tìm hiểu về quy trình sản xuất ezyme amylase từ Aspergilus Oryzae trong thực phẩm

Phần I: Mở đầu
1.Mục tiêu đề tài :
Hàng năm có khoảng 300000 tấn enzyme được sản xuất trên toàn thế giới.
Để sản xuất hiệu quả và tiết kiệm chi phí, ta có thể sãn xuất enzyme thừ những
nguồn phế thải như trấu, cám gạo, bã mía …trong ngành thực phẩm nói riêng,
enzyme amylase có vai trò vô cùng to lớn trong việc sãn xuất ra các sãn phẩm thực
phẩm. Đó củng là lý do mà em thực hiện đề tài “tìm hiểu về quy trình sản xuất
ezyme amylase từ Aspergilus Oryzae trong thực phẩm”
2.Nhiệm vụ:
Tìm hiểu về enzyme amylase và nấm mốc aspergilus,nguyên liệu, và quá
trình sản xuất enzyme amylase từ Aspergilus Oryzae.Tìm hiểu ứng dụng của nó
trong nghành thực phẩm.
3.Ý nghĩa thực tế và các vấn đề liên quan:
Trong ngành thực phẩm nói chung, và ngành chế biến tinh bột, đường nói
riêng. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng
nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở
đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng
như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid…
Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá
và giai đoạn đường hoá. Trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ


Đồ án thực phẩm
phân tinh bột bằng acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã
sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4... Nhưng thực tế, thuỷ phân bằng acid rất
khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp
ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để
thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Amylase được dùng để thay thế acid ngày càng mang tính quy mô công
nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt
cao mà không bị mất hoạt tính.Chẳng hạn như amylase được tách từ vi sinh vật, cụ

thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ suối nước nóng. Ngoài ra,
amylase có nhiều ưu điểm hơn so với sử dụng acid để thủy phân tinh bột: năng
lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá
trình tinh sạch dịch đường.
Amylase có thể lấy từ nguồn mầm thóc, mầm đại mạch, hạt bắp nảy mầm,
nấm mốc …
Nguyên liệu sản xuất là gạo, bắp, khoai mì.đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền
và dể kiếm ở nước ta.Do đó,đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ
sở phát triển cho nhiều ngành công nghiệp khác phát triển như sản xuất bánh
kẹo,bia,cồn,siro,chất làm mềm vải …

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
2


Đồ án thực phẩm

Phần 2:Nội dung đề tài
Chương I: Tổng quan lý thuyết
1.1Tổng quan về nấm mốc Aspergilus Oryzae
Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào vi sinh vật trong môi trường,
quá trình này xảy ra trong diều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp.
Bản chất của hai quá trình này có thể nói như nhau nhưng về mặt hình thức và
phương diện khác thì khác nhau hoàn toàn.
Quá trình lên men trong tự nhiên là một quy luật sống còn của vi sinh vật. Tự
tham gia tổng hợp chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên, các vi sinh vật
và các vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng
đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được
kiểm soát, nhiều pha lên men và không định hướng. Sản phẩm lên men đa dạng,

không ổn định, do đó chất lượng lên men kém và không đồng nhất.
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu từ phân lập
giống vi sinh vật, cơ chất, pH, nhiệt độ, độ ẩm …các quá trình phản ứng sinh học,
quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn. Sản phẩm
tạo ra có định hướng rỏ ràng ngay từ khâu chọn giống vi sinh vật cho đến cuối quá
trình thu nhận sản phẩm. Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện rất nhiều.
1.1.1: Vai trò của chọn giống trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:
− Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
− Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (Trong công
nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định).
− Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
− Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt
tính enzyme).
−
Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
−
Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
3


Đồ án thực phẩm

1.1.2: Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được
sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật dung trong công nghệ
enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:

−

Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn, sản
phẩm này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ
khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh
chất gấp hàng nghìn lần khối lượng cơ thể mình trong một khoảng thời
gian cực kỳ ngắn, thì cơ thể vi sinh vật cần phải tổng hợp nhiều chất. Do
đó sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác nhau. Chính vì thế, giống vi
sinh vật dung trong sản xuất một loại sản phẩm nào đó, thì sản phẩm
này phải trội hơn các sản phẩm khác về cả số lượng và chất lượng.

− Giống vi sinh vật cần phải cho năng suất sinh học cao.
−

Giống vi sinh vật phải có khả năng thích nghi và phát triển mạnh
trong điều kiện sản xuất công nghiệp.

−

Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ
tiền và dể kiếm tại địa phương nơi nhà máy hoạt động.

− Giống vi sinh vật sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là
những giống vi sinh vật thuần khiết và tốc độ sinh sản nhanh.
− Tốc độ trao đổi chất mạnh mẽ để nhanh chóng tạo ra sãn phẩm mong
muốn, và dể dàng tách sản phẩm ra khỏi những tạp chất môi trường và
sinh khối vi sinh vật giống.
− Giống vi sinh vật phải ổn định trong điều kiện bảo quản và dể dàng bảo
quản.
=> Để tạo điều kiện thuận lợi nhất về chủng Giống vi sinh vật cung cấp cho

quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần
khiết.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
4


Đồ án thực phẩm
1.1.3 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergilus Oryzae
Aspergilus Oryzae là một loại nấm mốc thuộc bộ Plectascales,lớp comycetes
( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ bao gồm những sợi rất mảnh,
phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều tế bào. Từ những sợi
nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có
những cơ quan sinh sãn vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergilus Oryzae thường
dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường, phía cuống đính bào tử phòng
lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành các tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành các bào tử đính
vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergilus Oryzae có màu vàng
lục hoặc màu vàng hoa cau …

Hình 1.1 nấm mốc Aspergilus Oryzae

Đặc điểm của giống Aspergilus Oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào
và thủy phân ngoại bào như amylase, protease, pectinasa…Ta rất hay gặp chúng ở
các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa
sạch, ở cặn bã bia, rượu, ở lỏi ngô, bã sắn…Chúng mọc và phát triển có khi thành
lớp mốc, màu đen, vàng…Màu này được quyết định bởi các bào tử già có màu

_____________________________________________________________

Svth: Trần Đình Mạnh
5


Đồ án thực phẩm
sắc. Các bào tử này dể bị gió cuốn đi xa và có thể rơi ở bất cứ đâu, khi gặp điều
kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới .
1.1.4: Quá trình phân lập giống vi sinh vật
Vi sinh vật phân bố rộng trong tự nhiên, từ nơi có địa hình bình thường đến
nơi có địa hình phức tạp, ở đâu củng có vi sinh vật. Ở những nơi giàu chất hữu cơ,
trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thể người, động vật, nơi nhiệt độ
cao nhất đến nơi có nhiệt độ thấp nhất. Vi sinh vật có khả năng thích ứng trong
mọi môi trường. Chính vì khả năng tuyệt vời này mà vi sinh vật có thể tồn tại
trong những điều kiện khắc nghiệt nhất.
Thông thường, để phân lập một giống vi sinh vật nhằm thu nhận enzyme ta
có thể dung ba cách phân lập:
−

Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

−

Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

−

Phân lập giống từ mẩu giống đã hỏng

Tùy vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập sao
cho có hiệu quả nhất. Mổi cách phân lập đều có những ưu điểm khác biệt:

1.1.4.1: Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
Trong điều kiên tự nhiên, vi sinh vật để có thể tồn tại và thích ứng nhanh thì
vi sinh vật cần phải có khả năng sinh tổng hợp thập nhiều loại enzyme, để chuyển
hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều
này không phù hợp để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp với loại enzyme
có hoạt tính mạnh.
Do phát triển trong điều kiện tự nhiên nên vi sinh vật phải đối phó cùng lúc
với hàng loạt tác nhân ngoại cảnh và phải phân giải hàng loạt chất khác nhau. Nên
vi sinh vật phải tổng hợp nhiều loại enzyme trong một lúc với tốc độ nhanh.
Ở điều kiện tự nhiên và trong sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng
kể giữa khả năng sinh tổng hợp enzyme của các giống vi sinh vật. Các vi sinh vật
sinh tổng hợp được trong điều kiện tự nhiên được gọi chung là vi sinh vật hoang

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
6


Đồ án thực phẩm
dại. Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của tự nhiên. Khi chúng
ta đưa vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định,
đòi hỏi các loài vi sinh vật giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản
xuất công nghiệp. Tập cho chúng thích nghi với điều kiện trong sản xuất công
nghiệp là một điều cần thiết.
Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài vi sinh vật, vi
sinh vật trong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra thường biến và đột biến. Những đột
biến thường cho ra hai hiệu ứng: một là gây cho các cá thể chết, hai là nhiều đột
biến tạo ra các loài vi sinh vật mới có khả năng sinh tổng Các loài vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ở môi trường cơ
chất tương ứng. Dựa vào đặc điểm này chúng ta có thể dể dàng xác định vị trí cần

phân lập loài vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme mà chúng ta cần.
ta Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao,
ta phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV
có khả năng sinh tổng hợp amylase cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein trong tự
nhiên.
hợp enzyme rất cao. Việc gây ra những đột biến này rất có ý nghĩa và cần
tiến hành. Những đột biến kiểu này thường bền vững, rất thích hợp để đưa vào sản
xuất ở quy mô công nghiệp.
1.1.4.2: Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với
điều kiện môi trường sản xuất. Nhờ đó sau khi phân lập, các giống này không cần
qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã
được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen. Và có những đặc điểm sinh hóa
hơn hẳn những giống vi sinh vật hoang dại.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
7


Đồ án thực phẩm
Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất ( trong dịch lên men, dịch
nước thải, chất thải của quá trình lên men ) thường rất cao. Do đó, khả năng thu
nhận được những chủng vi sinh vật có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.
1.1.4.3: Phân lập giống trong những mẫu giống đã hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm trong quá trình bảo quản. do bị nhiễm, có thể
rất nhiều tế bào giống vi sinh vật bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào vi sinh
vật chưa bị thoái hóa. Việc phân lập lại từ loại giống này có thể đạt được những
kết quả tốt.

1.1.5: Quá trình phân lập nấm mốc Aspergilus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase. Ở nấm mốc, nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzim
amylase là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực
tiếp từ nhà cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của giống mua là thời gian bảo
quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình
phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc
bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm.
Quá trình lấy mẩu: có thể lấy từ mẩu đất ẩm khoảng 100g hoặc mẩu lấy từ
khoai tây cắt lát đem chon xuống đất . Khoảng 8 ngày thì đào lấy nhưng lát khoai
tây lên,rủ sạch đất cát bám trên bề mặt khoai.
Tiến hành phân lập :
−

Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây

−

Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây đã nghiền cho vào 90ml
nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu

−

Dùng pipet hút 10ml dung dịch mẫu ban đầu cho vào 1 ống
nghiệm khác chứa 90ml nước cất vô trùng

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
8

Đồ án thực phẩm
−

Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10 -3,10-4 ở những ống nghiệm
tiếp theo.

−

Hút 0,1ml cho vào đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng chọn
lọc cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA

(Potato

Dextro

Agar)
−

Dùng que trải, trải đều chất dinh dưỡng trên bề mặt môi trường,
đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày.

−

Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chổ này
sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh thể lạc.

−

Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước

khi cấy. Có tác dụng làm chất chỉ thị cho tinh bột.

−

Cấy truyền những nấm mốc đặt trưng trong môi trường PDA
trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong
72h, sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông.

Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi
trường sinh trưởng của nấm.
KH2PO4
NH4NO3
KCl

1,4
10
0,5

MgSO4.7H2O
FeSO4.7H2O
Hồ tinh bột

0,1
0,01
20

pH=6,5

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
9


Đồ án thực phẩm
Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi
Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem
ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống
thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả
cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.
1.1.6: Phương pháp bảo quản
Mục đích bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sãn xuất enzyme là đảm bảo
tính ổn định trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, và tính ổn định của các hoạt
tính của các enzyme. Sau đây là một số phương pháp bảo quản:
−

Cấy truyền và bảo quản lạnh: dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật
sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong điều kiện lạnh, trong một
khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này vi sinh vật bảo tồn
được khả năng sinh tổng hợp enzyme.

− Bảo quản giống trong đất hoặc cát: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm
thấp, vi sinh vật có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong
thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp để bảo quản giống mốc
Aspergilus Oryzae
− Bảo quản giống trong hạt ngủ cốc: Bào tử nấm mốc được dữ trong hạt
ngủ cốc đã được xử lý nhiệt có độ ẩm < 8 %, và giữu được khả năng
sinh tổng hợp enzyme trong một khoảng thời gian dài .

1.2 Tổng quan về enzyme amylase
1.2.1 Enzyme amylase là gì
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong tự nhiên.Enzyme này thuộc
nhóm enzyme thủy phân, xúc tác và phân giải nội phân tử trong nhóm
Polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R’ +

H-OH



RH

+

R’OH

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
10


Đồ án thực phẩm

Có 6 loại enzyme được xếp thành 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào)
và Exoamylase (enzyme ngoại bào)
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme
khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase ( hay α–
dextrin6-glucosidase ); khử gián tiếp là Transglucosylase( hay oligo-1,6glucosidase) và Maylo-1,6-glucosidase.Các enzyme này thủy phân các liên kết bên
trong của chuỗi Polysaccharide.

Exoamylase gồm có β-enzyme và γ-enzyme. Đây là những enzyme thủy
phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi Polysaccharide.
=> Cơ chế tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
Tinh bột:
Là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu ở trong các loại củ như khoai
lang, khoai tây , khoai mì … trong các loại hạt ngũ cốc , các loại hạt và có công
thức tổng quát là (). Các loại tinh bột đều C 6H12O12)n . Tinh bột từ mọi nguồn khác
nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940có 20-30% amylase
và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng
lượng quan trọng.
−

Amylase có trọng lượng phân tử từ 50000 đến 160000 Da , được
cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4glusoside tạo thành một mạch nhánh dài không phân nhánh

− Amylopectin có khối lượng phân tử từ 400000 đến hang chục triệu Da,
được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết
α-1,4-glusoside và α-1,6-glusoside tạo thành mạch có nhiều nhánh, tinh
bột không tan trong nước lạnh nhưng khi đun nóng đến 60 o-85oC thì
tinh bột sẽ bị hồ hóa gọi là hồ tinh bột. Dưới tác dụng của enzyme
amylase, tinh bột sẽ bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt.
Sự thủy phân tinh bột do amylase xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
11


Đồ án thực phẩm
đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sãn phẩm trung gian là

dextrin, và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sãn phẩm là maltose và
glucose.
− Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng
cho cơ thể con người. Rau và quả củng là nguồn cung cấp tinh bột, một
phân tinh bột này đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose .
Cabohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm, cung cấp đường
và tinh bột.
Glycogen :
Là một loại Cabohydrate dự trữ, ở động vật được dự trữ trong cơ thể và
chuyển hóa từ từ để sử dụng. Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với
nhau bởi lien kết α-1,4-glusoside ở các vị trí phân nhánh và α-1,6-glusoside .
Glycogen có nhiều mạch hơn tinh bột, phân tử khối khoảng 2000000 đến 3000000
Da. Glycogen dể tan trong nước, nếu chúng ta ăn thức ăn có quá nhiều thì cơ thể
chúng ta sẽ dự trữ dưới dạng chất béo chủ yếu ở trong gan.
1.2.2: Đặc tính của enzyme α-amylase
Enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác
nhau, mỗi loại enzyme α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng.
Enzyme α-amylase là một protein giàu tyrosine, ryptophan, acid glutamic và
aspartic . Các acid glutamic và acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino
acid cấu thành nên phân tử enzyme:
− α-amylase có ít methionine và có khoảng 7 đến 10 gốc cysteine
− Trọng lượng phân tử α-amylase nấm mốc khoảng 45000 đến 50000 Da
− α-amylase dể tan trong nước, dung dịch muối loãng và rượu loãng
− Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globoline.
− Điểm đẵng điện của α-amylase nằm trong khoảng pH= 4,5-5,7
− α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-3
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh

12


Đồ án thực phẩm
tham gia hình thành và cấu trúc nguyên tử bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt
động của enzyme (Modolova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự
tồn tại của emzyme khi bị tác dụng của các tác nhân gây biến tính và tác
động của các enzyme phân giải protein. Nếu α-amylase bị loại bỏ hết Ca
thì nó sẽ bị mất hoàn toàn khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với
nhiệt hơn các enzyme khác đặc tính này có lẻ liên quan đến hàm lượng Ca
trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi
các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như Zn 2+, Cr3+,
Li+, Mn2+, Na+, Co2+, Sn2+ không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase.
Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau
(g/100g

protein):

alamine

=6,8;

glycine=6,6;

valine=6,9;

leusine=8,3;

Isoleusine=5,2; prolin= 4,2; phenylalanine=4,2; tyrosine= 9,5; trytophan=4; xetin=
6,5; trionin=10,7; cystein + cystine = 1,6; glutamic acid = 6,9; amide=1,5

( Akabory et amiloza, 1954 ). Không giống các α-amylase khác, amylase của
Aspergilus Oryzae có chứa thành phần phi protein là polysacchalide. Polyose này
bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hesozamin trên 1 mol enzyme
(Akabory et amiloza,1965). Vai trò của polyose này vẫn chưa rỏ, nhưng đã biết
được rằng nó tham gia vào phần trung tâm hoạt đọng và nằm phía trong phân tử
emzyme.
α-amylase của nấm mốc hầy như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị tổn
thương.Sãn phẩm cuối cùng là glucose và maltose. Đối với sợi nấm thì tỷ lệ
là 1:3,97 ( Hanrahan, Caldwell,1953).
α-amylase của sợi nấm không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của
amylopectin , nên khi thủy phân nó sẻ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh.
Đây là một cấu trúc tinh bột do enzyme α-amylasephân cắt tạo thành dextrin tới
hạn phân nhánh.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
13


Đồ án thực phẩm

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase, nấm
sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi nồng độ α - amylase vi sinh vật
tương đối có thể chuyển hóa 70 – 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α –
amylase của nấm mốc thì mức độ đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống
nhau. PH tối thích cho hoạt động của α – amylase từ nấm sợi là 4,0- 4,8 (có thể
hoạt động tốt trong vùng ph từ 4,5-4,8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho
hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm từ amylase từ Asp.oryzea
trong vùng 5,6- 6,2. Còn số liệu của Fnixova thì pH tối thích cho hoạt động

dextrin của nó là 6,0- 7,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α – amylase của
Asp.oryzea bền vững đối với các acid hơn là α – amylase của malt và vi khuẩn
Bas.sublitis. Ở pH 3,6 và 00 C, α – amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 1530 phút ; α – amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α –
amylase của nấm sợi không giảm là bao nhiêu. Trong dung dịch α – amylase nấm
sợi bảo quản tốt ở pH =5,0- 5,5; α – amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
14


Đồ án thực phẩm
chịu đựng pH từ 2,5- 2,8. Ở nhiệt độ 0 0C và pH = 2,5, nó chỉ bất hoạt hoàn toàn
sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác α – amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α – amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động
nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C.
Trong dung dịch đệm pH = 4,7 thì α – amylase của Asp.oryzea rất nhạy
cảm với tác động ở nhiệt độ cao, thậm chí ở nhiệt 40 0C trong vòng 3 giờ hoạt lực
dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27- 85%. Ở 50 0C
trong vòng 2 giờ, α – amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và
cộng sự )
1.2.3 Cơ chế tác dụng của α-amylase :
Enzyme α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glusoside nằm ở
bên trong các phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glucogen ) một cách ngẫu nhiên,
không theo bất cứ một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột
mà nó còn thủy phân các hạt tinh bột nguyên nhưng với tốc độ rất chậm. Quá trình
thủy phân tinh bột bởi α-amylase là một quá trình đa giai đoạn :
− Ở giai đoạn đầu (dextrin hóa ) chỉ có một số phần tử cơ chất bị thủy

phân thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( α-dextrin ). Độ nhớt
của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch
hóa nhanh ).
− Giai đoạn 2 (đường hóa ) : các dextrin phân tử thấp tiếp tục phân hủy
thành các tetra-trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất chẩm bởi αamylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của αamylase, amylose bị phân hủy khá nhanh thành oligosaccharide gồm 67 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt
amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1).
− Giai đoạn 3 : các oligosaccharide bị phân cách tạo nên các mạch
polyglucose collagen cứ ngắn dần , và bị phân giải châm đến

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
15


Đồ án thực phẩm
maltotetrose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài , sản phẩm thủy
phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose.Tác dụng của αamylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng không vì phân cắt
liên kết α -1,6 glycoside ở chổ mạch nhánh trong phân tử amylopectin
nên dù có tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên
(72% maltose và 19% glucose), còn có dexin phan tử thấp và isomaltose
8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase , tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose , maltose , glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường
thì α-amylase thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không màu
với Iot và một ít maltose . Khả năng dextrin hóa cao là tính chất đặc trưng của αamylase. Vì vậy người ta thường gọi amylase này là amylase dextrin hóa hay
amylase dịch hóa.
1.2.4: Lịch sử phát hiện enmyme: Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên
cứu đã tách được các các chất gây ra quá trình lên men.
Năm 1814, Kirchoff đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả
năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường . Đây là công trình đầu

tiên thu được chế phẩm ở dạng dung dịch và lịch sử của ngành enzyme học được
bắt đầu từ đây.
Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Fessoz đã chứng minh
chất làm phân giải tinh bột thành đường có thể tách ở dạng bột. Thí nghiệm được
tiến hành bằng cánh cho etanol vào dung dịch chiết của hạt đại mạch nảy mầm thì
thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa này có thể chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa
này sẽ mất khả năng chuyển hóa.
1.3: Công nghệ lên men tạo enzyme α-amylase :
1.3.1: Giới thiệu pương pháp lên men bề mặt

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
16


Đồ án thực phẩm
Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện
theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ
để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng
sinh và một số quá trình lên men truyền thống.
1.3.1.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát
triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
− Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không
phức tạp.
− Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất
nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng
trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển
mạnh trở lại.
− Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối

VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo
quản.
− Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc
vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn
kém.
− Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường
đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm
ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu
vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc
phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy
nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương
pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi
trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
17


Đồ án thực phẩm
a) Môi trường lỏng
Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành
khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV
sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O 2 từ không khí, tiến hành
quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa
tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy
bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm,
chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho

thuận tiện trong thao tác.
Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao
môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh
dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành
phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao.
Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong khay nuôi cấy
có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.
b) Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme,
người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không
khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để
làm môi trường.
Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất
dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
18


Đồ án thực phẩm
Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme
nội bào nằm trong sinh khối VSV.
VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn
( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt
môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp
cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại,
không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá
sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm
khoảng 55-65% W là hợp lý.

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme,
người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận
lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
bán rắn (môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae.
1.3.2: Sản xuất nấm mốc giống – tạo sinh khối
1.3.2.1: Nguyên liệu cho sản xuất giống mốc
Gạo nếp : nước 14%; Glucid 79,4%; Lipid 1,5% và Protein 8,2% trong đó
protein của gạo nếp chủ yếu là glutein ( oryzaine ) và glubuline, ngoài ra còn có
một ít cozine và prolamin.
Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.
Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, ngoài ra còn có một số vitamin như B1,
B2, B6,PP và E.
Gạo tẻ : nước 13,84%; glucid 77,55%; protein 7,35%; lipit 0,52%; cellulose
0,18% và muối khoáng 0,54%.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
19


Đồ án thực phẩm
Bột mì : nước 11,6%; glucid 72% ;lipit 4,8%; protein 9%; cellulose 1,5%;
muối khoáng 1,2%.
Bắp mảnh : nước11,4%; glucid 87,9%; lipit0,8%; protein 8,5%;
cellulose0,4%; muối khoáng 0,4%.
1.3.2.2: Chuẩn bị mốc giống
Nuôi cấy giống bao gồm:
− Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm.
− Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ).
− Trên sàng, khay (nhân giống lớn).

a) Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng
Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển
những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác. Yêu cầu ống
giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV
nào khác. Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng.
Tiếp tục nhân giống và nuôi cấy cho đến khi đạt được sinh khối theo mong
muốn.
b) Nuôi cấy trong bình tam giác
Cách làm trong môi trường bình tam giác:
Môi trường gạo tẻ: gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như bình thường, hạt cơm chín
đều không bị nhão và không quá khô. Độ ẩm khoảng 45%, để nguội rồi bóp rời

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
20


Đồ án thực phẩm
từng hạt. Cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút bình tam giác
bằng nút chống ẩm, hấp thanh trùng ở P= 1atm trong vòng 30-45 phút.
Môi trường mảnh ngô: ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm, cho
nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay trong khoảng
1-2h để nước ngấm đều. Sau đó, bóp tơi và cho vào bình tam giác một lớp dày
khoảng 1cm, đậy nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm
chín ở P= 1atm, 120oC, trong thời gian 60 phút. Lấy ra để nguội và lắc cho khỏi bị
vón cục.
Môi trường cám: chọn cám tốt, mới nhưng loại thô, không cần mịn hạt. Sau
đó làm tương tự như mảnh ngô.
Thường sử dụng các bình tam giác có dung tích 0,3-0,5 lít hay 1lít có cổ

rộng. Sau khi đã chuẩn bị môi trường trong bình thủy tinh, ta tiến hành nuôi cấy
nấm mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị 5ml nước vô trùng cho vào các ống
nghiệm. Sau đó, đổ thêm nước vô trùng để hòa tan bào tử đồng thời cấy truyền
chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy truyền cho 23 bình tam giác dung tích 1 lít. Lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và
tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng, thường nuôi trong 5-6 ngày là
được. Yêu cầu cơ bản của giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử khỏe
mạnh, trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải bỏ ngay.
c) Nuôi cấy mốc trên khay
Chuẩn bị môi trường làm nấm mốc trên khay: nguyên liệu thường dùng là
ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5 mm, trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng
so với ngô nếu hấp ở áp suất cao. Trộn xong thì để khoảng 3-4 giờ để ngấm nước
đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4h, lâu hơn so với cám và gạo. Nguyên

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
21


Đồ án thực phẩm
liệu sau khi hấp chín đều, không được quá bết hay quá khô. Độ ẩm còn lại khoảng
45-50% là vừa.
Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: nguyên liệu được dở ra và làm nguội
nhanh, nếu ít thì có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều quá thì dùng máy đánh
tơi và quạt để làm nguội. Sau khi làm nguội đến 26-28 oC thì trộn nước giống từ
bình tam giác theo tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn.
Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao 30cm. Đặt ở nhiệt
độ 30-32oC, ẩm ở 85-100%. Thời gian ủ là 6-8h, nhiệt độ khối môi trường lên tới
34-36oC và bào tử đã nảy mần gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này cần rải
môi trường thành lớp mỏng 2-3cm, cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt
quá 36oC . Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất trong khoảng 10-14 giờ sau khi trộn

giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải
điều chỉnh nhiệt độ lên 34-35oC, để duy trình sự hình thành bào tử nấm mốc.
Thời gian nuôi mốc giống trên khay kéo dài khoảng 60 giờ, nếu hình thành
bào tử châm thì phải kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm
30-32%, có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu dùng ngay thì
phải đem sấy đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc cung cấp giống cho các đơn vị sản
xuất khác. Nhiệt độ phòng sấy không được quá 40 oC. các bao giống cần được bảo
quản nơi thoáng mát tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, 1-2
tháng hoặc lâu hơn.
1.3.3 Quy trình sãn xuất
1.4.1 Quy trình lên men công nghiệp tạo enzim α-amylase
1.4.1.1 nguyên liệu

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
22


Đồ án thực phẩm
Nguồn tinh bột: ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa
dạng và phong phú. Nhưng để phù hợp với sản xuất enzim amylase thì cần phải
tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy nguồn nguyên liệu cần được quan
tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế quan trong cho
nhà sản xuất và người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sãn xuất đại trà.

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
23

Đồ án thực phẩm

_____________________________________________________________
Svth: Trần Đình Mạnh
24