loài cây khác, nhân giống vô tính cây Keo tai tượng vừa
nhân nhanh các dòng đã được chọn lọc, tăng sự đồng đều của rừng trồng từ đó
tăng năng suất và chất lượng rừng. Do vậy, nuôi cấy mô tế bào các dòng Keo tai
tượng ưu trội của rừng giống Hàm Yên vừa đáp ứng được các mục đích nêu trên
vừa đáp ứng bảo tồn và phát triển nguồn gen quý khi rừng giống không còn thu
hái hạt.
Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để tạo ra số lượng lớn cây con chất
lượng cao phục vụ trồng rừng khảo nghiệm và trồng rừng kinh tế. Về lâu dài là
nâng cao năng suất, chất lượng rừng và phát triển nguồn gen quý được chọn lọc
thì thử nghiệm nhân giống cây Keo tai tượng và tiến tới hoàn thiện công nghệ
nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là cần thiết.
Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy là một trong những đơn vị đi đầu về
nuôi cấy mô tế bào các loài cây lâm nghiệp, nhiều loài cây đã được nuôi cấy ở
quy mô công nghiệp, đội ngũ cán bộ có nhiều kinh nghiệm, cơ sở vật chất tương

đối đầy đủ. Đây là những yếu tố quan trọng để đề tài đạt được tốt nhất các mục
tiêu đề ra.
1.2.2. Mục tiêu của đề tài.
™

Mục tiêu lâu dài.

Chọn lọc và nhân nhanh cây Keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào. Tạo được cây con Keo tai tượng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho trồng
rừng khảo nghiệm. Góp phần nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng Keo
tai tượng.
™

Mục tiêu năm 2009:

1.

Tuyển chọn được 6 cây mẹ ưu trội cung cấp vật liệu nhân giống.

2.

Xác định tuổi mẫu, mùa cắt mẫu cho hệ số nhân chồi cao và thời gian khử
trùng mẫu thích hợp cho tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi cao.

3.

Tìm môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân chồi đối với 6 cây trội đã
chọn.

4.

Tạo được bình giống gốc từ cây trội đã chọn lọc.

3


1.3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu.
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu.
™

Cây mẹ lấy mẫu:

Cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống là 6 cây ưu trội nhất được chọn lọc
từ 20 cây trội tại rừng giống Hàm Yên - Tuyên Quang (20 cây trội này đã được
Sở NN&PTNT Tuyên Quang công nhận là cây trội cung cấp vật liệu nhân
giống).
™

Mẫu nuôi cấy:

Mẫu nuôi cấy là chồi được tạo ra từ cây dài 4-7cm chứa nách lá thứ 3-6.
Mẫu nuôi cấy là những chồi sinh trưởng tốt, không sâu bệnh.
1.3.2. Nội dung nghiên cứu.
Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Chọn lọc cây trội Keo tai tượng theo mục tiêu nâng cao năng suất rừng trồng.
Xác định màu sắc gỗ của cây trội đã chọn.
2. Xử lý cho cây mẹ nảy chồi.
3. Khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau và tìm
thời gian khử trùng thích hợp.
4. Thử nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố: tuổi mẫu và mùa lấy mẫu cho tỷ lệ

mẫu nảy chồi cao.
5. Nuôi cấy mẫu trong 3 loại môi trường và xác định môi trường cơ bản thích
hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi.
6. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng
phối hợp của chúng đến quá trình nhân nhanh chồi.
7. Thu thập, xử lý số liệu và viết báo cáo.
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu.
1.4.1. Trong nước.
Các loài Keo nói chung (Acacia) đặc biệt là Keo tai tượng (Acacia
mangium) đã trở thành loài cây trồng rừng chính ở nước ta hiện nay. Đây là loài
cây họ đậu có tốc độ phát triển nhanh, thích nghi với nhiều dạng lập địa, chất
lượng gỗ tốt và đa tác dụng. Đặc biệt cây Keo có thể phát triển trên những lập
4


địa thiếu nitơ vì hệ rễ có nốt sần cố định đạm do đó chúng còn được trồng làm
cây cải tạo đất [2].
Trong các chương trình cải tạo giống cây lâm nghiệp thì giai đoạn nhân
giống nhằm tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng di truyền đồng đều từ đó
nâng cao năng suất và chất lượng rừng là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, đối với
cây Keo tai tượng thì các nghiên cứu mới tập trung vào giai đoạn chọn tạo giống
và xây dựng vườn giống, rừng giống hữu tính. Việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ
thuật nhân giống in vitro còn hạn chế và cho đến nay chưa có những báo cáo về
nhân giống in vitro đối với loài cây này.
Cùng loài với cây Keo tai tượng là cây Keo lai đã được tiến hành nghiên
cứu và sản xuất thử nghiệm tại nhiều nơi ở nước ta. Hiện nay một số đơn vị đã
sản xuất cây con Keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Mặc dù vậy,
những báo cáo về nhân giống in vitro đối với cây Keo tai tượng và Keo lai ở
nước ta còn ít. Nếu có thì cũng chưa thể hiện được các các biện pháp kỹ thuật cụ
thể đối với loài, chưa đưa ra những môi trường hóa học cụ thể. Ví dụ, như báo

cáo về “Kỹ thuật nhân giống keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh”
của Đoàn Thị Mai và cộng sự [3] mới chỉ đưa ra những thông tin chung, chưa cụ
thể về các biện pháp kỹ thuật cho từng giai đoạn.
1.4.2. Ngoài nước.
Cùng với một số loài cây thân gỗ khác như Bạch đàn, Thông, Dương...vv,
nhân giống cây Keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được
thực hiện ở nhiều nước trên thế giới và thu được những thành công đáng kể,
nhiều công trình nghiên cứu về loài cây này đã được công bố như:
Tác giả Darus H. Ahmad thuộc Viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia
(Forest Research Institute) đã nuôi cấy in vitro cây Keo tai tượng (Acacia
mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0.6% agar và 0.5 mg/l
BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao >0.5 cm được cấy vào
môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA ở nồng
độ 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% [7].
Với công bố của Marie-Claude Bon [8] về nghiên cứu nhân giống invitro
cây Keo tai tượng với vật liệu nhân giống là hạt. Tác giả đã thử nghiệm 7 công
5


thức về nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đối với môi trường nhân nhanh
chồi. Trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy ngày/đêm là 28/22 ± 20C thì môi trường
nhân chồi tốt nhất là môi trường MS + 4,4µM BA + 2,7 µM NAA, pH =5,6-5,8.
Sau 8 tuần nuôi cấy thu được chiều cao trung bình của chồi là 10,5mm.
Năm 2004, Olivier Monteuuis [11] đã công bố kỹ thuật nhân giống in vitro
cây Keo tai tượng với cây mẹ là những cây trội tuổi 7. Ở đây mẫu được khử
trùng bằng cồn 70% trong vòng 5 phút sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong
3 phút. Môi trường nhân chồi là môi trường MS có bổ sung 50mg/l Myo-inositol
+ 200 mg/l casein hydrolyzate + 2mg/l glysin + 2,2 µM BA + 0,1µM NAA +
30g/l sucarose; pH từ 5,6-5,8.
V.J.Hartney và cộng sự đã tạo cây con Keo tai tượng thành công bằng

nuôi cấy in vitro. Ở đây vật liệu nuôi cấy là hạt giống xuất xứ Cardwell,
Queensland, đây cũng là xuất xứ của những cây trội trong đề tài. Hạt được gieo
trong ống nghiệm cho nảy chồi phục vụ các nghiên cứu tiếp theo. Môi trường
nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% sucrose + 0.8% agar + 1µM BAP + 1 µM
NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C ( ± 40). Giai đoạn khử
trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypochlorite 4% và
khử trùng trong thời gian 20 phút.
Cùng với cây Keo tai tượng, cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) cũng
đã được W.Nitiwattanachai nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thành công từ chồi của cây trội. Ở đây tác giả sử dụng môi trường nhân nhanh
chồi là MS (1962) + 10 µM BAP + 0.5 µM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ
là môi trường White (1963) + 2 µM IBA + 1 µM NAA [12].
Từ những nghiên cứu trên cho thấy, nhân giống in vitro cây Keo tai tượng
thường sử dụng tổ hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng là BAP và NAA với ph từ
5,6-5,8. Tuy nhiên các các nghiên cứu khác nhau lại sử dụng nồng độ khác nhau,
điều này cho thấy vật liệu nghiên cứu khác nhau đòi hỏi nồng độ các chất điều
hòa sinh trưởng cũng khác nhau. Vật liệu là hạt gieo trong ống nghiệm thì nồng
độ các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nhân chồi thấp hơn với vật
liệu từ chồi cắt từ cây mẹ. Cây mẹ có tuổi càng cao đòi hỏi nồng độ các chất điều
hòa sinh trưởng càng cao.

6


II. THỰC NGHIỆM.
2.1. Phương pháp nghiên cứu.
2.1.1. Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội đã chọn.
Kế thừa 20 cây trội được chọn lọc từ 10,5 ha rừng giống tại Hàm Yên Tuyên Quang, đây là 20 cây trội đã được Sở NN&PTNT Tuyên Quang công
nhận là cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống phục vụ trồng rừng. Đề tài tiến
hành chọn 6 cây ưu trội nhất làm cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống.

Cùng với việc nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng. Hiện nay, khi
trồng rừng cây Keo tai tượng thì màu sắc gỗ cũng là tiêu chí ngày càng được
người trồng rừng quan tâm. Cây Keo tai tượng được trồng ở nước ta thì gỗ có 2
màu chính là gỗ màu đen và màu vàng. Thông thường gỗ màu đen có tỷ trọng
cao hơn và sức chịu đựng về cơ lý tốt hơn gỗ màu vàng nên cây có gỗ màu đen
được quan tâm trồng gỗ xẻ và gỗ xây dựng. Tuy nhiên trong công nghiệp giấy và
bột giấy thì gỗ màu đen lại không được ưa chuộng bằng gỗ màu vàng do chi phí
tẩy trắng cao hơn.
Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, đề tài tiến hành xác định màu sắc
của gỗ bằng phương pháp khoan tăng trưởng. Sử dụng khoang tăng trưởng
khoan qua ½ lõi gỗ ở độ cao 1m trên thân cây sau rút phần lõi ra và dùng giấy
giáp đánh bỏ phần nhựa cây và xác định mõi sắc của lõi gỗ.
2.1.2. Xử lý cây mẹ tạo chồi.
Cây trội được xử lý tạo chồi từ khoảng độ cao cách mặt đất từ 4-6m. Với
những cây có cành trong khoảng chiều cao này, cưa cành ở sát thân cây. Với
cây không có cành ở chiều cao này, tạo chồi bằng phương pháp ken cây (bóc
toàn bộ lớp vỏ ½ chu vi thân cây với chiều dài 4-5cm). Sau khi chặt cành hoặc
ken cây, dùng bông thấm đều trên bề mặt vết cắt bằng dung dịch BAP 1%.
2.1.3. Tiêu chuẩn mẫu cấy.
Mẫu được cắt vào buổi sáng (8h-9h) vào những ngày nắng ráo và trước
ngày cắt từ 2-3 ngày cũng nắng, không mưa nhằm hạn chế tỷ lệ mẫu nhiễm
khuẩn. Mẫu nuôi cấy (explants) được lấy ở những chồi sinh trưởng tốt, không
sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá
7


(cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu cấy có chiều dài từ 4-7 cm, chứa 2-3 nách
lá từ lá thứ 3 đến lá thứ 6.
2.1.4. Thử nghiệm tuổi mẫu và mùa lấy mẫu.
•

Tuổi mẫu:
Mẫu được cắt từ chồi ở 5 độ tuổi khác nhau như sau:
Công thức 1: mẫu cấy 4 tuần tuổi.
Công thức 2: mẫu cấy 6 tuần tuổi
Công thức 3: mẫu cấy 8 tuần tuổi
Công thức 4: mẫu cấy 10 tuần tuổi
Công thức 5: mẫu cấy 12 tuần tuổi

•

Mùa cắt mẫu:

Mấu sau khi cắt khỏi cây mẹ đòi hỏi phải có sức sống tốt, tỷ lệ hóa gỗ vừa
phải không quá già cũng không quá non. Do vậy mùa cắt mẫu cũng là yếu tố
quan trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình tạo chồi. Đề tài tiến hành thử
nghiệm lấy mẫu ở các thời điểm vào 2 thời điểm trong năm.
Công thức 7: Lấy mẫu vào vụ hè (tháng 5 đến tháng 7)
Công thức 8: Lấy mẫu vào mùa thu (tháng 8-10)
2.1.5. Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy.
Do mẫu sống nên không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản
chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các
dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit
calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già…vv. Tỉ lệ vô trùng thành
công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng
xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng
đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử
trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để
tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước. Sau đó rửa mẫu bằng nước 3

lần, tiếp tục rửa bằng xà phòng (xà phòng bột) và rửa lại 4 lần bằng nước cất.
8


Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng. Khử
trùng bằng cồn 750 khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng.
Cuối cùng khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% ở các khoảng thời gian khác nhau và
cuối cùng rửa lại bằng nước cất vô trùng.
Các khoảng thời gian khử trùng mẫu cấy bằng HgCl2 0,1%.
Công thức 9: 10 phút
Công thức 10: 12 phút
Công thức 11: 14 phút
Công thức 12: 16 phút
Công thức 13: 18 phút
2.1.6. Thử nghiệm môi trường cơ bản.
Mẫu đã khử trùng được cấy vào ống nghiệm chứa 3 loại môi trường sau có
bổ sung sucrose 30g/l + 5g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.. Ở đây, đề tài
tiến hành bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA nhằm nâng cao hệ số nhân chồi
tạo vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm sau, vì chưa tìm ra nồng độ các chất điều
hòa sinh trưởng thích hợp. Đồng thời đây cũng là nồng độ được một số nghiên
cứu trên thế giới sử dụng và cho hiệu quả nhân chồi tương đối tốt [6]
Công thức 14: Môi trường MS
Công thức 15: Môi trường MS cải tiến.
Công thức 16: Môi trường WPM.
Môi trường tốt nhất được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.1.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh
chồi.
Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi
trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá
trình nhân giống. Chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng mạnh mẽ và quan

trọng nhất trong giai đoạn nhân nhanh chồi đó là các chất thuộc nhóm cytokinin,
hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy mô đều có sử dụng các chất thuộc nhóm này.
Cytokinin thường được sử dụng là BAP.
9


Bổ sung BAP ở mức các nồng độ thay đổi như sau vào môi trường cơ bản
cho hệ số nhân chồi tốt nhất đã chọn được.
Công thức 22: Nồng độ 0,3 mg BAP/l.
Công thức 23: Nồng độ 0,6 mg BAP/l.
Công thức 24: Nồng độ 0,9 mg BAP/l.
Công thức 25: Nồng độ 1,2 mg BAP/l.
Công thức 26: Nồng độ 1,5 mg BAP/l.
2.1.8. Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến nhân nhanh chồi.
Trong môi trường nhân giống in vitro, tỷ lệ cân đối giữa cytokinin /auxin
có ảnh hưởng đến chất lượng của chồi và hệ số nhân chồi [1]. Để tìm hiểu ảnh
hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi trong sự tương tác với BAP và
cũng là để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân nhan chồi. Đề tài tiến hành bổ
sung NAA vào môi trường tốt nhất ở thí nghiệm về ảnh hưởng của BAP đến hiệu
quả nhân chồi với như sau:
Công thức 27: Nồng độ 0,3 mg/l NAA
Công thức 28: Nồng độ 0,6 mg/l NAA
Công thức 29: Nồng độ 0,9 mg/l NAA
Công thức 30: Nồng độ 1,2 mg/l NAA
Công thức 31: Nồng độ 1,5 mg/l NAA
2.1.9. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA và Kinetin đến hiệu quả nhân
nhanh chồi.
Kinetin là một trong những cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy in
vitro nhiều loài cây trồng. Tác dụng phối hợp có hiệu quả giữa BAP và kinetin
đã được một số tác giả nghiên cứu. Sự có mặt của kinetin trong môi trường có

tác dụng kích thích mạnh quá trình tổng hợp diệp lục. Đồng thời, tổ hợp kinetin
và BAP còn có tác dụng làm giảm quá trình lão hoá của chồi. Thông thường khi
đã có mặt của BAP trong môi trường thì kinetin được bổ sung với hàm lượng từ
0,1 mg/l đến 0,5 mg/l [1]

10


Từ môi trường cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất ở thí nghiệm mục 13.3.7.
Kinetin được bổ sung với các nồng độ thay đổi như sau:
Công thức 32: Nồng độ 0,05 mg/l kinetin
Công thức 33: Nồng độ 0,10mg/l kinetin
Công thức 34: Nồng độ 0,15 mg/l kinetin
Công thức 35: Nồng độ 0,20 mg/l kinetin
Công thức 36: Nồng độ 0,25 mg/l kinetin
2.1.10. Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy.
- Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C ( ± 30).
- Độ ẩm trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 55% ( ± 5%).
- Cường độ chiếu sáng từ 1000-3000 lux (mỗi thời điểm khác nhau sử dụng
cường độ chiếu sáng khác nhau).
- Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày.
- pH môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng =6,0.
•

Với các thí nghiệm về khử trùng mẫu cấy, tuổi mẫu và mùa lấy mẫu thì mẫu
được cấy trong ống nghiệm. Đánh giá qua số mẫu sống và nảy chồi. Mỗi
công thức thí nghiệm cấy 60 mẫu (mỗi mẫu cấy vào 1 ống nghiệm).

•

Các thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn môi trường cơ bản, môi trường nhân
chồi mẫu được cấy trong bình tam giác 500ml. Mỗi công thức theo dõi 10
cấy 10, mỗi bình 10 chồi.

•

Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại. Đánh giá kết quả sau
8 tuần nuôi cấy.

2.1.11. Thu thập và xử lý số liệu.
Thu thập các chỉ tiêu.
•
- Khử trùng mẫu.
∑ Mẫu sống
Tỷ lệ mẫu sống (%) = ---------------------x 100
∑ Mẫu đưa vào
11


∑ Mẫu chết
Tỷ lệ mẫu chết (%) = ----------------- ----x 100
∑ Mẫu đưa vào
∑ Mẫu bị nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = -------------------- x 100
∑ Mẫu đưa vào
- Chỉ tiêu về chồi.
∑ Số chồi tạo thành
Hệ số nhân chồi (lần) = ----------------------∑ Số chồi cấy
∑ Chồi hữu hiệu
Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = -------------------- x 100

∑ Chồi tạo thành
Chồi hữu hiệu là những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và
ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus. Ghi tình trạng phát triển
của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những
chồi chết, chồi bị đen.
•

Xử lý số liệu.
-

Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần
mềm Excel.

-

Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm, chúng tôi sử dụng
phương pháp phân tích phương sai một nhân tố bằng phần mềm SPSS
16.0. Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm và tìm ra công thức
thí nghiệm tốt nhất, cụ thể như sau:

Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm
trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là
điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố. Khi giá trị

12


Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa
phương sai tổng thể bằng nhau và ngược lại.
Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, đề tài tiến hành kiểm tra sự sai

khác giữa các công thức bằng tiêu chuẩn LSD. Các công thức sai khác có ý
nghĩa được đánh dấu (*), còn lại là sai khác không có ý nghĩa.
- Phân tích phương sai một nhân tố (Anova)
Giả thuyết Ho: Sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh là không có ý nghĩa (chỉ
tiêu so sánh đồng đều ở các nhân tố kiểm tra)
Giả thuyết H1: Sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh là có ý nghĩa về mặt thống
kê (chỉ tiêu so sánh có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê)
+ Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận
H0 (Sai khác không có ý nghĩa)
+ Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F <0,05 thì chấp nhận H1 (Sai
khác có ý về mặt thống kê).
- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan
Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến
kết quả nghiên cứu. Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia
thành các nhóm khác nhau. Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong cùng
một nhóm sự sai khác không có ý nghĩa.
Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có
nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm
ở giữa 2 cấp. Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ chỉ
tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân tố
kiểm tra không lớn).
2.2.

Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu.

-

Panh, kéo nuôi cấy mô.

-

Thước đo chiều cao, thước đo đường kính, địa bàn.

-

Khoan tăng trưởng

-

Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác.
13


2.3.

Kết quả thực nghiệm và thảo luận.

2.3.1. Chọn cây trội và xác định màu sắc gỗ của cây trội.
Từ 20 cây trội đã được chọn tại rừng giống Hàm Yên - Tuyên Quang (kết
quả chọn cây trội thuộc đề tài cấp Tổng công ty giấy Việt Nam về “Xây dựng
rừng giống, vườn giống Keo tai tượng và Bạch đàn”. Đề tài tiến hành chọn 6 cây
trội có số điểm cao nhất làm cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống. Các đặc điểm
về sinh trưởng, hình thái thân cây của 20 cây trội và 6 cây trội được chọn lọc làm
cây mẹ cung cấp vật liệu nhân giống được thể hiện ở bảng 01 (đặc điểm chi tiết
của 6 cây trội xem phụ biểu 02). 6 cây trội được lựa chọn là cây trội số 1, 2, 3,
11, 13 và cây trội số 14.
Khi đã chọn được 6 cây trội, đề tài tiến hành khoan tăng trưởng và xác
định màu sắc gỗ. Kết quả cho thấy trong 6 cây thì 2 cây có lõi gỗ màu đen là các
cây trội số 3 và cây trội số 6. Còn lại là có lõi gỗ màu vàng bao gồm các cây số
1, cây số 2 , cây số 13 và cây số 14 (xem phụ biểu 01 về hình ảnh thực hiện đề

tài). Từ 6 cây trội đã chọn lọc được đề tài tiến hành ken tạo chồi cung cấp vật
liệu nuôi cấy cho các giai đoạn tiếp theo.

Ảnh 1: Xác định màu sắc lõi gỗ
của cây trội

Ảnh 02: Màu sắc lõi gỗ của
cây trội số 1 và 2

14


Bảng 01. Sinh trưởng của 20 cây trội chọn lọc.
Số hiệu
cây trội

D1.3
(cm)

Dt (m)

Độ
thẳng

Vcây (dm3)

Hvn (m)

Hdc (m)

1

25,0

4,0

60,5

8

1

Trßn

2.874,2

2

25,0

7,0

55,4

5

1

Trßn

2.410,5

3

27,0

12,0

54,1

4,5

1

Trßn

2.485,0

4

27,0

8,5

48,7

4

1

LÖch

2.012,9

5

20,0

9,0

36,3

6

1

LÖch

827,8

6

25,0

12,0

50,3

7

1

LÖch

1.987,6

7

24,5

13,0

50,0

5

1

LÖch

1.923,3

8

25,5

9,5

50,0

4

1

LÖch

2.001,8

9

25,0

10,5

50,0

8

1

LÖch

1.962,5

10

22,0

10,0

49,7

3

1

Trßn

1.705,1

11

25,0

16,0

56,1

4

1

Trßn

2.466,2

12

23,0

7,0

54,1

3

2

LÖch

2.116,9

13

26,0

8,0

44,6

3,5

1

Trßn

1.622,9

14

25,0

9,0

43,0

5

1

Trßn

1.451,0

15

22,0

7,0

43,0

4,5

1

LÖch

1.276,9

16

21,0

11,0

41,7

7

1

LÖch

1.147,7

17

26,0

8,0

43,9

4

1

Trßn

1.576,9

18

25,0

10,0

46,5

5,5

1

Trßn

1.697,1

19

24,4

10,5

48,8

6

1

Trßn

1.824,6

20

25,5

11,0

55,2

8,5

1

Trßn

2.439,8

H×nh
d¹ng t¸n

2.3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ mẫu sống.
Hiện nay, HgCl2 được sử dụng khá phổ biến để khử trùng mẫu trong nhân
giống in vitro các loài thực vật. Do đó đề tài cũng sử dụng HgCl2 0,1% để tiến
hành khử trùng mẫu cấy và thử nghiệm các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra
thời gian khử trùng thích hợp. Đối với các loài Bạch đàn khi khử trùng bằng
HgCl2 0,1% thời gian khử trùng thường là 11 phút. Vì kích thước mẫu của cây
Keo tai tượng lớn hơn rất nhiều so với kích thước mẫu của Bạch đàn (khoảng 3-4

lần) nên đề tài sử dụng 5 công thức thời gian khử trùng mẫu là 10, 12, 14,16 và
18 phút. Sau 8 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 02 và biểu đồ 01.

15


Bảng 02. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả của giai đoạn
đưa mẫu vào in vitro.
Thời
gian khử
Dòng
trùng
(phút)
10

Tỷ lệ
mẫu
nhiễm
(%)
92,2

5,0

2,8

12

84,4

11,1

4,4

14

51,7

38,3

10,0

16

43,3

41,1

18

18,3

10

Dòng
1

Dòng
2

Dòng

3

Tỷ lệ
mẫu
chết
(%)

Tỷ lệ
mẫu
sống
(%)

Thời gian
khử trùng
(phút)

Tỷ lệ
mẫu
nhiễm
(%)

10

92,8

3,9

3,3

12

83,9

11,7

4,4

14

50,0

40,6

9,4

15,6

16

41,7

43,3

15,0

76,7

5,0

18

16,7

79,4

3,9

88,4

8,7

2,9

10

80,0

17,2

2,8

12

80,1

15,5

4,4

12

71,7

23,3

5,0

14

51,3

39,0

9,7

14

49,4

41,7

8,9

16

39,5

44,9

15,6

16

33,3

51,1

15,6

18

16,4

79,4

4,2

18

12,8

82,8

4,4

10

88,9

8,9

2,2

10

88,3

9,4

2,2

12

80,6

16,1

3,3

12

78,9

16,7

4,4

14

48,9

42,2

8,9

14

45,0

44,4

10,6

16

36,7

50,0

13,3

16

36,7

45,0

18,3

18

16,7

78,9

4,4

18

11,7

84,4

3,9

Dòng

Dòng
6

Dòng
13

Dòng
14

Tỷ lệ
mẫu
chết
(%)

Tỷ lệ
mẫu
sống
(%)

Biểu đồ 01: Tỷ lệ mẫu sống ở các công thức khử trùng mẫu

Tỷ lệ mẫu sống

20,0
15,6
15,0
9,7

10,0
5,0

2,9

4,4

4,2

0,0
10 phút

12 phút

14 phút

16 phút

18 phút

Thời gian khử trùng
16


Bảng 02 cho thấy: tỷ lệ mẫu sống của cả 6 dòng đều đạt cao nhất ở thời
gian khử trùng 16 phút. Tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 18,3% ở dòng số 14 và thấp
nhất là 13,3% ở dòng số 3. Điều này cho thấy chồi của dòng số 14 có sức sống
tốt nhất và cho hiệu quả tạo chồi tốt nhất trong số các dòng nghiên cứu. Tuy
nhiên sự khác nhau này là không đáng kể.
Bảng 02 và biểu đồ 01 cũng cho thấy giai đoạn cấy mẫu in vitro cây Keo
tai tượng cho tỷ lệ mẫu sống tương đối thấp, tỷ lệ mẫu sống trung bình ở các
dòng với thời gian khử trùng 16 phút đạt 15,6%. Tỷ lệ mẫu sống tăng dần theo
các khoảng thời gian 10 phút, 12 phút, 14 phút, cao nhất ở 16 phút và giảm mạnh
ở khi khử trùng với thời gian 18 phút. Kết quả phân tích phương sai cho thấy, 5
công thức thí nghiệm về khử trùng mẫu có sự sai khác rõ rệt về mặt thống kê với
độ tin cậy 95% (phụ biểu 4.1).
So với một số kết quả trên thế giới, ở đây tỷ lệ sống của mẫu cấy thấp hơn
đáng kể [9, 12]. HgCl2 là chất khử trùng bề mặt và độc tính cao đối với mô nuôi
cấy trong khi đó mẫu cấy có kích thước tương đối lớn (1-2mm) nên khi khử
trùng với thời gian ngắn thì tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao. Ngược lại, nếu kéo dài thời
gian khử trùng mẫu sẽ bị chết khô nhiều.
Do vậy để nâng cao tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi của giai đoạn này cần thử
nghiệm phối hợp với một số chất khử trùng khác như Calci hypochlorit, Natri
hypochlorit hoặc một số chất kháng sinh khác.
2.3.3. Thử nghiệm và lựa chọn môi trường cơ bản cho nhân nhanh chồi.

Để một nghiên cứu về nhân giống in vitro thành công thì một trong những
giai đoạn quan trọng trước hết là xác định được môi trường cơ bản thích hợp. Ở
đây đề tài tiến hành nuôi cấy trên 3 môi trường là MS, MS cải tiến và môi trường
WPM bổ sung sucrose 30g/l + 5g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA thường
được sử dụng để nhân giống các loài cây thân gỗ, trong đó môi trường MS đã
được một số tác giả trên thế giới sử dụng nuôi cấy mô cây Keo tai tượng [ 7].

17


Kết quả nghiên cứu cho thấy 6 dòng đều có phản ứng tương tự nhau đối
với 3 loại môi trương nuôi cấy, với cả 6 dòng thì môi trường MS đều cho hệ số
nhân chồi cao nhất. Kết quả được trình bảy ở bảng 03 (thành phần 3 loại môi
trường xem phụ biểu 03).
Bảng 03. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân chồi của 6
dòng.
Dòng

Dòng 1

Dòng 2

Dòng 3

Môi
trường
MS
MS*
WPM
MS

MS*
WPM
MS
MS*
WPM

Hệ số nhân
chồi (lần)
0,93
0,83
0,77
0,98
0,83
0,86
0,80
0,71
0,72

Dòng

Dòng 6

Dòng 13

Dòng 14

Môi
trường
MS
MS*

WPM
MS
MS*
WPM
MS
MS*
WPM

Hệ số nhân
chồi (lần)
1,04
0,89
0,83
0,99
0,87
0,85
1,12
0,93
0,78

Bảng 03 cho thấy, môi trường MS cho hệ số nhân chồi cao nhất ở cả 6
dòng nghiên cứu (dòng 1 là 0,93 lần, dòng 2 là 0,98 lần; dòng 3 là 0,8 lần; dòng
6 là 1,04 lần, dòng 13 là 0,99 lần và 1,12% với dòng 14). Sau đó là môi trường
MS cải tiến và tiếp đến là môi trường WPM.
Môi trường khoáng MS là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để
nuôi cấy các loài thực vật nói chung và thích hợp cho nhiều loài khác nhau. Môi
trường này không những được sử dụng trong nuôi cấy chồi mà còn được sử dùng
trong nuôi cấy tế bào lát mỏng, tế bào đơn, nuôi cấy phôi…vv [6]. Kết quả này
cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về nuôi cấy Keo tai tượng trên thế
giới. Để kiểm tra xem sự khác biệt về hệ số nhân chồi thu được, đề tài tiến hành

phân tích phương sai một nhân tố kết quả thu được như sau:
Kết quả ở bảng phân tích phương sai (phụ biểu 4.2) cho thấy giá trị Sig của
F < 0.05 rất nhiều. Do đó, hệ số nhân chồi ở các môi trường nuôi cấy đã có sự sai
khác rõ rệt về mặt thống kê.
18


Để xác định môi trường cho hệ số nhân chồi nhân chồi cao nhất, đề tài tiến
hành phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan, kết quả được thể hiện ở bảng 04. Từ
bảng 04 cho thấy với 6 dòng Keo tai tượng nghiên cứu thì môi trường MS là môi
trường cơ bản thích hợp nhất và có sự sai khác rõ rệt về mặt thống kê so với 2
môi trường còn lại. Đề tài chọn môi trường MS có bổ sung 30g/l sucrose + 4,5
g/l agar, pH=6 cho các thử nghiệm tiếp theo.
Bảng 04: Phân nhóm về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến hệ số nhân
chồi.
Môi trường

Phân nhóm hệ số nhân chồi

Số lần lặp

1
Duncana

WPM
MS*
MS
Sig.

18

18
18

Ảnh 03: Từ trái qua phải: Mẫu cấy ở các môi
trường cơ bản WPM, MS và MS cải tiến

2
0,8006
0,8439
0,145

0,9789
1,000

Ảnh 04: Mẫu cấy ở môi trường MS

19


2.3.4. Ảnh hưởng tuổi mẫu đến hiệu quả của quá trình đưa mẫu vào in vitro.
Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào gồm 3 giai đoạn là:
giai đoạn đưa mẫu vào in vitro (đưa mẫu từ ngoài tự nhiên vào ống nghiệm); giai
đoạn nhân nhanh chồi và giai đoạn ra rễ. Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro có ảnh
hưởng quan trọng đến thời gian của toàn bộ quá trình nuôi cấy. Đặc biệt đối với
các nghiên cứu thử nghiệm khi đưa mẫu vào đạt được hiệu quả tốt mới tạo được
vật liệu khởi đầu đủ lớn phục vụ cho các thử nghiệm tiếp theo.
Trong giai đoạn đưa mẫu vào in vitro thì tuổi mẫu cấy là nhân tố quan
trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình này. Tuổi mẫu thích hợp quyết định
đến tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi. Trong giâm hom cây Keo tai tượng người ta
thường lấy hom có độ tuổi từ 4 đến 6 tuần, vì vậy ở đây đề tài tiến hành thử

nghiệm 5 công thức về tuổi mẫu. Mẫu được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong
thời gian 16 phút và cấy vào môi trường MS. Đánh giá tỷ lệ mẫu sống và nảy
chồi ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy. Kết quả về ảnh hưởng của tuổi mẫu đến hiệu
quả của quá trình nhân nhanh chồi được thể hiện ở bảng 05.
Kết quả bảng 05 cho thấy cấy mẫu in vitro ở 6 tuần tuổi cho tỷ mẫu sống
và nảy chồi tốt nhất trong các công thức thí nghiệm. Với mẫu ở 6 tuần tuổi, tỷ lệ
mẫu sống biến động từ 13,9% (dòng số 2) đến 21,7% (dòng số 14). Sự khác biệt
về tỷ lệ mẫu sống ở các độ tuổi khác nhau được thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 02.
Bảng 05. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến giai đoạn tạo chồi của 6 dòng Keo tai
tượng.
Tuổi mẫu
(tuần)

Tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi (%)

4

Dòng 1
15,0

Dòng 2
11,7

Dòng 3
14,4

Dòng 6
15,0

Dòng 13

15,6

Dòng 14
16,7

6

20,0

13,9

18,3

17,2

17,8

21,1

8

10,6

10,6

10,6

12,2

11,1

12,2

10

7,2

6,1

7,2

7,8

7,2

6,7

12

5,0

4,4

5,6

4,4

3,9

4,4

Biểu đồ 02 cho thấy, tỷ lệ mẫu sống bình quân cho các dòng tăng từ 4 tuần
tuổi đến 6 tuần tuổi và đạt cao nhất độ tuổi này (18,1%). Khi tuổi mẫu càng tăng
thì tỷ lệ sống càng giảm và thấp nhất ở 12 tuần chỉ đạt 4,6%.

20