ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2005 – 2009
Sinh viên thực hiện : LĂNG VĂN ĐỨC

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NESTED RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP (PRRSV) TRÊN HEO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

LĂNG VĂN ĐỨC

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN

 Chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Các Thầy Cô và anh chị tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi
Trường Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt giúp.
Chị Đặng Ngọc Thuỳ Dương và chị Lê Thị Kim Phượng đã tận tình chỉ bảo
hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 31 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện khoá luận.
 Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên
tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên
con trong suốt quá trình học tập tại trường.

Thủ Đức, tháng 08 năm 2009

Lăng Văn Đức

iii


TÓM TẮT
Đề tài : “Ứng dụng phương pháp nested RT – PCR để phát hiện virus gây hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) trên heo” được thực hiện từ ngày
16/2/2009 đến ngày 16/7/2009, tại Viện Nghiên Cứu Công nghệ Sinh Học và Môi
Trường Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh nhằm đánh giá khả năng phát
hiện virus PRRS trong huyết thanh heo giữa phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR
để lựa chọn phương pháp thích hợp trong xét nghiệm virus PRRS.
Mẫu máu được thu thập trên các heo có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh PRRS
được chiết lấy huyết thanh để ly trích RNA của virus. Quy trình RT-PCR được
dùng để phát hiện RNA của virus PRRS trên các mẫu thu thập. Sử dụng quy trình
nested RT-PCR phát hiện RNA của virus PRRS và phân biệt hai kiểu gene virus
trên các mẫu vắc-xin và mẫu thu thập . Thiết lập quy trình so sánh khả năng phát
hiện RNA của virus PRRS giữa hai phương pháp này.
Khi sử dụng phương pháp RT-PCR đã phát hiện được 12/20 mẫu có kết quả
dương tính và 8/20 mẫu có kết quả âm tính. Với phương pháp nested RT-PCR đã phát
hiện được 18/20 mẫu có kết quả dương tính và 2/20 mẫu có kết quả âm tính trong
những mẫu xét nghiệm. Trong đó, có 2/18 mẫu nhiễm dòng châu Âu, 10/18 mẫu nhiễm
dòng Châu Mỹ và 6/18 mẫu nhiễm cả hai dòng. Khi so sánh độ nhạy của hai phương
pháp trên mẫu huyết thanh pha loãng thì phương pháp RT-PCR phát hiện được RNA
của virus ở độ pha loãng từ 100 đến 10 -5, còn phương pháp nested RT-PCR phát hiện
được ở độ pha loãng từ 100 đến 10 -8. Tám mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR,
được kiểm tra bằng nested RT-PCR cho kết quả 6/8 mẫu dương tính.
Độ nhạy của phương pháp nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS cao
hơn hẳn phương pháp RT-PCR. Những mẫu âm tính với phương pháp RT-PCR nên
kiểm chứng lại bằng phương pháp nested RT-PCR.

iv

SUMMARY
Thesis: “Using the nested RT-PCR method to detect Porcine reproduction and
respiratory syndrome virus (PRRSV) in swine” had been done from 16/2/2009 to
16/7/2009, at Insitute of Biotechnological and environmental research of Nong Lam
university Ho Chi Minh city to compare of possibility to detect PRRSV in blood swine
between RT-PCR and nested RT-PCR methods to select a suitable method in
diagnostic PRRSV.
Blood samples taken from swine suspected of PRRSV infection was extracted to
serum to prepare RNA of virus. The RT-PCR protocol was used to determine RNA of
PRRSV in collecting samples. The nested RT-PCR protocol was used to determine RNA
of PRRSV and distinguish between the European and the American genotypes of the
virus in collecting samples and vaccine samples. The comparison procedure was carried
out for testing the possibility in detection RNA of PRRSV between these two methods.
The RT-PCR method could determine 12 positive samples in 20 samples,
whereas the nested RT-PCR method could determine 18 positive samples in 20
samples. In the results, there were 2/18 samples infected European strain only,
10/18 samples infected American strain only and 6/18 samples infected boths.
In compairing the sensitivity of two methods, the RT-PCR method could determine
virus RNA from 100 to 10 -5 RNA extract dilution, the nested RT-PCR method could
determine virus RNA from 100 to 10 -8 RNA extract dilution. Eight negative
samples of the RT-PCR method were tested again by the nested RT-PCR method
and the results showed 6/8 positive samples.
In this research, the sensitivity of the nested RT-PCR method was higher than
that of the RT-PCR method to detect RNA of PRRSV. The negative samples of the
RT-PCR method should be tested again by the nested RT-PCR method.

v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii
TÓM TẮT ...................................................................................................................iv
SUMMARY .................................................................................................................v
MỤC LỤC...................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .........................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ...........................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..............................................................................................................1
1.2. Mục đích – yêu cầu ................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................ 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................3
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở lợn ...............................................................3
2.1.1. Giới thiệu............................................................................................................3
2.1.2. Lịch sử bệnh .......................................................................................................3
2.1.3. Phân loại, đặc điểm về hình thái và cấu trúc của virus PRRS .............................4
2.1.3.1. Phân loại virus PRRS .......................................................................................4
2.1.3.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc virus PRRS ......................................4
2.1.4. Phân kiểu gene của virus.....................................................................................6
2.2. Chẩn đoán..............................................................................................................7
2.2.1. Chẩn đoán lâm sàng ............................................................................................7
2.2.2. Chẩn đoán phi lâm sàng ......................................................................................7
2.3. Phương pháp RT-PCR .........................................................................................10
2.3.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR....................................................................10
2.3.2. Các enzyme sử dụng trong phiên mã ngược ......................................................10
2.3.3. Các primer trong phiên mã ngược .....................................................................11
2.4. Phương pháp nested-PCR ....................................................................................11

2.4.1. Giới thiệu chung về nested-PCR .......................................................................11

vi


2.4.2. Các bước của nested-PCR .................................................................................12
2.5. Những nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam ..................................................13
2.5.1. Trên thế giới .....................................................................................................13
2.5.2. Tại Việt Nam ....................................................................................................14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................15
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................15
3.2. Đối tượng và số lượng mẫu..................................................................................15
3.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................15
3.4. Thiết bị, dụng cụ, vật liệu và hóa chất sử dụng....................................................15
3.4.1. Thiết bị và dụng cụ sử dụng ..............................................................................15
3.4.2. Vật liệu, kit và hóa chất sử dụng cho RT-PCR và nested RT-PCR ....................16
3.4.3. Vật liệu và hóa chất sử dụng cho điện di.. .........................................................17
3.4.4. Phương pháp lấy mẫu và xét nghiệm.................................................................17
3.4.5. Ly trích RNA ....................................................................................................17
3.4.6. Điện di sản phẩm PCR .....................................................................................18
3.5. Các bước và nội dung thực hiện ...........................................................................18
3.5.1. Các bước thực hiện ...........................................................................................18
3.5.2. Nội dung tiến hành thí nghiệm ..........................................................................19
3.5.2.1. Xác định sự nhiễm virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR ..........................19
3.5.2.2. Xác định sự nhiễm virus PRRS và phân biệt các dòng bằng nested RT-PCR..20
3.5.2.3. So sánh độ nhạy của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR .....................22
3.6. Xử lý số liệu ........................................................................................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................23
4.1. Kết quả xác định sự nhiễm virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR. .....23
4.2. Kết quả sự nhiễm và phân biệt hai dòng virus PRRS bằng nested RT-PCR..........24

4.3. Kết quả so sánh độ nhạy và đặc hiệu của RT-PCR và nested RT-PCR. ................26
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................29
5.1. Kết luận ...............................................................................................................29
5.2. Đề nghị ................................................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................30
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide
- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
- EMEM: Eagle Minimum Essential Medium
- FA: Formaldehyde agarose
- FITC : Fluorescein isothiocynate
- HRPO: Horseradish Peroxidase
- IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay
- IHC: Immunohistochemistry Staining
- IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay
- Lad: Ladder
- MSD: Mystery Swine Disease
- nested RT-PCR: Reverse transcriptase - nested - polymerase chain reaction
- OIE: Office International Epizooties
- ORF: Open reading frame
- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage
- PEARS: Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome
- PRRS: Porcine reproduction and respiratory syndrome
- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus

- RNA: Ribonucleotide Acid
- RT- PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction
- SIRD: Swine Infertility and Respiratory Disease
- SNV: Serum neutralization virus
- TBE: Tris borate EDTA
- μl: Micro lit

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng trong phương pháp RT-PCR để phát hiện virus ........16
Bảng 3.2 Trình tự nucleotide của các cặp primer dùng cho phản ứng .........................17
Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng RT-PCR .............................................................20
Bảng 3.4 Quy trình nhiệt theo bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR......................... ……20
Bảng 3.5 Liều lượng cho các thành phần của phản ứng nested-PCR (Promega) .........21
Bảng 3.6 Chu kì nhiệt cho nested-PCR (Promega) .....................................................21
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS bằng RT-PCR...............................24
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS bằng nested RT-PCR ....................26
Bảng 4.3 Kết quả phân biệt hai kiểu gene virus PRRS của nested RT-PCR ...............26
Bảng 4.4 Kết quả so sánh độ nhạy của hai phương pháp............................................26
Bảng 4.5 Kết quả phát hiện virus PRRS của hai phương pháp ...................................28

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Virus PRRS. ..................................................................................................4

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gene của virus PRRS. .................................................................6
Hình 2.3 Các bước của phản ứng nested-PCR ...........................................................12
Sơ đồ 3.1 Quy trình điện di và chụp gel......................................................................18
Hình 4.1 Kết quả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh bằng RT-PCR ................. 23
Hình 4.2 Kết quả phát hiện virus PRRS trong mẫu vaccine bằng nested RT-PCR ..... 24
Hình 4.3 Kết quả phát hiện virus PRRS bằng nested RT-PCR....................................25
Hình 4.4 Độ nhạy của hai phương pháp với virus PRRS trong huyết thanh heo .........27
Hình 4.5 Độ nhạy của nested RT-PCR trong phát hiện virus PRRS trong mẫu ...........28
Sơ đồ 3.2 Cách thực hiện chạy RT-PCR và nested RT-PCR trong 3 nội dung..............18
Sơ đồ 3.3 Sử dụng RT-PCR phát hiện virus PRRS trên heo............ ...........................19
Sơ đồ 3.4 Cách thực hiện so sánh độ nhạy của hai phương pháp ........................ ……. 22
Sơ đồ 3.5 Cách thực hiện kiểm tra độ nhạy của phương nested RT-PCR......................22

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh
tế ở nước ta. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lượng heo nuôi ngày càng tăng cao.
Ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lượng cũng như chất
lượng cho người tiêu dùng.
Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi
cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hưởng trực tiếp
đến thành tích sinh sản và tăng trưởng của heo như: bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu
son, bệnh giả dại và gần đây nhất là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo
(PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS tiến
triển phức tạp, khó khống chế, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh
gây sẩy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh

yếu, heo con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn.
Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán và
phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng. Việc chẩn đoán virus bằng các triệu trứng lâm
sàng thường không chính xác, và khi đã chẩn đoán được thì bệnh đã nặng và khả năng
lây lan thành dịch cao. Một số phương pháp được dùng để chẩn đoán như ELISA, FA,
IFA, IMPA, nuôi cấy tế bào được sử dụng chưa có hiệu quả cao lắm, phức tạp, mất
thời gian. Tất cả những hạn chế của các phương pháp trên gây trở ngại trong việc chẩn
đoán virus trong tình hình bệnh dịch hiện nay.
Cho đến những năm gần đây, phương pháp sinh học phân tử đã phát triển một
cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó phương pháp PCR ngày
càng được ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là một phương pháp có độ chính xác cao, ít tiêu
tốn thời gian và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được. Phương pháp RT-PCR dùng
cho việc chẩn đoán RNA của virus cũng rất hiệu quả, nhưng điều đó không phải lúc
nào cũng đúng khi nghiên cứu virus PRRS (Wagstrom và ctv, 2000). Tồn tại của
phương pháp được nhiều tác giả nhìn nhận đó là khó phát hiện được RNA của virus
trong mẫu khi nồng độ của virus thấp. Phương pháp này có thể cho kết quả âm tính
1


và dương tính giả, không đủ cơ sở đánh giá bệnh, đặc biệt khi heo mới vừa bị
nhiễm (Bierk MD và ctv, 2000; U. Truyen và ctv, 2006; C.Fetzer và ctv, 2006).
Nested-PCR cũng là một phương pháp PCR nhưng chỉ cần một lượng mẫu nhỏ
hơn PCR truyền thống. Phương pháp nested-PCR được phát triển nhằm mục đích gia
tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Độ nhạy của nested-PCR có thể cao
hơn khoảng 10.000 so với phương pháp PCR thông thường.
Việc so sánh độ nhạy giữa phương pháp nested RT-PCR với các phương pháp
RT-PCR truyền thống hoặc phương pháp phân lập virus (được xem là tiêu chuẩn
“vàng” để chẩn đoán virus trên thế giới) là điều hết sức cần thiết nhằm áp dụng
phương pháp nested RT-PCR, một phương pháp được cho là rất nhạy so với phương
pháp RT-PCR truyền thống và chưa được thực hiện ở Việt Nam trong việc phát hiện

virus PRRS trên heo. Do đó, đề tài: “Ứng dụng phương pháp nested RT-PCR để phát
hiện virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” đã được thực hiện.
1.2 Mục đích – yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Thăm dò khả năng ứng dụng phương pháp n ested RT -PCR trong chẩn đoán
virus PRRS trên heo.
1.2.2. Yêu cầu
- Ly trích RNA từ mẫu vaccine và mẫu nghi ngờ nhiễm virus PRRS thu thập ở các trại heo.
- Sử dụng quy trình RT-PCR phát hiện RNA của virus PRRS trên các mẫu thu thập.
- Sử dụng quy trình nested RT-PCR để phát hiện và phân biệt hai kiểu gene virus
PRRS trên mẫu vaccine và các mẫu thu thập.
- Thiết lập quy trình so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của hai phương pháp trong phát
hiện virus PRRS.
1.3 Nội dung thực hiện
- Phát hiện virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR.
- Phát hiện và phân biệt các kiểu gene của virus PRRS trên heo bằng phương pháp
nested RT-PCR.
- Thực hiện so sánh độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR
trong phát hiện virus PRRS trên heo.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở lợn
2.1.1. Giới thiệu
Trong chăn nuôi heo, một trong những bệnh mới xuất hiện trong thời gian gần
đây và được nhắc đến nhiều đó là hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (porcine
productive and respiratory syndrome - PRRS). Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ

vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện ở Châu Âu và Châu Á và được xác
định là do một loại virus thuộc họ Arteriviridae, có khả năng xâm nhiễm vào đại thực
bào và mô. Virus PRRS là một virus RNA có vỏ bọc, gây cả thiệt hại về sinh sản trong
đàn lợn giống và về các triệu chứng hô hấp trong đàn heo thịt. Heo nái biểu hiện kém
ăn, thở khó và có thể kèm theo sốt ngắn. Sẩy thai, đặc biệt là cuối thời kỳ chửa, tăng số
lượng con chết khi đẻ, heo vẹo chân, heo yếu và xảy ra tử vong ở heo con. Ở heo nuôi
thịt, mức độ bệnh hô hấp tăng lên, thường kết hợp với các bệnh khác (Thanh Thuận, 2001).
Ở ổ dịch cấp tính, ước tính giảm sản lượng 5-20 %, giảm từ 1-3,8 heo con/nái/năm,
thiệt hại từ 100-155$/nái/năm (Hoàng Văn Năm, 2001).
2.1.2. Lịch sử bệnh
Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí
trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD).
Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh
chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu.
Mùa đông năm 1990- 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ,
Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau:
“Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên
heo”( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội
chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD).
Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn bệnh ở
Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho
loại virus này là “Lelystad”.

3


Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được virus
gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng
trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên
cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine

reproductive and respiratory syndrome - PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006).
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51
con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh PRRS trên những trại giống lớn
tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau,
từ 1,3 % cho tới 68,29 %. Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh
dương tính rất cao, như ở Anh là 6 - 75 %, Mỹ là 36 % (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y, 2007).
2.1.3. Phân loại, đặc điểm về hình thái và cấu trúc của virus PRRS
2.1.3.1. Phân loại virus PRRS
Virus PRRS thuộc:
Bộ Nidovirales.
Họ Arteriviridae.
Giống Arterivirus.

Hình 2.1 Virus PRRS
(http//www. agraroldal.hu).
2.1.3.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc của virus PRRS
Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40 - 70 nm, có vỏ bọc,
kích thước genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim và ctv, 2005).
Bộ gene của virus PRRS gồm 8 khung đọc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần
khác nhau của virus. Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định
danh virus, đó là ORFs 5, 6 và 7 quy định tổng hợp các protein tương ứng: nucleocapsid
(N) 15 - kDa, matrix (M) 19 - kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25 - kDa. Đây là
4


những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90 - 95 % lượng protein cấu trúc
của virus (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, được mã hóa lần
lượt bởi ORF7, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA.
Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm

từ 20 - 40 % lượng protein của phân tử virus. Hiện nay protein N được dùng như là
một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo.
Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa, được mã hóa lần lượt bởi
ORF6. Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò
trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp
M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và ctv, 2001).
Protein E có trọng lượng phân tử khoảng 24 - 25 kDa, được mã hóa lần lượt bởi
ORF5 là một loại protein có nhiều biến đổi nhất. Bằng phương pháp xác định trình tự
gen của virus PRRS, Umthun và Mengeling (1999) đã khẳng định rằng protein E rất hữu
dụng trong việc phân kiểu gene các virus PRRS (Trần Thị Bích Liên, 2008).
Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, được mã hóa lần lượt bởi
ORF5, là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong
việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và ctv, 2003; Võ Ngọc Thơ, 2007).
Protein GP2 (29 - 30kDA) và GP4 (31 - 35kDa) được mã hóa lần lượt bởi
ORF2 và ORF3 là các glycoprotein màng chúng chứa trình tự tận cùng N, một đoạn
xuyên màng tận cùng là C (Meulenberg, 2000).
Hiện nay, có các dữ liệu khác nhau về sự hiện diện của glycoprotein GP3 được
mã hóa từ ORF3 trong hạt virus. Nieuwstadt phát hiện protein GP3 (45 - 50kDa) bằng
phương pháp Western blot trên virus Lelystad đã tinh sạch với các kháng thể đơn kiểu
gene đặc hiệu nhưng không phát hiện được Protein GP3 của virus kiểu gene canadian
IAFkop bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Tuy nhiên, protein GP3 được phát
hiện trong tế bào bị phân giải và được giữ trong lưới nội chất, và một lượng protein
được tìm thấy ở dạng GP3 dạng lỏng. Các protein GP3, GP4, GP5, M, N mang tính
kháng nguyên (Meulenberg, 2000).

5


Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen của virus PRRS.
( />2.1.4. Phân kiểu gene của virus

Về mặt di truyền, khi phân tích các kiểu gene virus PRRS gây bệnh khác nhau,
người ta xác định được 2 kiểu gene của virus: kiểu gene Châu Âu (Lelystad) và kiểu
gene Châu Mỹ (VR-2332).
Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các kiểu gene
PRRS, người ta đã xác định rằng ở kiểu gene Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn
định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của kiểu gene
virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa kiểu gene virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2
khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7
giữa 2 kiểu gene virus này chỉ vào khoảng 57-59 %, ORFs 6 là 70-81 % và ORFs 5 là
khoảng 51-59 %. Sự tương đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở
ORFs 2, 3 và 4 giữa các kiểu gene Châu Mỹ và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58 %
và 68 % (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa
do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gene (Trần Đức Minh, 2006). Sự khác biệt
về kiểu gene liên quan đến sự khác biệt về kiểu hình và như vậy có thể dựa vào đặc
điểm gene để chẩn đoán kiểu gene virus và ngược lại. Như vậy, trên cơ sở về kiểu
gene, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn
bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của virus PRRS (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản
xuất và sử dụng virus nhược độc để làm vaccine (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

6


2.2. Chẩn đoán
2.2.1. Chẩn đoán lâm sàng
Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các
hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thường thì có thể nghi ngờ
bệnh do virus PRRS.
Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở
nghi ngờ bệnh khi:

− Tỷ lệ chết lúc sinh >20 %.
− Tỷ lệ sảy thai >8 %.
− Tỷ lệ heo con chết trước khi cai sữa >26 %.
− Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25 %.
Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phương pháp chẩn
đoán phi lâm sàng khác (Võ Thị Đan Thanh, 2006).
2.2.2. Chẩn đoán phi lâm sàng
2.2.2.1. Phân lập virus trên môi trường tế bào
Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại
tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế
bào thận khỉ (MARC-145, CL2621). Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì
không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này. Han-Kook Chung
và ctv (2002) cho rằng PRRSV kiểu gene Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145,
ngược lại PRRSV kiểu gene Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM.
2.2.2.2. Phương pháp phát hiện kháng thể
* Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay)
Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus
PRRS được gọi là phương pháp miễn dịch peroxidase một lớp. Phương pháp này có
thể thực hiện trên các kiểu gene tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi
nuôi cấy 24 giờ sẽ được gây nhiễm với PRRSV và được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó
tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1
giờ ở 37oC và được cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO
(horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 3050 % tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong
30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA được sử
7


dụng nhiều ở Châu Âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, người ta thường sử
dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát
hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhược

điểm của phương pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lượng kháng thể bảo vệ.
* Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay)
Giống như trong phương pháp IPMA, phương pháp IFA (phương pháp miễn
dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA
cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với
HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc
đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang, sự hiện diện của màu huỳnh quang
trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc
hiệu cao 99,5 % và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi
nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhược điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự
động nên khó thực hiện với quy mô lớn.
* Phản ứng SN (Serum Neutralizing)
Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, được
sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhược điểm của phản
ứng này là đắt tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện
chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên, đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn
dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
* Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy
và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện
kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của
phương pháp này là dễ cho kết quả dương tính giả. Tỷ số S/P (sample/position) ≥ 0,4
thì kết quả được ghi nhận là dương tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA được sử dụng
nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nước Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Nhiều dạng ELISA đã được mô tả: ELISA trực tiếp sử dụng tỉ số S/P
(sample/positive); ELISA trực tiếp sử dụng giá trị OD trực tiếp, ELISA ngăn trở. Trong
một bộ ELISA kit thương mại (HerdChek® PRRS ELISA, IDEXX Laboratories Inc.,
Westbrook, Maine), tỉ số S/P ≥ 0,4 thì kết quả là dương tính. Sử dụng tỉ số S/P ≥ 0,4 như
là một giá trị giới hạn, kháng thể đặc hiệu đối với virus PRRS được phát hiện đối với
8

những heo nhỏ từ 10 đến 14 ngày sau nhiễm trong những điều kiện thí nghiệm và cao
nhất là 2 đến 3 tháng sau nhiễm (Yoon và ctv,1995). Độ đặc hiệu của bộ kit nằm trong
khoảng 99,3 % đến 99,5 % ( />2.2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng nguyên
Phương pháp FA (flourescent antibody staining - kháng thể huỳnh quang) và
IHC (immunohistochemistry staining - hoá mô miễn dịch) có thể được sử dụng để phát
hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô.
Phương pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phương
pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu
không cao để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần được lấy và làm lạnh nhanh.
Phương pháp IHC cũng được thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phương
pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã được cố định bằng formol. Điều này là
khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy
cao hơn so với FA nhưng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.2.2.4. Chẩn đoán gen
Phương pháp PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các
mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà
thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy
tế bào vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều
dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để phát hiện các
vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán
PRRSV, nhất là để phân biệt 2 kiểu gene virus thì Han-Kook Chung và cộng sự (2002)
đã sử dụng phương pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR). Fun
In Wang (1994) đã sử dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của
virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực. Trong thí nghiệm
này với tỉ lệ huyết thanh dương tính là 85,4 % (205/240), nhưng chỉ có 11/140 mẫu
máu chứa lượng virus có thể phát hiện được bằng RT-PCR. Ông kết luận kết quả phản
ứng RT-PCR phụ thuộc rất nhiều vào mẫu phân tích. Wagstrom và cộng sự trong
nghiên cứu của mình đã chứng minh phương pháp RT- PCR trực tiếp có khả năng phát

hiện RNA virus PRRS với độ đặc hiệu cao (99,4 %) (Wagstrom và ctv, 2001).
Fun in wang (1994) đã sử dụng phương pháp RT-PCR trực tiếp để phát hiện
sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực.
9


Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chưa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác
định tình trạng nhiễm của đàn và phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình
độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch
RNA phải được thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR
giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau.
2.3. Phương pháp RT-PCR
2.3.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR
Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã
ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Một primer
oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một
enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao
này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai. Tùy thuộc vào
mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế
đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết
vào nhiều vị trí trên mRNA
2.3.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược
Ngày nay, có ba loại enzyme phiên mã ngược được sử dụng để tổng hợp
cDNA invitro tương ứng với RNA mẫu.
Enzyme phiên mã ngược của avian myeloblastosis virus (AMV) và dòng
Moloney của virus murine leukemia (Mo-MLV). Cả hai loại enzyme này đều đòi hỏi
primer sử dụng cho quá trình phiên mã ngược phải có nhóm 3’-OH. Loại enzyme này
không có hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease. Khi sử dụng loại enzyme này đòi hỏi trong
phản ứng phải có nồng độ dNTP cao.
Tth DNA polymerase chịu nhiệt: Loại enzyme này được mã hóa bởi vi khuẩn

chịu nhiệt Thermus thermophilus. Chúng thực hiện phản ứng phiên mã ngược khi có
sự hiện diện của Mn2+ (Myers và Gelfand, 1991). Đặc điểm thuận lợi của loại enzyme
này là ta có thể thực hiện cả hai quá trình của RT-PCR trong cùng một tube phản ứng .
Tuy nhiên loại enzyme này chỉ tổng hợp cDNA có kích thước khoảng từ 1- 2 kb, thêm
vào đó việc sử dụng Mn2+ trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp cDNA có độ
đặc hiệu thấp. Enzyme Tth không thể cùng sử dụng với primer oligo dT và random
hexamer vì quá trình bắt cặp không thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ mà tại đó enzyme
phiên mã ngược hoạt động.
10


2.3.3. Các primer trong phiên mã ngược
Có ba loại primer thường được sử dụng cho phiên mã ngược trong phản ứng RT-PCR :
Oligo T (dT): Đây là loại primer được thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là thường
tồn tại đuôi poly A tận cùng ở đầu 3’. Khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược, primer oligo
T sẽ gắn kết vào đuôi poly A của mRNA theo nguyên tắc bổ sung. Mồi oligo T thường được
sử dụng như là một “mồi phổ dụng” cho việc tổng hợp ra một cDNA thông thường.
Oligonucleotide antisense: Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một
trình tự đích đặc biệt của mRNA. Tuy nhiên, khi sử dụng oligonucleotide làm mồi cho
quá trình phiên mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết
kế sao cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của
oligonucleotide sử dụng làm primer cho việc tổng hợp cDNA.
Random hexanucleotide: Loại primer này thường được sử dụng khi mRNA
đích có kích thước lớn hay có quá nhiều cấu trúc bậc hai. Khi đó việc tổng hợp
cDNA không thể được thực hiện một cách hiệu quả bằng cách sử dụng mồi oligo
dT hay mồi oligonucleotide antisense.
Trong kỹ thuật RT-PCR những primer oligonucleotide antisense được thiết kế
để gắn kết vào vùng 3’ không dịch mã của mRNA đích là những primer được ưu tiên
chọn lựa. Primer oligo dT là lựa chọn tốt nhất kế sau và random hexamer là lựa chọn
cuối cùng (Nguyễn Nhất Bảo Quốc).

2.4. Phương pháp nested-PCR
2.4.1. Giới thiệu chung về nested-PCR
Phương pháp nested-PCR được phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy và
độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Phương pháp này được Lo và cộng sự công bố vào
năm 1996. Trong phương pháp này có hai cặp primer khác nhau được sử dụng nhưng
chỉ để nhằm khuếch đại đặc hiệu một đoạn gene và phản ứng PCR phải thực hiện hai
lần. Lần đầu, phản ứng PCR phải thực hiện trong 15 đến 30 chu kì với cặp mồi thứ
nhất. Cặp mồi thứ nhất ở lần chạy thứ nhất cho phép khuếch đại đoạn gene dài hơn
đoạn gene cần xác định. Cặp mồi thứ hai sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần
thứ nhất. Phản ứng PCR lần hai sau đó sẽ khuếch đại đoạn gene cần xác định.
Phương pháp nested-PCR gia tăng độ nhạy của phản ứng nhờ tổng số chu kì được
thực hiện nhiều hơn, điều này dẫn tới việc gia tăng độ nhạy của nested-PCR lên
khoảng 10.000 lần, ngay cả trong trường hợp ở chu kì đầu, sản phẩm PCR ít hiện diện
11


như một sản phẩm không đặc hiệu, nó sẽ được khuếch đại bởi nested-PCR primer.
Nested-PCR chỉ cần một lượng mẫu nhỏ hơn PCR truyền thống. Nhược điểm lớn
nhất của nested-PCR đó là gia tăng mức tạp nhiễm trong quá trình chuyển mẫu giữa
hai lần chạy PCR. Tuy nhiên có thể khắc phục được bằng cách cải tiến chạy nestedPCR trong một ống (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Ngược lại những sản phẩm không đặc hiệu của phản ứng PCR thứ nhất thì
thường có những trình tự không tương hợp với những primer nested, ngay cả nếu
không thể thiết kế hai primer chuyên tính ( />2.4.2. Các bước của nested-PCR
Bước 1: Đoạn DNA khuôn được tách làm hai mạch. Thực hiện phản ứng PCR
với cặp mồi thứ nhất (có màu xanh). Quá trình thực hiện PCR lần nhất có thể cho rất
nhiều sản phẩm tuy nhiên chúng ta chỉ lựa chọn những sản phẩm PCR có trình tự như
mong muốn. Cặp mồi thứ nhất ở lần chạy thứ nhất cho phép khuếch đại đoạn gene dài
hơn đoạn gene cần xác định và đoạn gene cần xác định nằm trong đoạn gene được
khuếch đại lần 1. Sản phẩm của phản ứng PCR lần 1 sẽ là mẫu cho phản ứng PCR thứ hai.
Bước 2: Những sản phẩm PCR của lần PCR thứ nhất sẽ là mẫu cho bước PCR

lần hai, tuy nhiên bước này sẽ thực hiện PCR với cặp primer thứ hai (màu đỏ).

Hình 2.3 Các bước của phản ứng nested-PCR.
(http:/nestedpcr/New Folder/drfer.htm).
Phương pháp này sẽ có nhiều đoạn sản phẩm DNA hơn là phương pháp PCR cổ
điển, số đoạn DNA được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản ứng.
Jane Christopher-Hennings và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật này để tiến hành
phát hiện virus PRRS trên tinh dịch của heo (Jane Christopher-Hennings và ctv, 1995).

12


2.5. Những nghiên cứu thế giới và tại Việt Nam
2.5.1. Trên thế giới
Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh
chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu.
Mùa đông năm 1990 - 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ,
Pháp và Tây Ban Nha đã công bố về dịch PRRS. Từ cuối năm 2005 đến nay đã có
hơn 25 nước, vùng lãnh thổ có PRRS xuất hiện (Cục thú y, 2007). Hiện nay, chỉ có
các nước như Úc, Tân Tây Lan, Thuỵ sĩ không có bệnh PRRS trên heo. Một số ổ
dịch PRRS mới nhất nổ ra ở Thuỵ Điển, Nam Phi, Liên Bang Nga, Việt Nam và
Trung Quốc (OIE, 2007; Trần Thị Bích Liên, 2008).
Trước những thiệt hại nặng nề do bệnh PRRS gây cho ngành chăn nuôi, đã có
rất nhiều phương pháp được nghiên cứu để phát hiện virus PRRS. Mỗi phương pháp
có ưu nhược điểm khác nhau và được dùng phù hợp với tình hình thực tế của từng nơi.
Trong đó, phương pháp RT-PCR được sử dụng để phát hiện RNA của virus có độ
nhạy, độ đặc hiệu cao và lại ít tốn thời gian hơn so với nuôi cấy tế bào (Benson và ctv,
2002; Horter và ctv, 2002; Trần Thị Bích Liên, 2008). Fun In Wang (1994) đã sử dụng
phương pháp RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo
thương phẩm và trong tinh dịch con đực.

Theo R.Allende và ctv (2000) vào ngày 150 sau gây nhiễm thực nghiệm PRRS
trên heo thì không phân lập được virus bằng nuôi cấy tế bào và không phát hiện được
RNA của virus bằng phương pháp RT-PCR.
Nhằm gia tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR, phương pháp
nested RT-PCR đã được phát triển. Phương pháp này vừa có thể phát hiện và phân
biệt được hai kiểu gene virus Châu Âu và kiểu gene virus Châu Mỹ (Pesch và ctv,
2003; U. Truyen và ctv, 2006). Ngày nay, kiểu gene virus Châu Mỹ còn được tìm
thấy ở Châu Âu (Oleksiewicz và ctv, 1998), trong khi đó kiểu gene virus PRRS
Châu Âu lại lan truyền ở Bắc Mỹ (Fang và ctv, 2004; Ropp và ctv, 2004); và cả hai
kiểu gene của virus này được tìm thấy ở Châu Á (Thanawongnuwech và ctv, 2004).
Do đó, việc sử dụng những phương pháp chẩn đoán và phân biệt hai kiểu
gene virus PRRS là điều cần thiết cho công tác phòng chống bệnh PRRS ở mỗi
quốc gia (C. Fetzer và ctv, 2006).

13


2.5.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (
10/51 heo có huyết thanh dương tính). Điều tra ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh
lân cận cho thấy 15 % huyết thanh heo có kháng thể kháng virus PRRS (596/2308
mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33 %) nhiễm PRRS (Nguyễn Lương Hiền và ctv, 2001). La
Tấn Cường (2005) ghi nhận tỉ lệ nhiễm virus PRRS trên heo nuôi tập trung ở Cần Thơ
là 66,86 % (Võ Thị Đan Thanh, 2006).
Năm 2007, Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân khảo sát tỷ lệ nhiễm PRRS trên
1.081 mẫu huyết thanh thu thập từ 21 trại chăn nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của
hai tỉnh miền Đông Nam Bộ các năm 2003-2005 bằng phương Pháp ELISA cho thấy tỉ
lệ heo nhiễm là 36,78 % và có 85,71 % số cơ sở chăn nuôi bị nhiễm. Trên các mẫu
nhiễm có 59,23 % số mẫu nhiễm kiểu gene Châu Mỹ, 3,8 % số mẫu nhiễm kiểu gene
Châu Âu và 36,92 % số mẫu nhiễm cả hai kiểu gene Châu Mỹ và Châu Âu.

Huỳnh Trọng Tiến (2007) áp dụng kĩ thuật RT-PCR phát hiện virus PRRS. Với
tế bào nuôi cấy bệnh phẩm, huyết thanh, tinh dịch, hạch amidan và hạch phổi được ly
trích bằng Trizol, tác giả phát hiện virus PRRS trong huyết thanh, hạch phổi, hạch
amidan tế bào nuôi cấy bệnh phẩm nhưng không phát hiện RNA của virus này trong
mẫu tinh dịch trên heo đực giống nghi nhiễm PRRS.
Trần Thị Ánh Hồng (2008) dùng phương pháp ELISA và RT-PCR đã phát hiện
virus PRRS trong máu và huyết thanh heo cai sữa nghi ngờ nhiễm.
Qua việc nghiên cứu giải trình tự của virus PRRS Việt Nam để so sánh với
virus chủng Trung Quốc độc lực cao, kết quả nghiên cứu thấy có 99 % trình tự của
virus PRRS ở Việt Nam tương đồng chủng virus độc lực cao của Trung Quốc
(Youjun Feng và ctv, 2008). Trước tình hình bệnh dịch như hiện nay, các số liệu về
tình hình nhiễm và chủng nhiễm cần bổ sung để đánh giá toàn diện tình hình bệnh
trên đàn heo cả nước và ở mỗi địa phương, từ đó đưa ra phương hướng phòng chống
dịch hiệu quả. Vì vậy việc áp dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc
chẩn đoán nhanh, sớm và chính xác là hết sức cần thiết.

14


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 16/02/2009 đến 16/07/2009.
Mẫu được lấy ở một số trại heo nghi nhiễm virus PRRS tại Tp. Hồ Chí Minh và
xét nghiệm ở Viện Nghiên Cứu công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường trường Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Đối tượng và số lượng mẫu
Đối tượng: Heo nuôi ở các trại, có triệu chứng bệnh nghi nhiễm virus PRRS.
Số lượng mẫu: Mẫu vaccine Porcillis (Hà Lan) và vaccine Besta (singapore)
sử dụng cho chuẩn hóa quy trình nested RT-PCR. Ở các trại nghi nhiễm virus PRRS

đã thu thập 20 mẫu máu.
3.3. Nội dung và phương pháp thực hiện
Xác định sự nhiễm virus PRRS trên heo bằng phương pháp RT-PCR.
Xác định sự nhiễm và phân biệt các kiểu gene của virus PRRS trên heo bằng
phương pháp nested RT-PCR.
So sánh độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp RT-PCR và nested RT-PCR trong
phát hiện virus PRRS.
3.4. Thiết bị, dụng cụ, vật liệu và hóa chất sử dụng
3.4.1. Thiết bị và dụng cụ sử dụng
Thiết bị dùng trong quá trình thực hiện khóa luận có tại Viện Nghiên Cứu công
Nghệ Sinh Học Và Môi Trường trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh bao gồm:
Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C); tủ -70oC, -20oC (Sanyo Ultra Low), tủ lạnh
(Electrolux); máy vi sóng (Electrolux), máy chụp gel (Biorad); máy PCR (Biorad),
máy PCR effpendorf, máy PCR-system 9700; máy Vortex; bộ nguồn và bồn điện di;
máy đọc gel (Chemidoc – Bio-rad); máy đo OD.
Dụng cụ sử dụng cho tách chiết mẫu và chạy PCR gồm: Micropipet, đầu tuýp
và eppendorf (Promega); găng tay thao tác mua ở các hiệu thuốc.

15