Vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt tính pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men aspergillus niger

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ THỊ TRANG
MSSV: 2071846

VAI TRÒ CỦA KHOÁNG & DINH DƯỠNG ĐẾN
HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE SINH RA
TỪ SỰ LÊN MEN ASPERGILLUS NIGER
Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giáo viên hướng dẫn:
Ths. TRẦN THANH TRÚC

Cần Thơ, 2010


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

VAI TRÒ CỦA KHOÁNG & DINH DƯỠNG ĐẾN
HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE SINH RA
TỪ SỰ LÊN MEN ASPERGILLUS NIGER

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Ths. Trần Thanh Trúc

Lê Thị Trang
MSSV: 2071846
Lớp: CNTP K33

Cần Thơ, 2010


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

L I CAM OAN
Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Vai trò của khoáng và dinh dƣỡng đến hoạt
tính pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men Aspergillus niger” do sinh viên Lê
Thị Trang thực hiện và báo cáo đã đƣợc hội đồng chấm luận văn thông qua.
Giáo viên hƣớng dẫn

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2010

Chủ tịch hội đồng

Ngành Công nghệ thực phẩm

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

L I CẢM TẠ


Là sinh viên của trƣờng Đại Học Cần Thơ, chúng tôi luôn đƣợc những điều kiện học
tập và sự quan tâm sâu sắc của Trƣờng, Khoa nói chung, sự dạy bảo truyền đạt tận
tình của quý Thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng. Nhờ sự tận tình dạy
bảo của thầy cô và sự giúp đỡ của các bạn cùng với sự cố gắng của bản thân, đề tài
luận văn tốt nghiệp của tôi đã hoàn thành. Để có đƣợc kết quả này, tôi xin trân trọng
gửi lời cảm ơn đến:
-

Cô Trần Thanh Trúc và Thầy Nguyễn Văn Mƣời, những ngƣời đã trực tiếp
hƣớng dẫn, theo dõi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề
tài.

-

Thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu trong suốt thời gian gần 4 năm học tập tại trƣờng.

-

Cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông
Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu của mình.

-

Các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Thực Phẩm khoá 33 và các anh chị cao
học đã nhiệt tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến và động viên tôi trong suốt thời
gian thực hiện đề tài này.

Cuối lời xin kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công.
Xin chân thành cảm ơn !

Cần Thơ, ngày 10 tháng 12 năm 2010
Sinh viên thực hiện

LÊ THỊ TRANG

Ngành Công nghệ thực phẩm

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT


Đề tài: “Vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt tính pectin methylesterase sinh ra từ sự
lên men Aspergillus niger” được thực hiện nhằm tìm ra nguồn dinh dưỡng và khoáng thích
hợp cho quá trình lên men từ nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo và vỏ cam.
Trong đó, ba nguồn khoáng bổ sung cho hoạt động nấm mốc đã được khảo sát gồm MgCl2,
KCl và CaCl2, nguồn dinh dưỡng nitrogen được bổ sung từ urea, pepton, (NH 4)2SO4 và
NH4H2 PO4 với nồng độ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME hoạt tính cao. Bên cạnh
đó, nguồn carbohydrate thích hợp cho hoạt động của Aspergillus niger sinh enzyme PME
cũng được thử nghiệm bằng cách bổ sung một lượng vỏ bưởi sấy khô với tỷ lệ từ 2,5 đến 10%
vào cơ chất lên men.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính enzyme PME thu nhận cao nhất khi A.niger được nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung 0,5% MgCl2 và 1,5% CaCl2. Thêm vào đó, việc bổ sung
nguồn dinh dưỡng từ urea 0,1% cho hiệu quả sinh PME từ A.niger cao hơn hẳn các trường
hợp còn lại, hoạt tính PME lên đến 36,93 U/mL. Đồng thời, việc bổ sung 5% vỏ bưởi làm gia
tăng lượng pectin trong môi trường lên men, điều chỉnh độ DE của cơ chất và tạo điều kiện
thích hợp cho sự sinh tổng hợp PME đạt hiệu quả cao nhất. Hoạt tính của PME thu được
tăng 1,15 lần so với mẫu không bổ sung vỏ bưởi và tăng gần 2 lần so với mẫu nuôi cấy trong
điều kiện không có sự hỗ trợ của khoáng và nitrogen.

Ngành Công nghệ thực phẩm

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
L I CAM OAN .......................................................................................................................... i

L I CẢM TẠ ................................................................................................................................ ii
TÓM TẮT ..................................................................................................................................... iii
MỤC LỤC..................................................................................................................................... iv
DANH S CH H NH ................................................................................................................... vi
DANH S CH ẢNG ................................................................................................................. vii
Chƣơng 1

ẶT VẤN

Ề ......................................................................................................... 1

1.1

Tổng quan ....................................................................................................................... 1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................................... 2

Chƣơng 2
2.1

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................................... 3

Giới thiệu về Pectin methylesterase............................................................................ 3

2.1.1

Cấu trúc, đặc tính, cơ chế hoạt động thủy phân của PME .................................. 3

2.1.2

Nguồn tổng hợp PME .............................................................................................. 5

2.1.3

Một số ứng dụng của PME trong chế biến thực phẩm .......................................... 6

2.2 Kỹ thuật trích ly PME từ nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo và vỏ
cam .......................................................................................................................................... 8
2.2.1

Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger ............................................................... 8

2.2.2

Môi trường nuôi cấy ................................................................................................ 9

2.2.3

Phương pháp nuôi cấy........................................................................................... 10

2.2.4

Thu nhận enzyme ................................................................................................... 12

2.3

Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp PME ............................................. 12

2.3.1

Môi trường nuôi cấy .............................................................................................. 12

2.3.2

Độ ẩm ..................................................................................................................... 13

2.3.3

pH ........................................................................................................................... 13

2.3.4

Thời gian nuôi cấy ................................................................................................. 13

2.3.5

Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................................... 14

2.3.6

Nguồn khoáng và dinh dưỡng bổ sung................................................................. 14

2.4

Một số nghiên cứu có liên quan................................................................................. 15

Chƣơng 3
3.1

PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU ............................... 17

Phƣơng tiện thí nghiệm .............................................................................................. 17

Ngành Công nghệ thực phẩm

iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

3.1.1

Địa điểm, thời gian ................................................................................................ 17

3.1.2

Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................ 17

3.1.3

Thiết bị, hóa chất ................................................................................................... 17

3.1.4

Môi trường nuôi cấy .............................................................................................. 18

3.2

Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 18

3.2.1

Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu .................................................... 18

3.2.2

Phương pháp xử lý số liệu..................................................................................... 19
ố trí thí nghiệm .......................................................................................................... 19

3.3

Thông số cố định.................................................................................................... 19

3.3.1

3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung đến khả
năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger ....................................................... 19
3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến
khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger................................................ 21
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh
pectin methylesterase từ Aspergillus niger ........................................................................ 23
3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần carbohydrate bổ sung đến khả
năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger....................................................... 24
Chƣơng 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 27

4.1 Ảnh hƣởng của thành phần khoáng bổ sung riêng lẽ đến khả năng sinh pectin
methylesterase từ Aspergillus niger ..................................................................................... 27
4.2 Ảnh hƣởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng sinh pectin
methylesterase từ Aspergillus niger ..................................................................................... 29
4.3 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin
methylesterase từ Aspergillus niger ..................................................................................... 31
4.4 Ảnh hƣởng thành phần carbohydrate bổ sung đến khả năng sinh pectin
methylesterase từ Aspergillus niger ..................................................................................... 33
Chƣơng 5

KẾT LUẬN VÀ Ề NGHỊ ................................................................................. 35

5.1

Kết luận ......................................................................................................................... 35

5.2

ề Nghị.......................................................................................................................... 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................................... 36
PHỤ LỤC 1

PHƢƠNG PH P PHÂN TÍCH .................................................................... viii

PHỤ LỤC 2

KẾT QUẢ THỐNG KÊ ................................................................................... xi

Ngành Công nghệ thực phẩm

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH S CH H NH
Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME ..................................................................................... 3
Hình 2: Phản ứng thuỷ phân pectin dƣới sự xúc tác của PME .................................................... 4
Hình 3: Nấm mốc Aspergillus niger ............................................................................................. 8
Hình 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................................ 20
Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ................................................................................................ 22
Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................................ 24
Hình 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 ................................................................................................ 25
Hình 8: Đồ thị so sánh ảnh hƣởng của các loại khoáng bổ sung tối ƣu đối với hiệu quả gia
tăng hoạt tính PME từ A.niger ..................................................................................................... 29
Hình 9: Đồ thị so sánh ảnh hƣởng của các loại khoáng bổ sung kết hợp đối với hiệu quả gia
tăng hoạt tính PME từ A.niger ..................................................................................................... 30

Ngành Công nghệ thực phẩm

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33- 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH S CH ẢNG
Bảng 1: Hiệu quả xử lý nƣớc táo và nƣớc vải bằng chế phẩm enzyme pectinase ..................... 7
Bảng 2: Thành phần pectin của táo, cam và một số loại trái cây .............................................. 10
ảng 3: Phƣơng pháp phân tích và đo đạc các ch tiêu trong nghiên cứu ................................ 19
Bảng 4: Ảnh hƣởng của nồng độ và loại khoáng bổ sung đến sự thay đổi hoạt tính của PME
từ A.niger ...................................................................................................................................... 27
Bảng 5: Ảnh hƣởng của các loại khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng sinh tổng hợp PME từ
A.niger ........................................................................................................................................... 30
Bảng 6: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng và nguồn nitrogen bổ sung đến hoạt tính PME từ quá
trình sinh tổng hợp A.niger .......................................................................................................... 32
Bảng 7: Ảnh hƣởng của nguồn carbohydrate và hàm lƣợng bổ sung đến hoạt tính PME từ quá
trình sinh tổng hợp A.niger .......................................................................................................... 34

Ngành Công nghệ thực phẩm

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƢƠNG 1

1.1

Trường Đại học Cần Thơ

ẶT VẤN Ề

Tổng quan

Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, điều khiển hoạt động PME đóng vai trò hết sức
quan trọng, cụ thể là trong sản xuất nƣớc quả citrus đục (Nath and Ranganna, 1977),
giúp tăng độ nhớt trong sản xuất nƣớc quả và puree cà (Nath et al., 1983), hoặc góp
phần cải thiện cấu trúc và độ cứng chắc trong quá trình chế biến một số loại rau quả
(Pilnik and Voragen, 1991; Stanley et al., 1995).
Hoạt động của enzyme PME trong thực phẩm có thể đƣợc thúc đẩy bằng cách kích
hoạt nội enzyme hay bổ sung thêm chế phẩm enzyme (Duvetter, 2007; Tran et al.,
2008). Tuy nhiên, một số loại rau quả PME nội bào rất thấp đồng thời việc kích hoạt
PME bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm, vì vậy
việc nghiên cứu bổ sung chế phẩm enzyme PME là biện pháp khả thi nhất
So với pectinase từ thực vật, sản xuất pectinase từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm hơn
nhƣ: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, tiết ra enzyme dễ dàng trên cơ chất rẽ tiền
và có hiệu suất thu hồi cao (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Tuy vậy, việc sử dụng rộng
rãi nhóm emzyme này và sản xuất PME thƣơng mại vẫn chƣa đƣợc quan tâm nhiều ở
nƣớc ta, việc nhập khẩu PME từ nƣớc ngoài thƣờng có giá rất cao. Chính vì thế,
nghiên cứu trích ly PME trong điều kiện hiện tại ở Việt Nam là cần thiết.
PME có thể đƣợc sản xuất từ rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc nhƣ: Aspergillus sp,
Botrytis cinerea, Fusarium monilforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp…
(Polizeli et al.,1991), nhƣng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Torres et al.,2005). Trong
nhóm này, việc ly trích PME từ Aspergillus niger cũng đƣợc ƣu tiên chọn lựa
(Schmitz, WO 03/000876).
Mặc dù vậy, hiệu quả trích ly PME từ nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều các thông số
nhƣ điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ pha loãng của cơ chất, pH, nhiệt độ, thời gian ủ cũng nhƣ
tác động của các thành phần khoáng vi lƣợng, nguồn dinh dƣỡng bổ sung… (Berovic
et al., 1993; Schmitz, 2002; Hamdy, 2005; Joshi et al., 2006). Hiệu quả trích ly cũng
nhƣ hoạt tính của PME sẽ đƣợc cải thiện khi các thông số trên đƣợc thực hiện ở giá trị
tối ƣu. Do đó, việc khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của PME cần đƣợc
quan tâm.
Chính vì vậy, đề tài “vai trò của khoáng và dinh dưỡng đến hoạt tính enzyme PME

sinh ra từ sự lên men Aspergillus niger” đã đƣợc nghiên cứu.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 1


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

1.2

Trường Đại học Cần Thơ

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát vai trò của khoáng và nguồn dinh dƣỡng bổ
sung đến hoạt tính của enzyme pectin methylesterase sinh ra từ sự lên men nấm mốc
Aspergillus niger để thu đƣợc nguồn enzyme có hoạt tính cao.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

CHƢƠNG 2

2.1

Trường Đại học Cần Thơ

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

Giới thiệu về Pectin methylesterase

Pectin methylesterase (PME, Pectinesterase (PE), EC 3.1.1.11) thuộc nhóm enzyme
pectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân pectin. PME thƣờng tấn công vào các
nhóm ester methyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân
cắt nhóm methoxyl (-OCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectic
và methanol.

Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME
(Nguồn: Reinikainen, 2004)

2.1.1 Cấu trúc, đặc tính, cơ chế hoạt động thủy phân của PME
i. Cấu trúc
PME có 2 dạng cấu trúc là bậc I và bậc II. Ở cấu trúc bậc I, PME là một chuỗi acid
amin cao. Trung tâm hoạt động cố định gồm các acid amin: 2 acid aspartic, arginine, 2
glutamine và các acid amin có nhân thơm liên kết với khớp phản ứng. Cấu trúc bậc II
của PME là dạng cấu trúc β-helix. Đây là cấu trúc dạng vòng xoắn có gấp nếp β-helix
theo hƣớng phải, bao gồm 3 chuỗi β-sheet song song và có những đoạn dạng vòng
đƣợc kéo ra từ lõi của vòng xoắn, nó tạo ra một vùng sâu giống nhƣ khe nứt. Khe nứt
thƣờng tạo nên bởi những gốc có vòng thơm và 2 gốc aspartate, tƣơng ứng với trung
tâm hoạt động của PME (Jenkins et al., 2001; Johansson et al., 2002; D’Avino et al.,
2003).
ii. Đặc tính sinh lý sinh hóa

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 3


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

PME từ những nguồn khác nhau có những đặc trƣng không giống nhau. Nhiều loại
PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa đƣợc tìm thấy ở các thực vật
2 lá mầm ( ordenave et al., 1996). PME là những enzyme có kích thƣớc trung bình và
phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003). Điểm đẳng điện của PME
thay đổi từ 3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến 11 đối với PME cà chua. Hầu hết
PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, ch một vài trƣờng hợp có PME
có tính acid (Bordenave, 1996).
Việc đo lƣờng hoạt tính đã ch ra có sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các bộ phận
khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau ( ordenave and Goldberg, 1993).
Nhìn chung, PME rất nhạy cảm đối với môi trƣờng chứa ion và chịu tác động lớn bởi
pH. Hầu hết PME thực vật có pH tối ƣu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH tối ƣu của PME
vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996). Giá trị pH tối thích cho hoạt
động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là phù hợp cho
PME từ Aspergillus (Duvetter, 2006). PME thƣờng đƣợc hoạt hóa bởi các ion Ca 2+ và
Mg2+.
Hai nguồn đƣợc dùng sản xuất PME là từ thực vật (cà chua, cam, táo, cà rốt…) và vi
sinh vật (nấm mốc Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger…).
iii. Cơ chế hoạt động thủy phân của PME
Phản ứng thủy phân pectin đƣợc thực hiện ở đơn vị galacturonic chứa ester bên cạnh
nhóm carboxyl tự do hoặc từ cuối chuỗi pectin (Rexova-Benkova et al., 2004). Kết
quả là hình thành methanol và chất pectin có độ methoxyl thấp hơn (pectinic acid hoặc
pectic acid).

Hình 2: Phản ứng thuỷ phân pectin dƣới sự xúc tác của PME
(Nguồn: Sila. et al, 2003)

Khi enzyme hoạt động, không phải toàn bộ cấu trúc enzyme tham gia hoạt động xúc
tác mà ch có trung tâm hoạt động của enzyme tham gia phản ứng. Trung tâm hoạt
động của enzyme do cấu trúc của enzyme tạo ra.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Dựa trên cấu trúc của PME carrot, Johansson et al. (2002) đề nghị cơ chế hoạt động
nhƣ sau: trung tâm hoạt động của PME carrot bao gồm Asp157, Arg225, Gln113,
Gln115 và Asp136. Trong đó, Asp157 có liên kết hydro gắn với cả oxy và Arg225.
Arg225 đƣợc xem là một phần tử ái điện tử tấn công chủ yếu vào nhóm carbon từ
carboxymethyl và carbonyl của pectin. Asp136 liên kết với Phe160, có tính acid trong
giai đoạn đầu phản ứng và methanol đƣợc tách ra. Tiếp theo, Asp136 có khả năng
phản ứng nhƣ một base tách hydrocuar một phân tử nƣớc để cắt liên kết hóa trị giữa
cơ chất và Asp157 và phục hồi lại trung tâm hoạt động cho enzyme (Johansson et al.,
2002).
2.1.2 Nguồn tổng hợp PME
i. Thực vật
PME có nhiều trong hầu hết các loại trái cây. Đặc biệt có nhiều trong cà chua, chuối,
cam, táo,… PME ở thực vật thƣờng tồn tại dạng đồng phân. Thông thƣờng, các dạng
đồng phân của chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI và khối lƣợng phân tử
(Bordenave, 1996). Mối quan hệ t lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy

theo mức độ tăng trƣởng của trái và các nguồn PME khác nhau (Bordenave and
Goldberg, 1993). Ví dụ nhƣ cà chua có hai loại đồng phân là PME1 và PME2. Trong
giai đoạn trái bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhƣng ở giữa giai đoạn chín thì
PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối quá trình chín (Nguyễn Đức Lƣợng,
2004). Hoặc nhƣ hai dạng đồng phân của PME trong cam, PME1 có pI là 10,05 và
PME2 có pI > 11. Các đồng phân PME trong kiwi thì có cùng khối lƣợng phân tử,
cùng pI nhƣng lại khác nhau về tính bền nhiệt (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
PME thực vật nói chung có hoạt độ tối ƣu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim
loại ở nồng độ thấp nhƣ Ca2+ có khuynh hƣớng làm tăng độ hoạt động của enzyme.
Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ lần lƣợt là
0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996).
Các PME ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự
do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid
không bị ester hóa rất mẫn cảm với calcium (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Hoạt tính của PME thực vật có thể đƣợc gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt đƣợc
cƣờng độ hoạt động tối ƣu ở áp suất thay đổi trong khoảng 200 ÷ 500 MPa và nhiệt độ
từ 50 ÷ 57°C (Verlent et al., 2004).
ii. Vi sinh vật
Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 5


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terrus, Aspergillus

saitoi, Penicillium glaucum, Penicillium chrysogenum, Penicillium expanam,
Penicillium Cilimim, Fusarium monniliforme,…
Nấm men: Saccharomyces fragilis,…
Vi khuẩn: bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes,
Erwinia,…
Các PME có nguồn gốc từ nấm mốc chịu nhiêt hơn so với các PME có nguồn gốc
thực vật. Các PME của nấm mốc khác với PME của thực vật theo cơ cấu đa dạng, các
nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Ly Nguyen, 2004).
Nấm mốc là nguồn cung cấp enzyme, đặc biệt là hệ enzyme pectinase. PME từ nấm
mốc là các loại enzyme ngoại bào. Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ƣu từ
30  45oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ lớn hơn 55oC. pH tối ƣu của nấm mốc trong
khoảng 3  5,5. PME từ các loài Aspergillus là điển hình cho các PME có điểm đẳng
điện và pH tối ƣu trong vùng acid. Hoạt động của PME từ A.niger đạt tối đa ở pH 4,5
và nhiệt độ 400C. Trong khi pH tối ƣu của PME từ A.species là 3,7  4,2 và PME từ
A.sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.1.3 Một số ứng dụng của PME trong chế biến thực phẩm
Trong sản xuất nƣớc quả và rƣợu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa học
lớn. Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nƣớc
trái cây và rƣợu vang là do sự hiện diện các hợp chất pectic đặc biệt là pectin, các chất
này nằm ở thành tế bào đƣợc phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm
enzyme sử dụng trong sản xuất nƣớc quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là
đối với những quả có nhiều pectin, độ nhớt cao) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
cô đặc dịch quả, làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật.
Việc thu nhận nƣớc quả từ trƣớc đến nay chủ yếu bằng phƣơng pháp ép. Nếu pectin
còn nhiều sẽ theo vào nƣớc quả gây ra hiện tƣợng nƣớc quả bị đục, có độ keo cao và
rất khó lọc trong.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 6

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

ảng 1: Hiệu quả xử lý nƣớc táo và nƣớc vải bằng chế phẩm enzyme pectinase
Hiệu

Hàm

Độ

Đƣờng

Pectin

Điểm

suất

lƣợng

acid

(%)

(%)

đánh

nƣớc

chất

chuẩn

giá

quả

khô

(%)

cảm

(%)

(%)

a- Không có chế phẩm enzyme

71,2

10,2

0,53

6,7

0,33

4,5

b- Có chế phẩm enzyme

78,8

11,5

0,62

8,0

0,15

4,8

a- Không có chế phẩm enzyme

49,2

8,5

0,91

5,62

0,26

3,8

b- Có chế phẩm enzyme

72,4

10,2

1,16

7,4

0,12

4,3

Loại nƣớc quả

quan

Nƣớc quả từ táo

Nƣớc quả vải

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ứng dụng quan trọng nhất của PME trong công nghiệp chế biến thực phẩm là khả
năng cải thiện cấu trúc của rau quả đóng hộp ( aker và Wicker, 1996). Khi đƣợc kích
hoạt, PME phân cắt nhóm ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion

Ca2+, tạo độ giòn và độ cứng chắc cho sản phẩm.
Ảnh hƣởng của sự tách loại nhóm methoxyl trong phân tử pectin đối với độ cứng mô
thực vật bao gồm hai hiện tƣợng: ở mô chƣa xử lý, sự hiện diện các nhóm carboxyl tự
do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calcium giữa hai mạch pectin, và
ở mô đã xử lý nhiệt sẽ có sự gia tăng liên kết với Ca2+ và làm giảm nguy cơ bị tự phân
cắt hay còn gọi là β – elimination (Sajjaanatukal và Pitifer, 1991).
Tuy nhiên, một vài loại trái cây ch chứa một lƣợng rất nhỏ PME nội bào. Do đó nhiều
phƣơng pháp khác nhau đƣợc đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật nguyên vẹn
và cách đơn giản nhất là phƣơng pháp ngâm – thấm thụ động. Tuy nhiên đây là một
quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mô ch giới hạn ở bề mặt. Vì thế cần có
sự hiện diện của các chất phụ gia. Nếu trong mô có khoảng không chứa khí đáng kể
thì phải tiến hành dƣới áp lực trực tiếp hoặc là chân không. Kỹ thuật trong trong chân
không (vacuum infusion – VI) đƣợc sử dụng trong nhiều quá trình chế biến khác nhau
để cải thiện chất lƣợng về cấu trúc của sản phẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành
phần chức năng trong sản phẩm.
Ngâm bằng kỹ thuật chân không áp dụng cho trái đào cắt nửa với PME của bƣởi và
CaCl2 đã làm tăng đáng kể độ cứng của trái đào đóng hộp. Theo aker và Wicker
(1996), có mối tƣơng quan giữa mức độ ester hóa của pectin với khả năng cải thiện độ

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

cứng. Kỹ thuật trong trong chân không của PME nấm mốc với CaCl2 đƣợc khảo sát
thấy có hiệu quả cải thiện độ cứng cho dâu tây cắt nửa lạnh đông.

2.2
Kỹ thuật trích ly PME từ nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo
và vỏ cam
2.2.1 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger

Hình 3: Nấm mốc Aspergillus niger
(nguồn: )

Aspergillus thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti), cuống
đính bào tử có đầu phình ra. Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng
bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính
bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử. Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tƣơng. Sợi nấm
có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuỗi bào tử bụi từ đầu
phồng mọc tỏa khắp mọi hƣớng. ào tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu
đen (Aspergillus niger) (Abarca et al., 2004).
Aspergillus niger đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm trong nhiều thập
kỷ qua và không có tác động xấu đến sức khỏe con ngƣời (Dijck et al., 2003). Thêm
vào đó, sản phẩm từ Aspergillus niger cũng đƣợc Viện nghiên cứu thực phẩm và
thuốc của Mỹ (FDA) chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS).
Nấm mốc Aspergillus niger thƣờng đƣợc tìm thấy trong quá trình thu hoạch và bảo
quản các loại thực phẩm nhƣ đậu phộng, bắp, táo, lê, đào, nho, dâu tây, cà chua và dƣa
(Pitt và Hocking, 1997).
A.niger thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất enzyme (nhƣ galactosidases, lipases, protease, hemicellulase, cellulases và pectinases) và acid hữu
cơ. Pectinases thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 8


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

thực vật. Trong khi đó, các acid hữu cơ nhƣ acid citric đƣợc sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc nhƣ một phụ gia tạo vị, điều ch nh
acid, chất ổn định hay bảo quản (Magnuson và Lasure, 2004).
Ngay từ năm 1917, A.niger đã đƣợc sử dụng để sản xuất acid citric (Raper và
Femmel, 1965). Ngày nay, acid citric đƣợc sản xuất từ A.niger với sản lƣợng khoảng
700.000 ÷ 1.000.000 tấn/năm (Ikasari et al., 1996; Magnuson và Lasure, 2004; Prado
et al, 2005). Khoảng 70% acid citric sản xuất đƣợc sử dụng trong các loại thực phẩm
và sản phẩm bia, phần còn lại thƣờng đƣợc ứng dụng trong ngành dƣợc (Magnuson và
Lasure, 2003; Prado et al., 2005).
Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A.niger, thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến
trong công nghệ chế biến nƣớc quả, kế đến là cellulases và hemicellilases, hàng năm
doanh số thu đƣợc từ ba dạng enzyme này xấp x 20% một triệu đô la Mỹ (Kashyap et
al., 2001).
A.niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử
pectin. Chúng bao gồm pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin acetylesterase
(EC 3.1.1.6), endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC
3.2.1.67),… Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra pectin có độ
methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và pectate lyase.
Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất có độ methyl ester bất kỳ
(Christensen et al., 2001).
2.2.2 Môi trường nuôi cấy
i. Khái quát về nguyên liệu táo và cam
Táo ta và cam sành là hai loại quả chủ lực ở Việt Nam, đặc biệt là ở đồng bằng sông
Cửu Long (Lê Thanh Phong, 2004; Hà Văn Thuyết và Trần Quang ình, 2002). Táo
ta có tên khoa học là Ziziphus nummularia thuộc họ Rhamnaceae. Đây là loài cây ăn
quả của vùng nhiệt đới, là loại cây đƣợc trồng khá phổ biến ở đồng bằng sông Cửu
Long. Cây có thể lớn rất nhanh thậm chí trong các khu vực khô và cao tới 12 mét và

đạt tuổi thọ 25 năm.
Táo là một trong những loại quả chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng quý giá và giúp chữa
rất nhiều bệnh nguy hiểm: giảm các bệnh đƣờng ruột, hạ lƣợng cholesterol trong máu,
ngăn ngừa bệnh ung thƣ…
Cam sành có tên khoa học là Citrus grandis, là một giống cây ăn quả thuộc chi Cam
chanh, có nguồn gốc từ Việt Nam. Quả cam sành rất dễ nhận ra nhờ lớp vỏ dầy, sần
sùi giống bề mặt mảnh sành, và thƣờng có màu lục nhạt (khi chín có sắc cam), các
múi thịt có màu cam. Đây là loại quả có giá trị dinh dƣỡng cao, thành phần múi chứa

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

từ 6÷12% đƣờng, hàm lƣợng vitamin C từ 40 ÷ 90mg/100 gam cam sành tƣơi, các axit
hữu cơ từ 0,4 ÷ 12% trong đó nhiều loại khoáng chất, dầu thơm có lợi cho sức khỏe.
Táo và cam cũng giống nhƣ nhiều loại quả khác có rất nhiều pectin đặc biệt là phía
trong lõi (Joshi, 2006), nên đƣợc chọn làm cơ chất để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp
PME.
ảng 2: Thành phần pectin của táo, cam và một số loại trái cây
Trái cây

Pectin (% w/w)

Loại pectinase

pH

Táo

0,7 – 0,8

PE – PG

3,5

Chuối

0,5 – 0,6

PE – PG

3,2

Sơri

0,2 – 0,3

PE

3,0

Cam

0,6 – 0,9

PE

2,2
(Nguồn: Bollag, 1991)

ii. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Trong quá trình chuẩn bị môi trƣờng, điều quan trọng nhất là tạo đƣợc độ ẩm thích
hợp. Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi trƣờng cám là
60%. Độ ẩm vƣợt quá 60% thƣờng tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó
dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Nếu độ ẩm nhỏ hơn 60% (thƣờng 45 ÷ 50%) thƣờng
gây hiện tƣợng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, và nhƣ vậy enzyme thu sẽ giảm hoạt tính
rất mạnh.
Sau khi chuẩn bị xong môi trƣờng, tiến hành thanh trùng môi trƣờng để tiêu diệt các
vi sinh vật nhiễm vào môi trƣờng mà có thể ức chế sự phát triển của giống vi sinh vật
mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thƣờng, môi trƣờng sẽ đƣợc thanh trùng bằng hơi nƣớc nóng
ở 121oC trong thời gian 15 ÷ 30 phút.
Môi trƣờng nuôi cấy sẽ đƣợc trải đều vào các khay và tiến hành trộn giống vi sinh vật
vào khối môi trƣờng sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme
vào khoảng 36 ÷ 60 giờ.
(Schmitz, 2002; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.2.3 Phương pháp nuôi cấy
Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sản xuất enzyme PME có thể đƣợc
thực hiện theo cả hai phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt với môi trƣờng rắn và lên men
chìm. Trong đó, phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo điều kiện cho vi
sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông
thƣờng, môi trƣờng dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp
nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dƣỡng khác

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 10


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

(amonium sulfate, amonium chloride, amonium phosphate). Phƣơng pháp này phát
triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay. Những ƣu điểm cơ bản của phƣơng pháp
nuôi cấy bề mặt:
- Dễ thực hiện, quy tr ình công nghệ đơn giản
- Lƣợng enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với
nuôi cấy chìm
- Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng rắn khi nuôi cấy bằng phƣơng
pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1:
Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt
đầu trƣơng nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi:
- Nhiệt độ tăng rất chậm
- Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa
- Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi
- Khối môi trƣờng còn rời rạc
- Enzyme mới bắt đầu đƣợc hình thành.
Giai đoạn 2:
Giai đoạn này kéo dài khoảng 14 ÷ 18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ
bản nhƣ sau:
- Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh,
có thể nhìn rõ đƣợc sợi nấm
- Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt

- Độ ẩm môi trƣờng giảm dần
- Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể đạt đến 40 ÷ 45oC
- Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi
- Các enzyme đƣợc hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc
tạo ra nhiều hơn
- Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này
cần phải đƣợc thông khí mạnh là tốt nhất.
Giai đoạn 3:

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ÷ 12 giờ. Lúc này nhiệt độ khối môi trƣờng sẽ giảm
dần, cƣờng độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt. Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi
và thể hiện màu đặc trƣng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.2.4 Thu nhận enzyme
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc
gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh
vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng.
Tùy theo mục đích sử dụng, có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá
trình tinh sạch. Trong những trƣờng hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành tinh sạch
enzyme. Để thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme PME tinh khiết thì chế phẩm enzyme
thô phải đƣợc trích ly bằng phƣơng pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối trung
tính.

Muối trung tính nhƣ amonium sulfate, natri chloride thƣờng đƣợc sử dụng để kết tủa
enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ,
không làm biến tính enzyme, enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các
enzyme thu đƣợc bằng phƣơng pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử
dụng muối trung tính cũng có nhƣợc điểm là lƣợng dung dịch dùng gấp 5 ÷ 6 lần dịch
chiết enzyme và không thể tái thu hồi đƣợc dung môi.
Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu đƣợc không mất hoạt tính nhanh, ngƣời ta thƣờng
sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá
trình sấy thƣờng nhỏ hơn 10%. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta
thƣờng sấy enzyme ở nhiệt độ 38 ÷ 40oC. Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến
đổi. Trong trƣờng hợp sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC, enzyme rất dễ bị biến tính
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3

Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp PME

2.3.1 Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trƣờng là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng nhƣ
các enzyme khác từ vi sinh vật, trong đó thành phần pectin giữ vai trò rất quan trọng
(Patil, 2006). Các phụ phẩm nông nghiệp nhƣ cám mì (Taragano et al., 1997), bã mía,
bã củ cải đƣờng (Solis-Pereira et al., 1993), xác đậu cô ve (Boccas et al., 1994), vỏ
chanh (Larios et al., 1989) và bã táo (Hours et al., 1988; Joshi et al., 2006) có hàm
lƣợng pectin cao (15  25%) đƣợc biết đến nhƣ nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản
xuất pectinase cũng nhƣ PME nguồn gốc vi sinh vật.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 12

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.2 Độ ẩm
Độ ẩm cao của môi trƣờng ảnh hƣởng đến độ thoáng khí trong khi độ ẩm thấp quá sẽ
kiềm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của sợi nấm cũng nhƣ khả năng tạo enzyme.
ên cạnh việc ảnh hƣởng đến độ thoáng khí, độ ẩm của môi trƣờng còn liên quan đến
sự kết dính, từ đó ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi cũng nhƣ
khả năng tạo enzyme.
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trƣờng là 58 ÷ 60% và phải
giữ cho độ ẩm của môi trƣờng ổn định trong quá trình nuôi. Độ ẩm vƣợt quá 70% làm
giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50  55% thì kiềm hãm sự sinh trƣởng và
phát triển của vi sinh vật cũng nhƣ tạo enzyme (Ashok et al., 2000).
Khi nuôi cấy trong điều kiện không đƣợc vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trƣờng sau
khi cấy giống không đƣợc vƣợt quá 60%, vì cao hơn sẽ dễ bị nhiễm khuẩn (Joshi et
al., 2006).
2.3.3 pH
Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt, do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và hàm
ẩm thấp nên pH môi trƣờng thƣờng ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy. Tuy
nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự phát triển
của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Khi pH môi trƣờng dịch về phía acid hoặc phía
kiềm, sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hƣởng nhƣng sự tạo thành enzyme
pectinase bị kiềm hãm. pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong
khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007). Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng
enzyme, loại cơ chất và chủng nấm mốc, giá trị pH tối thích cho hoạt động của
A.niger sinh tổng hợp PME là khác nhau. Chính vì thế, cần thiết phải xác định điều
kiện pH ban đầu của môi trƣờng nuôi cấy đến hiệu quả thu nhận enzyme mong muốn.
2.3.4 Thời gian nuôi cấy
Thời gian lên men cũng ảnh hƣởng đáng kể đến việc sản sinh enzyme cũng nhƣ hoạt

tính của enzyme. Vi sinh vật cần thời gian đủ dài để phát triển và sản sinh enzyme.
Tuy nhiên, khi thời gian ủ quá dài, môi trƣờng cạn dần chất dinh dƣỡng, vi sinh vật
phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm.
Thời gian nuôi cấy để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực
nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tƣợng không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính
enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thƣờng kết thúc
khi nấm bắt đầu sinh bào tử đính (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Nấm mốc Aspergillus
niger thƣờng đƣợc nuôi cấy trong thời gian 48 đến 96 giờ cho quá trình sinh tổng hợp
PME (Smith, 2002; Joshi et al., 2006).

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 13


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.3.5 Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của
nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme.
Nhiệt độ nuôi cấy cũng là yếu tố quan trọng đối với sự sinh trƣởng của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme. Nếu không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ làm giảm hoạt lực
của các enzyme. Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30oC.
Nhiệt độ thấp hoặc cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trƣởng của nấm mốc, đến một mức tới
hạn nào đó sẽ ức chế hoàn toàn sự phát triển của chúng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004;
Joshi et al., 2006).
2.3.6 Nguồn khoáng và dinh dưỡng bổ sung
Vi sinh vật cũng nhƣ tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong các quá trình sống để

xây dựng tế bào. Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều có chứa nitơ
(protein, acid nucleic, enzyme, …).
Trong tất cả các môi trƣờng nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitơ mà vi
sinh vật có thể đồng hóa đƣợc. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần để đảm bảo đƣợc hiệu
suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất vi sinh vật. Các nguồn nitơ dùng trong
công nghiệp lên men thƣờng là các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ (Lƣơng Đức Phẩm,
1998).
Các nguyên tố đa, vi lƣợng có ảnh hƣởng lớn tới sinh trƣởng và tổng hợp enzyme của
vi sinh vật. Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và nhiều
coenzyme, đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy hóa sinh học.
Phospho ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác.
Cation Mg2+ có ảnh hƣởng đến độ bền nhiệt của enzyme. MgSO4 sẽ có ảnh hƣởng xấu
đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi. Lƣu huỳnh kích thích tạo enzyme (Lƣu huỳnh
có trong thành phần các acid amin quan trọng nhƣ methionine, cystein). Ngoài ra,
calcium, mangan, corban, … cũng ảnh hƣởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức
Lƣợng, 2004).
Những hợp chất khoáng của môi trƣờng có nhiều ý nghĩa sinh lý khác nhau. Một trong
những tính chất của chúng là làm thay đổi trạng thái hóa keo của tế bào chất. Dƣới tác
dụng của những muối vô cơ, lớp bề mặt tế bào không ngừng thay đổi và dẫn đến làm
thay đổi tốc độ các phản ứng enzyme trong quá trình trao đổi chất (Lƣơng Đức Phẩm,
1998).
Theo nhiều tác giả, các ion K+, Na+, Ca2+ có ảnh hƣởng tới hiệu quả tác dụng của
PME, Kretovits và Iarovenko (1982) thừa nhận rằng muối Ca2+ và Mg2+ nâng cao hoạt
độ của enzyme. Tuy nhiên, KCl, HCl, HgCl2, H2O2 không có tác dụng tới hoạt độ
PME trong cam trong khi acid ascorbic, NaHSO3 với nồng độ thấp có khả năng nâng
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 14

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

cao hoạt độ của enzyme này. Nghiên cứu của Hossam (2005) đã đƣa ra kết luận
EDTA, PbCl2, HgCl2 và IAA là nhân tố ức chế khả năng lên men của Aspergillus
repens, làm giảm hoạt tính PME.
2.4

Một số nghiên cứu có liên quan

PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991; SolísPereira, 1993), đặc biệt là A.niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với cả hai phƣơng thức
lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau
(Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006). Nhìn chung, đặc điểm thành phần cơ chất giàu
pectin và điều kiện môi trƣờng là những yếu tố chi phối mạnh đến hiệu quả lên men
sinh PME từ vi sinh vật.
Theo nghiên cứu của Joshi et al., (2006) về việc sinh pectin methylesterase (PME) từ
Aspergillus niger trên cơ chất bã táo đã cho thấy, nhiệt độ ủ 25oC, điều kiện pH phản
ứng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiện tối ƣu cho việc lên men sinh PME ở cả
môi trƣờng rắn (SSF) và môi trƣờng lỏng (SmF). Ngoài ra, vai trò của các nguồn nitơ
bổ sung nhƣ (NH4)2SO4, thành phần khoáng cũng nhƣ tỷ lệ pha loãng của cơ chất :
nƣớc nhằm tạo độ ẩm cho quá trình lên men sinh PME thích hợp cũng đƣợc xác định.
Theo đó, t lệ pha loãng 1: 3 (độ ẩm ban đầu của cơ chất khoảng 4%) là thông số tối
ƣu cho quá trình lên men rắn (SSF) (Joshi et al., 2006).
Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong
khoảng từ 30 ÷ 45oC và bị vô hoạt ở 55  62oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+ và Mg2+.
Phƣơng pháp trích ly PME cũng đƣợc nghiên cứu (Contreras – Esquivel, 1999), kết
quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% đƣợc sử dụng trích ly PME từ vỏ quả
chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích ly cao nhất.
Sarvamangala và cộng sự (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất

là hạt của hoa hƣớng dƣơng và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trong
quá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3%
amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính của
pectinase thu đƣợc trên môi trƣờng rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thu
đƣợc trên môi trƣờng lỏng (45,9U/g và 18,9U/g).
Vỏ cam cũng đƣợc sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất pectin lyase từ
Rhizopus oryzea với những điều kiện thích hợp (bổ sung NH4NO3, NH4Cl, nhiệt độ
đạt 50oC và pH 7,5 với sự có mặt của các chất khoáng nhƣ Ca2+, Mg2+, Na+ và K+)
(Hossam, 2005). Kết quả thu đƣợc pectin lyase với hoạt tính là 297 U/mL. Đồng thời,
nghiên cứu này cũng cho thấy ion Zn2+, Co2+, Mn2+, Hg2+ là nhân tố ức chế khả năng
sinh pectin lyase của Rhizopus oryzea.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Tóm lại, quá trình lên men sinh enzyme PME phụ thuộc rất nhiều yếu tố khác nhau, vì
vậy cần phải đƣợc khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc sử dụng, từng
loại cơ chất cũng nhƣ các điều kiện của môi trƣờng lên men.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 16