Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn aeromonas hydrophila phân lập từ cá lóc (channa striata) bị bệnh xuất huyết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN TÍN TRỌNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC
(Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Cần Thơ – 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN TÍN TRỌNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC
(Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. PHẠM MINH ĐỨC

Cần Thơ – 2011


LỜI CẢM TẠ
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với những người thân trong gia ñình,
Ba Mẹ ñã tạo mọi ñiều kiện ñể cho tôi học tập và thực hiện ñề tài tốt nghiệp.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với cán bộ hướng dẫn: Ts. Phạm Minh Đức
ñã tận tâm chỉ dẫn, ñộng viên và cho tôi những khuyên quý báu trong quá trình
tiến hành thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản,
Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ ñã truyền ñạt kiến thức và quan tâm giúp ñỡ
tôi trong quá trình thực hiện ñề tài.
Đồng thời xin gởi lời cám ơn ñến các anh chị trong bộ môn, các bạn lớp bệnh
học thủy sản khóa 33, ñặc biệt cám ơn bạn Phan Vĩnh Thịnh, bạn Đoàn Nhật
Tân lớp bệnh học thủy sản khóa 33 ñã nhiệt tình, quan tâm, giúp ñỡ trong suốt
thời gian thực hiện ñề tài.
Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tín Trọng

i

TÓT TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết” ñược
thực hiện nhằm xác ñịnh LD50 của Aeromonas hydrophyla gây bệnh trên cá
lóc, làm tiền ñề cho những nghiên cứu sau này. Chủng vi khuẩn Aeromonas
hydrophyla CĐ1012 dùng trong thí nghiệm ñược thu tại những ao cá bệnh có
biểu hiện bệnh xuất huyết như tách ñàn, bỏ ăn và bơi lội lờ ñờ trên mặt nước,
mắt lồi và ñục, xuất huyết trên thân, ở các vi và xương nắp mang, cá bơi dạng
xoắn, vẩy dễ bị rụng khi lấy ra, ở các vèo nuôi trong ao ñất ở huyện Cờ Đỏ,
thành phố Cần Thơ. Sau ñó, mẫu ñược phân lập, tách ròng và phân tích tại
phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sảnTrường Đại học Cần Thơ. Chủng vi khuẩn CĐ1012 thu ñược trong 3 lần thu
mẫu, ñược ñịnh danh bằng phương pháp PCR và xác ñịnh là chủng
Aeromonas hydrophyla. Sau ñó, thí nghiệm cảm nhiễm ñược thực hiện bằng
phương pháp tiêm chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophyla CĐ1012 lên cá lóc
giống cỡ 20-25 g/con với mật ñộ vi khuẩn 3,67x104, 3,67x105, 3,67x106,
3,67x107 CFU/ml. Sau 14 ngày tiêm, kết quả cho thấy tỉ lệ cá chết 100% ở mật
ñộ 3,67x107 CFU/ml và thấp nhất 30% ở mật ñộ 3,67x104 CFU/ml. Từ ñó xác
ñịnh ñược giá trị LD50 là 1,16x106 CFU/ml. Đa số những cá chết ñều có dấu
hiệu bệnh lý giống nhau, giống với dấu hiệu cá bệnh ñược thu mẫu tại ao nuôi.
Hai chủng vi khuẩn CT1107 và CT1109 thu ñược sau khi gây cảm nhiễm và
tái ñịnh danh bằng phương pháp PCR chính là Aeromonas hydrophila.

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................i

TÓT TẮT...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................vi
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................1
1.1 Giới thiệu...............................................................................................1
1.2 Mục tiêu ñề tài .......................................................................................2
1.3 Nội dung ñề tài ......................................................................................2
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................3
2.1 Sơ lược về cá lóc ...................................................................................3
2.2 Tình hình nuôi và một số bệnh thường gặp trên cá lóc ở ĐBSCL...........4
2.3 Sơ lược kết quả nghiên cứu bệnh cá do vi khuẩn Aeromonas .................5
2.4 Một số nghiên cứu ñộc lực về vi khuẩn Aeromonas hydrophila .............8
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................9
3.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu ..........................................................9
3.2 Vật liệu nghiên cứu................................................................................9
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị .................................................................9
3.2.2 Hóa chất và môi trường ...................................................................9
3.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................9
3.3.1 Thu mẫu cá bệnh .............................................................................9
3.3.2 Phân lập vi khuẩn ..........................................................................10
3.3.3 Định danh vi khuẩn .......................................................................10
3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm..................................................................10
3.4.1 Cá thí nghiệm................................................................................10
3.4.2 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn .........................................................10
3.4.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm .........................................................11

iii

3.4.4 Quan sát và thu thập số liệu...........................................................12
3.5 Xử lý số liệu ........................................................................................13
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................14
4.1 Dấu hiệu bệnh lý..................................................................................14
4.2 Phân lập và ñịnh danh vi khuẩn ...........................................................14
4.3 Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm......................................................16
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................22
5.1 Kết luận ...............................................................................................22
5.2 Đề xuất ................................................................................................22
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................23
PHỤ LỤC ....................................................................................................27

iv


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu cơ bản của vi khuẩn ................................................. 15
Bảng 4.2: Thời gian cá bắt ñầu chết ............................................................. 18
Bảng 4.3: Các chủng vi khuẩn tái phân lập ñược trên cá gây cảm nhiễm ...... 19
Bảng 4.4: Kết quả các chỉ tiêu cơ bản của 12 chủng vi khuẩn tái phân lập trên
cá gây cảm nhiễm ........................................................................................ 20

v


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Cá lóc môi trề, lóc bông, lóc ñen và cá chành dục........................... 3
Hình 3.1: Hệ thống xô thí nghiệm gây cảm nhiễm ....................................... 12

Hình 4.1: Cá lóc bệnh nuôi trong vèo ở Cờ Đỏ ............................................ 14
Hình 4.2: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 phân lập trên cá lóc
nuôi vèo trong ao ñất.................................................................................... 15
Hình 4.3: Kết quả ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila ..................... 15
Hình 4.4: Cá bị xuất huyết sau khi gây cảm nhiễm ...................................... 16
Hình 4.5: Biểu ñồ tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm ............................ 17
Hình 4.6: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CT1107 phân lập trên cá
gây cảm nhiễm ............................................................................................ 19
Hình 4.7: Kết quả tái ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila ................ 20

vi


PHẦN I
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và ñem lại hiệu quả
kinh tế ñáng kể cho ñất nước. Trong ñó nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng trong cả
nước. Theo báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sản
lượng thủy sản năm 2010 ñạt 2.450,8 nghìn tấn, bằng 107,6% so với cùng kỳ
năm 2009. Tính ñến quý ñầu tiên của năm nay sản lượng thủy sản với kim
ngạch trên 1,1 tỉ USD, tăng 22% so với cùng kỳ. Chỉ riêng trong tháng 3/2011,
xuất khẩu thủy sản ước ñạt 400 triệu USD, sản lượng khai thác cũng ñạt trên
600.000 tấn, tăng 2% so với cùng kỳ (www.laodong.com.vn).
Bên cạnh, cá tra là ñối tượng có giá trị kinh tế cao thì cá lóc là ñối tượng tương
ñối dễ nuôi, chất lượng thịt ngon, ñược nuôi với nhiều mô hình khác nhau
(như nuôi trong ao ñất, ao nổi, mùng vèo và lồng bè) và có thể nuôi quy mô
nhỏ ñể xóa ñói giảm nghèo hoặc nuôi thâm canh với mật ñộ cao (Lê Xuân
Sinh và Đỗ Minh Chung, 2009). Theo kết quả ñiều tra của Dương Nhựt Long

và ctv (2003) cho biết sản lượng cá lóc nuôi trong năm 2002 toàn vùng
ĐBSCL ñạt 5.294 tấn, sản lượng này tập trung chủ yếu ở các tỉnh: An Giang,
Đồng Tháp, Cần Thơ và Kiên Giang. Đến năm 2009 thì sản lượng cá lóc ñạt
hơn 40.000 tấn, tăng gần 8 lần so với năm 2002 (Báo cáo của các tỉnh ở
ĐBSCL, 2010). Sự tăng nhanh về sản lượng và ñạt ñược lợi nhuận cao nên
người dân ñã mở rộng diện tích nuôi với mật ñộ cao hơn. Điều ñáng quan tâm
là kinh nghiệm của người dân còn hạn chế, mà cụ thể là việc quản lý nguồn
nước. Người dân thường thải trực tiếp lượng nước từ ao nuôi ra sông mà
không qua xử lý. Chính nguyên nhân này ñã làm nguồn nước ngày càng ô
nhiễm, tạo ñiều kiện thuận lợi cho các tác nhân gây bệnh phát triển.
Trong thời gian gần ñây các loài thủy sản nuôi ở khu vực ĐBSCL nhiễm bệnh
hầu như quanh năm như bệnh gan thận mủ, xuất huyết, bệnh ñẹn miệng, bệnh
trắng da,…. Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện trên ñộng vật thủy
sản do vi khuẩn chiếm tới 50,9%. Theo ñiều tra của Nguyễn Thanh Phương và
ctv (2007) thì số nông hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện vào
mùa lũ chiếm tới 88%. Xuất phát từ nhu cầu phòng và trị bệnh của người nuôi,
ñề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết” ñược
thực hiện.
1


1.2 Mục tiêu ñề tài
Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012
trên cá lóc bằng phương pháp gây cảm nhiễm nhằm góp phần cung cấp tài liệu
cho những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh do vi khuẩn này gây ra trên cá.
1.3 Nội dung ñề tài
- Phân lập và ñịnh danh vi khuẩn trên cá lóc bị xuất huyết.
- Xác ñịnh LD50 của vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 trên cá lóc
trong ñiều kiện gây cảm nhiễm.

2


PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về cá lóc
Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long có 4 loài cá lóc: cá lóc ñen (Channa striata), cá lóc bông (Channa
micropletes), cá dầy (Channa lucius) và cá chành dục (Channa gachua).

Hình 2.1: Cá lóc môi trề, lóc bông, lóc ñen và cá chành dục.
(Nguồn: Dương Nhựt Long, 2003)
Cá lóc phân bố rộng từ Trung Quốc ñến Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái
Lan, Mianma, Ấn Độ và Philippines. Cá sống trong môi trường nước ngọt ở
nhiều loại thủy vực khác nhau kể cả những vùng trũng ngập nước lâu ngày.
Chúng thích nghi nơi nước tĩnh có mực nước từ 0,5-1 m. Đặc biệt, cá thích
sống ven bờ nơi có nhiều cây cỏ thủy sinh ñể rình và bắt mồi. Ngoài ra, cá có
thể sống ở nơi có hàm lượng oxy thấp nhờ có cơ quan hô hấp phụ, pH thích
hợp cho hoạt ñộng sống của cá lóc là từ 6,5-7,5. Cá có thể sống ở vùng nước
lợ (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993).
Ở Việt Nam, nghề nuôi cá lóc hình thành từ năm 1950 chủ yếu tại tỉnh An
Giang và Đồng Tháp. Trên thế giới nghề nuôi cá lóc ñã phát triển mạnh với
nhiều mô hình nuôi khác nhau. Phổ biển ở Thái Lan và Hồng Kông là mô hình
nuôi bán thâm canh trong ao ñất với thời gian nuôi từ 6-7 tháng với các loại
thức ăn như bột cá, tấm và cám. Mô hình nuôi bè với mật ñộ 30-50 con/m3, sử
dụng các loại thức ăn như cá tạp và tấm. Sau 8 tháng nuôi cá ñạt khoảng 1,52,5 kg/con phổ biến ở Campuchia và Việt Nam. Ở Đài Loan, cá lóc ñược nuôi
chung với cá rô phi, cá chép,… (Dương Nhựt Long, 2003).

3

2.2 Tình hình nuôi và một số bệnh thường gặp trên cá lóc ở ĐBSCL
Hiện nay, ở ĐBSCL có 5 loại hình nuôi cá lóc phổ biến: Ao ñất, vèo ao, vèo
sông, lồng bè và bể bạt (Lê Xuân Sinh và ctv., 2009). Dương Nhựt Long và ctv
(2003) ước tính sản lượng nuôi cá lóc năm 2002 toàn vùng ĐBSCL ñạt 5.294
tấn, sản lượng này tập trung chủ yếu ở các tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần
Thơ và Kiên Giang. Nhưng ñến năm 2009, sản lượng nuôi cá lóc ở các tỉnh
trọng ñiểm thuộc vùng ĐBSCL tăng lên rất nhanh cụ thể như sau: An Giang
ñạt 15.241 tấn cá lóc với 75,4 ha nuôi cá lóc ao hầm, 6,9 ha nuôi vèo và các
mô hình nuôi khác với 476 lồng bè (Sở NN và PTNT, Cục Thống kê tỉnh An
Giang báo cáo kết quả về ñiều tra thủy sản thời ñiểm 01-10 hàng năm về diện
tích và sản lượng cá lóc, 2009). Báo cáo kết quả ñiều tra thống kê kinh tế kỹ
thuật thủy sản tỉnh Đồng Tháp, Quý 3 năm 2009. Hiện nay, trên ñịa bàn tỉnh
Đồng Tháp tổng số hộ nuôi cá lóc là 3.299 hộ nuôi cá lóc (tăng 1.324 hộ so
với cùng kỳ năm 2008). Trong ñó có huyện Cao Lãnh là ñịa phương có số hộ
nuôi cá lóc nhiều nhất tỉnh với 672 hộ, tiếp theo là các huyện: Tân Hồng 587
hộ, Thanh Bình 461 hộ, thấp nhất là Sa Đéc chỉ có 36 hộ nuôi. Hình thức nuôi
cá lóc chủ yếu là nuôi: ao, bè, mùng, vèo… trong ñó, nuôi lồng, mùng, vèo với
quy mô nhỏ là ña số với 2.921 hộ nuôi chiếm ñến 88% số hộ nuôi cá lóc trong
toàn tỉnh, trong khi ñó nuôi cá lóc trong ao có 396 hộ nuôi chiếm 22% với
tổng diện tích la 28,15 ha. Hình thức nuôi lồng bè nhiều nhất vẫn là huyện Cao
Lãnh với 605 hộ nuôi, 594 lồng, vèo các loại. Tổng sản lượng cá lóc toàn tỉnh
dự kiến là 6.558,6 tấn, năng suất ao bình quân là 9,8 kg/m2 và nuôi lồng, mùng
có năng suất bình quân là 23,8 kg/m3. Cần Thơ ñạt 6.600 tấn với diện tích nuôi
là 160 ha trong ñó có khoảng 2700 cái vèo ao và 207 lồng bè (Nguyễn Thị
Diệp Thúy, 2010) và Hậu Giang với tổng sản lượng cá lóc toàn tỉnh là 308,4
tấn trong ñó có 634 hộ nuôi cá lóc, với 27 ha diện tích nuôi ao hầm và 12.680
m3 thể tích nuôi lồng vèo (Chi cục Thủy sản tỉnh Hậu Giang, 2009).
Sản lượng cá lóc nuôi ñang ñược phát triển rất nhanh chóng ở ĐBSCL, diện

tích và sản lượng cá nuôi ñã không ngừng gia tăng. Việc gia tăng sản lượng là
vấn ñề không khó, ñiều ñáng lo ngại là kinh nghiệm của người nuôi còn thấp,
sự ñầu tư lớn về giống, thức ăn và ñòi hỏi năng suất cao luôn là ñiều kiện tiềm
ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh, gây nên tác hại rất lớn. Bệnh xuất huyết do vi
khuẩn Aeromonas hydrophila và Pseudomonas sp. gây ra là loại bệnh phổ
biến. Cá bị bệnh thường bơi lờ ñờ trên mặt nước. Trên thân xuất hiện những
ñiểm xuất huyết nhỏ li ti, bệnh nặng các gốc vây xuất huyết, hoại tử ñuôi, xuất
hiện những vết thương trên lưng. Cá ăn ít hoặc bỏ ăn, mắt lồi, mờ ñục, xoang
bụng chứa dịch (Từ Thanh Dung, 2005). Bệnh nấm thủy mi do các loài của 2
giống nấm Saprolegnia và Achlya gây ra. Đây là loại nấm gây hại cho cá ở tất
4


cả các giai ñoạn từ trứng ñến cá thịt. Khi mắc bệnh này, cá bơi lờ ñờ xung
quanh ao và bị bệnh nặng sau một thời gian sẽ chết. Nấm thủy mi bám trên
mình cá như những túm bông màu trắng (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám,
2000). Bệnh sán lá ñơn chủ gây bệnh cá gồm 2 giống Dactylogyrus (sán 16
móc) và Gyrodactylus (sán 18 móc). Sán ký sinh ở da mang của cá, phá hoại
tế bào tổ chức mang và da làm cho mang và da tiết ra nhiều dịch nhờn. Khi
mắc bệnh này cá bơi lội chậm chạp và ñôi khi trên da cá bị phủ bởi một lớp
trông giống như lông tơ có thể quan sát thấy những ñiểm xuất huyết nhỏ trên
thân cá. Cá gầy yếu ít hoạt ñộng và thường nằm dưới ñáy, thỉnh thoảng nổi lên
mặt nước và bơi ngửa bụng (Nguyễn Thị Thu Hằng và Phạm Minh Đức,
2009). Theo kết quả khảo sát của Phạm Đăng Phương (2010) cho thấy có 7
loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi cá lóc: bệnh xuất huyết (50,7%), bệnh
ký sinh trùng (49,6%), bệnh ghẻ lở (hay còn gọi là bệnh lở loét) (19,5%), bệnh
gan thận mủ (13,3%), bệnh ñẹn họng (ñỏ xoang miệng) (15%), bệnh chướng
hơi sình bụng (8,8%) và bệnh nấm trên thân cá (3,5%).
2.3 Sơ lược kết quả nghiên cứu bệnh cá do vi khuẩn Aeromonas
Dấu hiệu bệnh lý

Đặc ñiểm do Aeromonas gây ra làm cho ñộng vật mắc bệnh xuất huyết, hình
thành các vết ñỏ trên cơ thể, lở loét ở da và các vết loét này ngày càng lan
rộng ra trên bề mặt da, các cơ quan hoặc ăn sâu vào bên trong cấu trúc mô.
Tùy vào ñối tượng nuôi, nhóm vi khuẩn gây bệnh và giai ñoạn bệnh mà có
những biểu hiện bệnh lý khác nhau (Inglis et al., 1993). Một số nghiên cứu
khác cho thấy da cá bắt ñầu bị sậm lại và lan dần ra phần bụng ñến các vùng
khác trên cơ thể. Vây và ñuôi bị xuất huyết, lở loét và hoại tử. Những vùng lở
loét thường không sâu. Ngoài ra cá lóc bị tróc vẩy, mắt bị ñục và lồi ra. Nội
tạng bị sưng và xuất huyết. Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường tập trung
vào mùa Xuân và mùa Thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh thường xuất hiện
nhiều vào ñầu mùa mưa. Tỷ lệ chết sẽ rất cao trong trường hợp cá bị sốc và
thiếu dinh dưỡng, thiếu oxy, ñặc biệt ở giai ñoạn cá còn nhỏ tỉ lệ chết lên ñến
70% (Từ Thanh Dung, 2005). Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Bùi
Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu tượng chung là da thường
ñổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các ñốm xuất
huyết ñỏ trên thân, các gốc vây, xuất huyết hậu môn, mắt lồi ñục. Ở cá tra và
cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật
sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi ñều bị xuất huyết, xoang bụng
chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách ñàn treo
râu. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra

5


sau khi gây cảm nhiễm với A. hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận,
hậu môn sưng ñỏ, các tia vây xuất huyết,… nhưng không chết hàng loạt trong
thời gian 7 ngày thí nghiệm. Thu mẫu cá chết phân lập chỉ có một loài duy
nhất là A. hydrophila. Theo Phạm Thanh Liêm và ctv (2008) khi nghiên cứu
về khả năng kháng bệnh của cá trê lai. Khi cá chết có dấu hiệu ñặc trưng như:
xuất huyết vì mạch máu bị tổn thưởng mang, ruột nhất là phần ruột sau. Xuất

huyết ở vùng tiêm vi khuẩn, các vết lở loét trên da và râu cũng quan sát ñược.
Ngoài ra, trong nghiên cứu này còn có kết luân rằng tất cả các nhóm cá trê lai
ñều có sức chống chịu lại A. hydrophila cao hơn hẳn so với loài cá bản ñịa và
cá trê vàng.
Một số loài vi khuẩn Aeromonas gây bệnh phổ biến
Barrow và Feltham (1993) cho rằng A. hydrophila thuộc giống Aeromonas, họ
Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria. Nhóm vi khuẩn di ñộng gồm có 3 loài A. hydrophila, A. caviae
và A. sobria. Đặc tính chung của 3 loài vi khuẩn này là di ñộng nhờ có một
tiên mao, hai ñầu hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, kích thước 0,5x1,0-1,5
µm, hiếu khí không bắt buộc, phát triển ñược ở 37°C. Theo kết quả nghiên cứu
của Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì vi khuẩn Aeromonas là tác nhân gây bệnh
xuất huyết trên nhiều loài cá, trong ñó A. hydrophila phổ biến gây bệnh cho cá
nước ngọt. Theo Từ Thanh Dung (2005) cho rằng vi khuẩn Aeromonas thuộc
họ Aeromonadaceae, bao gồm 3 loài A. hydrophila, A. caviae và A. sobria.
Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di ñộng, hình que, hiếu khí và yếm khí
không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính, kháng
với O/129. Trong ñó A. hydrophila ñược xem là loài gây bệnh cho cá nước
ngọt phổ biến, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu trên các loài cá nuôi
và cá tự nhiên. Vi khuẩn này có mặt trong nước có nhiều chất hữu cơ. Cá con
dễ bị mẫn cảm hơn cá trưởng thành, có thể gây chết ñến 80%. Theo Nguyễn
Thị Thu Hằng (2005) Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường
Tryptone soya agar (TSA) thì khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu
vàng nhạt. Cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả năng lên
men các môi trường ñường nhưng không có khả năng tạo khí H2S, cho phản
ứng dương tính với MR - VP, lysine, arginine và ornithine. Đặc biệt chúng có
khả năng phát triển ñược ở nồng ñộ muối 6%, nên ñã thể hiện ñược ñặc tính
phân bố rộng muối. Bergey (1957) cho rằng bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh
ñốm ñỏ, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi,… là bệnh do vi khuẩn A. hydrophila
gây ra (Trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005).

6


Phân bố và lan truyền bệnh
Kết quả nghiên cứu của Austin và Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là tác
nhân của một vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh ñốm ñỏ và
thường liên kết với mầm bệnh khác như A. salmonisida. Bệnh ñốm ñỏ là biểu
hiện sự có mặt của những vết thương trên da, ñặc biệt xuất huyết ở mang và
hậu môn, loét, ung mủ, lồi mắt, phình bụng. Bên trong xoang bụng tích tụ dịch
loãng, gây thiếu máu và tổn thương các cơ quan như gan, thận. Ventura và
Grizzle (1987) cho rằng vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu
trên cá nheo (Ictalurus punctatus) và A. hydrophila làm cho cơ quan nội tạng
và da bị xuất huyết trong ñiều kiện nuôi ở mật ñộ cao và nhiệt ñộ là 24°C. Cá
không bị nhiễm khi nuôi ở mật ñộ thấp hơn và nhiệt ñộ là 18°C. A. hydrophila
cũng gây bệnh lở loét cho các tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết cao lên ñến
80-90% (Angka, 1990). Ở Châu Âu, bệnh do A. hydrophila trên cá chình
(Anguilla australis) thường xuất hiện vào mùa xuân-hè, nhiệt ñộ nước khoảng
17-22°C, khoảng nhiệt ñộ này cũng ñược cho là khoảng nhiệt ñộ thích hợp cho
vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Một số loài vi khuẩn gây bệnh
thường gặp là A. hydrophila, A. sobria và A. caviae, ñược phát hiện ñầu tiên
trên cá chình trong báo cáo bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) (Trích dẫn
của Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997). Ngoài ra, A. hydrophila còn là tác nhân thứ
cấp gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng và gây chết cao vào mùa nước ñổ ở
ĐBSCL (Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997). Bên cạnh ñó thì Aeromonas sp. còn
ñược phân lập cả trên tôm càng xanh với những biểu hiện cụt râu và mòn phụ
bộ (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005). Vi khuẩn Aeromonas sp. di ñộng gây bệnh
trên nhiều loài thủy sản nước ngọt. Ở Việt Nam, các loài cá nuôi lồng, bè và
ao nước ngọt thường gặp bệnh ñốm ñỏ như cá lóc, cá trắm cỏ, cá trôi, cá chép,
cá basa,… bệnh ñỏ chân ở ếch, ñốm nâu ở tôm càng xanh (Bùi Quang Tề,

2006). Theo kết quả nghiên cứu của Lư Trí Tài (2010) cho thấy vi khuẩn
Aeromonas phân lập trên cá lóc nuôi ao ở An Giang và Đồng Tháp bị bệnh
xuất huyết chiếm tỉ lệ cao nhất (38,3%) trong tổng số 81 chủng vi khuẩn phân
lập ñược, còn lại là nhóm vi khuẩn khác như Pseudomonas, Edwardsiella,
Streptococcus. Một nghiên cứu khác về bệnh trên tôm càng của Nguyễn Tấn
Đạt (2002) ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ cũng cho kết quả
phân lập ñược 50 dòng vi khuẩn từ tôm bị cụt râu và mòn phụ bộ. Trong ñó,
có 18 chủng ñược ñịnh danh là vi khuẩn A. hydrophila. Ngoài ra, trong nghiên
cứu này cũng chứng minh rằng có sự hiện diện của loài vi khuẩn này trong
môi trường nước và gây hiện tượng cụt râu, mòn phụ bộ ở giai ñoạn hậu ấu
trùng khi gây cảm nhiễm chủng 1.081514 ở mật ñộ 2,1x104 CFU/ml và khả
năng gây bệnh tăng lên khi mật ñộ tăng ñến 2,1x107 CFU/ml.

7


2.4 Một số nghiên cứu ñộc lực về vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Groberg (1978) cho rằng khi gây nhiễm A. hydrophila trên cá hồi giống ñã kết
luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5°C và 17°C, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15°C và
12°C, còn ở 9°C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy cá chết
(Trích dẫn bởi Roselynn và Stevenson, 1988). Rahman et al. (2000) thí
nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4
cách khác nhau: tiêm vào xoang bụng (mật ñộ vi khuẩn 3x104-3x108 CFU/ml),
tiêm ở cơ (mật ñộ vi khuẩn 8x104-8x108 CFU/ml), tiêm dưới da cơ (mật ñộ vi
khuẩn 8,5x104-8,5x108 CFU/ml) và ngâm vi khuẩn (mật ñộ vi khuẩn 4,6x 1044,6x108 CFU/ml) và ñã ñưa kết luận gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm
dưới da thì ñộc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 là 106,4 CFU/ml.
Bên cạnh ñó, Azad et al. (2001) gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá rô
phi (Oreochromis niloticus), ở mật ñộ vi khuẩn 107 CFU/ml ñã gây chết 80%.
Majumdar et al. (2007) cũng tiến hành gây cảm nhiễm trên cá trê có khối
lượng từ 100-120 g, kết quả xác ñịnh ñược LD50 = 3,96x107 CFU/ml. Gần ñây

Citarasu et al. (2011) ñã tiến hành gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius
auratus) có trọng lượng 5±1 g bằng cách tiêm và theo dõi trong vòng 7 ngày
ñã xác ñịnh ñược LD50 = 107 CFU/ml. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) thí
nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép (Cyprinus carpio)
bằng phương pháp tiêm với mật ñộ vi khuẩn từ 103 CFU/ml ñến 107 CFU/ml
trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn ñộc lực
mạnh có giá trị LD50 lần lượt là 3,68x106 CFU/ml, 2,64x106 CFU/ml ñến
4,52x106 CFU/ml và 1,96x106 CFU/ml ñến 1,45x107 CFU/ml.

8


PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 11/2010 ñến tháng 05/2011.
Địa ñiểm: Mẫu cá bệnh ñược thu ở ao nuôi tại Tam Nông, Đồng Tháp và nuôi
vèo tại Cờ Đỏ, Cần Thơ. Phân lập vi khuẩn và thí nghiệm gây cảm nhiễm tại
Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản-Khoa Thủy sản-Trường Đại học Cần
Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị
Dụng cụ cơ bản trong phân lập vi khuẩn: Bộ tiểu phẫu, tâm bông tiệt trùng,
lame, lamelle, ñèn cồn, cốc ñốt, găng tay, giấy nhôm, tủ sấy, nồi tiệt trùng áp
suất, que cấy, ống nghiệm, pipet, ñĩa petri, cân ñiện tử, bút lông dầu, sổ ghi
chép,….
Dụng cụ và trang thiết bị gây cảm nhiễm: Bể composite 250 L, xô nhựa (60
L), máy sục khí, vợt, ñèn pin, máy chụp ảnh, thức ăn công nghiệp, ống chích,
máy so màu quang phổ, máy ly tâm,….
3.2.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất gồm: Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất, cồn 70%, cồn 96%, bộ
hóa chất nhuộm Gram, dung dịch H2O2, que thử Oxidase, môi trường O/F,
glucose, paraffin, O/129, ñĩa thuốc kháng sinh, ống McFarland.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Tryptone soya agar (TSA): (40 g TSA, 1000 ml
nước cất), Brain heart broth (BHB): (37 g, 1000 ml nước cất).
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thu mẫu cá bệnh
Cá lóc ñược thu trực tiếp từ 2 vèo nuôi trong 2 ao ñất ở Cờ Đỏ (Phụ lục 1).
Khi nào cá có biểu hiện bệnh xuất huyết thì tiến hành thu mẫu. Mỗi vèo thu 3
cá bệnh, ñặc biệt là cá có dấu hiệu xuất huyết và 2 cá khỏe. Trong ñó, mẫu cá
bệnh: thu mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ ñờ trên mặt nước, có lớp nhớt
dày trên bề mặt vẩy hoặc những cá có dấu hiệu khác thường, ñặc biệt là cá có
dấu hiệu bị xuất huyết; mẫu cá khỏe: thu mẫu cá không có bất kỳ dấu hiệu
khác thường nào.
9


3.3.2 Phân lập vi khuẩn
Mẫu cá có dấu hiệu xuất huyết còn sống ñược quan sát và ghi nhận các biểu
hiện bên ngoài và nội quan bên trong. Lấy mẫu vi sinh trong ñiều kiện vô
trùng ở 3 cơ quan gan, thận và tỳ tạng cấy trên môi trường TSA, ủ ở 28°C sau
24 giờ ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc. Tiếp tục tách ròng 3 lần ñể có
ñược chủng vi khuẩn thuần cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.3 Định danh vi khuẩn
Sau khi ñược ñĩa vi khuẩn thuần thì tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của
các chủng vi khuẩn trên như: nhuộm Gram, tính di ñộng, phản ứng oxidase,
phản ứng catalase và khả năng lên men và oxy hóa ñường glucose (O-F), căn
cứ vào ñặc ñiểm hình thái và khóa phân loại của Barrow và Feltham (1993) ñể
xác ñịnh chủng vi khuẩn thu ñược là vi khuẩn Aeromonas (Phụ lục 2), chi tiết
thực hiện ñược trình bày ở phụ lục 3. Sau ñó gửi 2 chủng vi khuẩn (CĐ1012

và ĐT1001) ñến phòng xét nghiệm bệnh thủy sản tại Bộ môn Sinh học và
Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ ñịnh danh vi khuẩn bằng
phương pháp PCR vi khuẩn ñể xác ñịnh chính xác ñược chủng vi khuẩn thu
ñược là Aeromonas hydrophila (Phụ lục 4) và trữ vi khuẩn trong môi trường
thạch nghiêng ñể tiến hành bố trí thí nghiệm.
3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm
3.4.1 Cá thí nghiệm
Cá lóc có khối lượng trung bình 20±5 g/con ñược mua từ hộ nông dân nuôi cá
ở Cần Thơ. Cá ñược nuôi trong bể composit (250 L) một tuần trước khi bố trí
thí nghiệm và cho cá ăn thức ăn công nghiệp (Hi-Pro) theo nhu cầu. Sau ñó
chọn những con cá khỏe có màu sắc sáng bóng, bơi lội nhanh nhẹn ñem bố trí
thí nghiệm.
3.4.2 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 ñược trữ trong môi trường
thạch nghiêng và ñược cấy truyền trên môi trường TSA, ủ ở 28°C sau 24 giờ
quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi
khuẩn.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy 2 khuẩn lạc cho vào 2 ống
nghiệm chứa 5 ml môi trường BHB tiệt trùng, ñặt lên máy lắc 200 vòng/phút
trong 24 giờ, ở nhiệt ñộ 28°C. Sau ñó chuyển vi khuẩn sang ống eppendof 1,5
ml tiệt trùng, ñem ly tâm 13000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút. Sau khi ly tâm
loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng ñể rửa vi
10


khuẩn, quá trình này ñược lặp lại từ 3 lần. Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung
dịch phía trên và cho vào khoảng 25 ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt
trùng, sau ñó trộn ñều mẫu bằng máy vortex. Tiến hành xác ñịnh mật ñộ vi
khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610 nm và ñiều chỉnh OD
tương ứng ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn. OD = 1±0,02 tương ñương với mật ñộ

vi khuẩn là 109 CFU/ml. Pha loãng mật số vi khuẩn ñể ñược các mật ñộ vi
khuẩn: 104, 105, 106 và 107 CFU/ml và tiến hành bố trí thí nghiệm.
Sau ñó xác ñịnh lại mật số vi khuẩn bằng cách dùng pipet lấy 20 µ l dung dịch
vi khuẩn trãi ñều trên ñĩa petri có môi trường TSA ủ ở 28°C sau 24 giờ, ñếm
số lượng khuẩn lạc xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn bằng công thức:
Số tế bào vi khuẩn (CFU/ml) = Số khuẩn lạc trên ñĩa x Hệ số pha loãng x 50
3.4.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm
Nguồn nước dùng trong thí nghiệm là nước máy ñược trữ trong bể chứa có sục
khí mạnh trong 3 ngày trước khi bố trí thí nghiệm. Dụng cụ dùng cho thí
nghiệm ñược khử trùng bằng chlorine. Cá ñược bố trí ngẫu nhiên vào xô thí
nghiệm ở mật ñộ 15 con/xô nhựa (60 L) chứa 30 L nước, có sục khí (Hình
3.1). Thí nghiệm ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức ñược lặp
lại 2 lần với các nghiệm thức sau:
Nghiệm thức 1: Không tiêm (cá + môi trường).
Nghiệm thức 2: Đối chứng (cá + tiêm nước muối sinh lý).
Nghiệm thức 3: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x104 CFU/ml.
Nghiệm thức 4: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x105 CFU/ml.
Nghiệm thức 5: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x106 CFU/ml.
Nghiệm thức 6: Cá + vi khuẩn nồng ñộ 3,67x107 CFU/ml.
Mỗi con cá ñược tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn, vị trí tiêm ở xoang bụng
(gốc vi ngực).

11


Hình 3.1: Hệ thống xô thí nghiệm gây cảm nhiễm
3.4.4 Quan sát và thu thập số liệu
Quan sát
Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý, số cá chết trong suốt 14 ngày gây
cảm nhiễm. Tiến hành thu mẫu cá lờ ñờ và ghi nhận lại dấu hiệu bên ngoài và

bên trong cơ thể mẫu cá. Phân lập vi khuẩn.
Phương pháp xác ñịnh LD50
(Lethal dose: Nồng ñộ vi khuẩn gây chết cá 50%)
Xác ñịnh LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938). Xác ñịnh LD50
ñể biết ñược ñộc lực của vi khuẩn.

Log LD50 = Log A +

50% - %d
%t - %d

x Log 10

Trong ñó: Log A: nồng ñộ nhỏ và cận 50%
Log 10: ñộ pha loãng
%d: % số cá chết nhỏ và cận 50%
%t: % số cá chết lớn và cận 50%
Tái ñịnh danh vi khuẩn
12 chủng vi khuẩn ñược phân lập từ cá gây cảm nhiễm sẽ tiến hành tách ròng
và nuôi cấy ñể ñược ñĩa cấy thuần, sau ñó kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của các
chủng vi khuẩn trên như: nhuộm Gram, tính di ñộng, phản ứng oxidase, phản
ứng catalase và khả năng lên men và oxy hóa ñường glucose (O-F), căn cứ vào
12


ñặc ñiểm hình thái và khóa phân loại của Barrow và Feltham (1993) ñể xác
ñịnh chủng vi khuẩn phân lập ñược là vi khuẩn Aeromonas và tiến hành ñịnh
danh vi khuẩn bằng cách phương pháp PCR vi khuẩn.
3.5 Xử lý số liệu
Số liệu tỉ lệ chết tích lũy của cá ñược thu thập và xử lý bằng phần mềm

Microsoft excel 2003. Luận văn ñược trình bày bằng phần mềm Microsoft
word 2003.

13


PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Dấu hiệu bệnh lý
Trong 3 ñợt thu mẫu cá có biểu hiện xuất huyết, với dấu hiệu bệnh lý như cá
bơi lội lờ ñờ trên mặt nước, trên thân có nhiều ñốm xuất huyết hình thành vết
loét ăn sâu vào cơ và bụng có nhiều ñốm ñỏ. Vây, xoang miệng và lưỡi ñều bị
xuất huyết. Giải phẫu bên trong thấy có dịch ñỏ mùi hôi, gan bầm ñen, ruột
không chứa thức ăn (Hình 4.1).

A

B

Hình 4.1: Cá lóc bệnh nuôi trong vèo ở Cờ Đỏ (A) Xuất hiện nhiều ñốm ñỏ
(xuất huyết) ở phần bụng (mũi tên); (B) Gan bầm ñen (mũi tên) và ruột không
chứa thức ăn.
4.2 Phân lập và ñịnh danh vi khuẩn
Qua kết quả thu mẫu ñã phân lập ñược 4 chủng vi khuẩn trên cá lóc có dấu
hiệu bị xuất huyết trong ñó có 3 chủng thu ở Cờ Đỏ-Cần Thơ (CĐ1011,
CĐ1012 và CĐ1013) và 1 chủng ở Tam Nông-Đồng Tháp (ĐT1001) có xuất
hiện dấu hiệu bệnh lý thể hiện qua bảng phụ lục 5. Dựa vào ñặc ñiểm hình
thái, các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn ñược kiểm tra theo
phương pháp của Barrow và Feltham (1993) ñược giống Aeromonas (Bảng
4.1). Khuẩn lạc dạng tròn, màu vàng, hơi lồi và nhẵn (Hình 4.2). Ngược lại,

những mẫu cá không có dấu hiệu bệnh thì không phân lập ñược vi khuẩn.

14


Bảng 4.1: Các chỉ tiêu cơ bản của vi khuẩn
Chủng vi khuẩn
Gram
Di ñộng
Oxidase
Catalase
O/F

CĐ1011
+
+
+
+/+

CĐ1012
+
+
+
+/+

CĐ1013
+
+
+
+/+

ĐT1001
+
+
+
+/+

A

B

Hình 4.2: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 phân lập trên cá lóc
nuôi vèo trong ao ñất (A) Khuẩn lạc Aeromonas trên môi trường TSA, (B)
Hình dạng của vi khuẩn Aeromonas (100X).
Sau ñó ñịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR vi khuẩn ñể khẳng ñịnh 2
chủng CĐ1012 và ĐT1001 phân lập ñược là vi khuẩn A. hydrophila (Hình
4.3).

M

1

2

3

209 bp

200 bp

Hình 4.3: Kết quả ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila
15


- Giếng M: Maker
- Giếng 1: ĐC (-) Aeromonas hydrophila
- Giếng 2: ĐC (+) Aeromonas hydrophila
- Giếng 3: Mẫu CĐ1012
4.3 Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm
Dấu hiệu bệnh lý
Đa số các cá chết ñều có dấu hiệu bệnh lý giống nhau: tách ñàn, bỏ ăn và bơi
lội lờ ñờ trên mặt nước, phản ứng chậm với tiếng ñộng. Mắt lồi và ñục, xuất
huyết ở các vây và xương nắp mang, cá bơi dạng xoắn. Giải phẫu bên trong
các cơ quan nội tạng của cá thấy thận xuất huyết, gan nhợt nhạt (Hình 4.4).
Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi gây cảm nhiễm cũng giống như dấu hiệu bệnh
lý của cá bị xuất huyết nuôi ở vèo trong ao ñất mà ta quan sát ñược. Theo
Đoàn Nhật Phương và ctv (2006) tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn A.
hydrophila trên cá tra thì ña số cá có dấu hiệu: tách ñàn, bỏ ăn và bơi lội lờ ñờ
trên bề mặt bể. Cá xuất huyết ở bụng, mắt, gốc vi ngực, vây lưng và cuốn
ñuôi. Khi giải phẫu thì thận bị sưng và xuất huyết. Trong thí nghiệm gây cảm
nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra sau khi gây cảm nhiễm với A.
hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận, hậu môn sưng ñỏ và các tia vây
xuất huyết.

A

B

Hình 4.4: Cá bị xuất huyết sau khi gây cảm nhiễm (A) Cá bị ñốm xuất huyết,
(B) Nội tạng bị xuất huyết

Tỉ lệ chết
Sau khi thực hiện thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở những
nồng ñộ khác nhau thì tỉ lệ chết và thời gian xuất hiện bệnh cũng khác nhau
nhưng ñều mang dấu hiệu ñặc trưng của bệnh. Ở tất cả các mật ñộ vi khuẩn
tiêm ñều có cá chết ngoại trừ ñối chứng tiêm nước muối sinh lý và không tiêm
(Hình 4.5).
16


120
100

ĐỐI CHỨNG

Tỉ lệ chết (%)

NaCl
80

10^4
10^5

60

10^6
10^7

40
20
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Ngày

Hình 4.5: Biểu ñồ tỉ lệ cá chết tích lũy (%) theo ngày cảm nhiễm
Qua hình 4.5 cho thấy cá thí nghiệm ñã chết vào ngày ñầu tiên gây cảm nhiễm
ở mật ñộ 3,67x106 CFU/ml sau 15 giờ gây cảm nhiễm, tuy nhiên kết quả phân
lập vi khuẩn cho thấy cá không bị nhiễm vi khuẩn. Theo Ngô Minh Dung
(2007) thì kết quả cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra ở 4 mật ñộ vi
khuẩn thì ở mật ñộ 2,16x106 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất
là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Bên cạnh ñó, ở thí nghiệm xác ñịnh
LD50 của vi khuẩn A. hydrophila trên cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon) của Ngô
Thị Ngọc Thủy (1998) cũng ñã ghi nhận thời ñiểm làm cá chết 50% là 24 giờ.
Dấu hiệu ñặc trưng của cá sau khi tiêm vi khuẩn A. hydrophila quan sát ñược
trong suốt quá trình gây cảm nhiễm bao gồm: vi bị mòn tưa rách, vẩy dễ bị
rụng khi lấy ra, xuất hiện từng vùng xuất huyết trên thân, gốc vi, mắt phù và
mờ ñục. Vào ngày thứ 2 tất cả các nghiệm thức ñều có cá chết, ngoại trừ bể
ñối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, ñến ngày thứ 8 mới xuất
hiện cá chết ở nghiệm thức tiêm nước muối sinh lý. Sau 14 ngày theo dõi thí
nghiệm, ở mật ñộ 3,67x107 CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao nhất 100%. Trong thí
nghiệm gây cảm nhiễm bằng cách tiêm vi khuẩn này trên cá trê (Clarias
batrachus), Thune et al. (1982) thì cá chết 93% ở mật ñộ vi khuẩn 107 CFU/ml
ñược theo dõi trong suốt 14 ngày. Ở các mật ñộ còn lại 3,67x104 CFU/ml;
3,67x105 CFU/ml; 3,67x106 CFU/ml cá chết với tỉ lệ lần lượt là 30%; 40%;
60% (Phụ lục 6). Như thế chủng vi khuẩn thí nghiệm có khả năng xác ñịnh
nồng ñộ vi khuẩn gây chết cá 50% theo Reed và Muench (1938). Riêng bể
tiêm nước muối sinh lý cũng có cá chết nhưng tỉ lệ không cao 6,67%. Nhưng
khi tiến hành phân lập thì không thấy sự nhiễm khuẩn trên cá và không có dấu

17