Khảo sát thực vật học, thành phần hóa học và thử độc tính trên một số dòng tế bào ung thư tơ xanh (Cassytha filiformis L.) ở vùng Gò Tháp - Đồng Tháp

Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM






Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài
(Chương trình vườn ươm
sáng tạo khoa học và công nghệ trẻ)



Tên đề tài:
Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính
trên một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha
filiformis L.) ở vùng Đồng Tháp.






Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh
Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài:
Trung tâm Phát triển Khoa học
và Công nghệ Trẻ

Năm 2013
Tên đề tài:
Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính trên một số dòng
tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L.) ở vùng Đồng Tháp.

Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh
Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học v
à
Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012
Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng
Kinh phí đã cấp: 61,72 triệu đồng theo hợp đồng số 282/HĐ – SKHCN
ngày 21/12/2011 ký giữa Sở Khoa học và Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Trung
tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ, Chủ nhiệm đề tài nghiên cứu khoa
học.

Mục tiêu:
- Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh.
- Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định lượng alkaloid có
trong tơ xanh
- Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ xanh.

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết, phân đoạn alkaloid toàn
phần và các alkaloid tách được.
Nội dung:
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ
xanh tại khu di tích Gò Tháp, huyện
Tháp Mười, Đồng Tháp và đặc điểm
thực vật học của tơ hồng để tránh nhầm
lẫn.
Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ
xanh tại khu di tích Gò Tháp, huyện
Tháp Mười, Đồng Tháp. So sánh với
đặc điểm thực vật học của tơ hồng.
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của
tơ xanh
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của
tơ xanh
Định tính, định lượng alkaloid có trong
tơ xanh
Định tính, định lượng alkaloid có trong
tơ xanh
Chiết tách và xác định cấu trúc của
alkaloid thu được từ tơ xanh
Chiết tách và đo phổ NMR và xác định
được cấu trúc của 1 alkaloid thu được
từ tơ xanh.
Hoạt tính độc tế bào của cao chiết và
alkaloid chiết tách từ tơ xanh
Hoạt tính độc tế bào của cao chiết và
alkaloid chiết tách từ tơ xanh

Phần mở đầu


1. Tên đề tài:
Khảo sát thực vật học, thành phần hoá học và thử độc tính trên
một số dòng tế bào ung thư của tơ xanh (Cassytha filiformis L.) ở vùng Đồng
Tháp.
2. Chủ nhiệm đề tài: Bùi Thế Vinh
3. Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học v
à
Công nghệ Trẻ
4. Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2012
Kinh phí được duyệt: 80 triệu đồng
Kinh phí đã cấp: 61,72 triệu đồng theo hợp đồng số 282/HĐ – SKHCN
ngày 21/12/2011 ký giữa Sở Khoa học và Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Trung
tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ, Chủ nhiệm đề tài nghiên cứu khoa
học.
5. Mục tiêu:
- Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh.
- Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định lượng alkaloid có
trong tơ xanh
- Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ xanh.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết, phân đoạn alkaloid toàn
phần và các alkaloid tách được.

6.
Sản phẩm của đề tài:
- Báo cáo phân tích đặc điểm thực vật học, hoá học của tơ xanh
- 1 hợp chất Alkaloid chiết tách được
- 2 bài báo khoa học trên tạp chí chuyên ngành trong nước.
Những chữ viết tắt
ACN Acetonitrile
CH
2
Cl
2
Dicloromethane
CHCl
3
Chloroform
dd Dung dịch
DĐVN Dược điển Việt Nam
EtOH Ethanol
EtOAc Ethyl acetat
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
M Trung bình (Mean)
MeOH Methanol
MPLC Medium Pressure Liquid Chromatography
MS Khối phổ (Mass Spectra)
NCI Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute)
NMR Nuclear Magnetic Resonance
NXB Nhà xuất bản
OD Mật độ quang (Optical Density)
PE Petroleum Ether
UV Tử ngoại (Ultraviolet)

SKLM Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
R
f
Ratio of Flow
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
THF Tetrahydrofuran
TP.HCM Thành Phố Hồ Chí Minh
t
R
Thời gian lưu (Retention time)
tr., pp. Trang
TT Thuốc thử

MỤC LỤC TRANG
Đặt vấn đề 1
1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 3
1.1. Đặc điểm sinh học và thành phần hoá học của cây tơ xanh 3
1.2. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài 4
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 6
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị 6
2.1.1. Nguyên liệu 6
2.1.2. Hóa chất và trang thiết bị 6
2.2. Phương pháp nghiên cứu về thực vật học 7
2.2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu 7
2.2.2. Khảo sát đặc điểm hình thái 7
2.2.3. Khảo sát đặc điểm vi học 7
2.3. Phương pháp nghiên cứu về hóa học 8
2.3.1. Độ tinh khiết 8
2.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật 9

2.3.3. Chiết xuất Alkaloid 12
2.3.4. Tinh chế và phân lập Alkaloid 14
2.3.5. Xác định các đặc tính lý hóa của Alkaloid tách được 15
2.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học 16
2.4.1. Thử nghiệm SRB 16
2.4.2. Thử nghiệm WST-1 18
2.4.3. Phân tích western-blot 19
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31
3.1. Kết quả nghiên cứu thực vật học 31
3.1.1. Khảo sát về phân bố và sinh thái 31
3.1.2. Khảo sát về đặc điểm hình thái 31
3.1.3. Khảo sát đặc điểm vi học 32
3.2. Phương pháp nghiên cứu về hóa học 41
3.2.1. Độ tinh khiết 41
3.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 41
3.3 .Chiết xuất Alkaloid 46
3.3.1. Chiết xuất Alkaloid bằng dung dịch acid loãng trong nước 46
3.3.2. Chiết xuất Alkaloid bằng dung dịch acid loãng trong cồn 47
3.3.3. Định tính Alkaloid thô của 2 phương pháp chiết bằng kĩ thuật SKLM 48
3.3.4. Phân lập Alkaloid 48
3.3.5. Các đặc tính lý hóa của Alkaloid đã phân lập 50
3.4. Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học 56
3.4.1. Thử nghiệm SRB 56
3.4.2. Thử nghiệm WST-1 57
3.4.3. Thử nghiệm Western blot 60
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62
4.1. Kết luận 62
4.1.1 Nghiên cứu về thực vật học 62
4.1.2. Nghiên cứu về hóa học 62
4.1.3. Hoạt tính sinh học 62

4.2. Đề nghị 62
Tài liệu tham khảo 64

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1. Cấu trúc khung aporphin 4
Hình 2. Cây tơ xanh kí sinh trên cây phi lao và trên cây lức. 35
Hình 3. Dạng hoa,quả,hạt của cây tơ xanh. 35
Hình 4. Dạng hoa, quả của cây tơ xanh. 36
Hình 5. Phân tích hoa tơ xanh. 36
Hình 6. Hạt tơ xanh cắt dọc và cắt ngang. 36
Hình 7. Vi phẫu thân tơ xanh (X10). 37
Hình 8. Chi tiết các mô tơ xanh 38
Hình 9. Soi bột dược liệu tơ xanh (X40) 38
Hình 10. Vi phẫu trục phát hoa tơ xanh 39
Hình 11. So sánh vi phẫu thân tơ xanh (a) và thân tơ hồng (b) 40
Hình 12. Kết quả định tính Alkaloid bằng phản ứng hóa học. 44
Hình 13. SKLM định tính Alkaloid.Phát hiện: Hơ trên hơi Iod. 44
Hình 14. SKLM định tính Alkaloid 45
Hình 15. SKLM định tính Alkaloid(phun Dragendorff) 45
Hình 16. SKLM định tính Alkaloid trong dịch chiết của 2 phương pháp chiết . 48
Hình 17. Thăm dò hệ dung môi rửa cột trên sắc kí lớp mỏng. 48
Hình 18. SKLM kiểm tra các phân đoạn. 49
Hình 19. Tương quan HMBC và COSY của A1 533
Hình 20. Công thức của Cassythine 54
Hình 21. Đồ thị so sánh giá trị IC
50
(phương pháp WST-1) của các mẫu thử trên
dòng HeLa và A549 60
Hình 22. Kết quả Western blot xác định sự cảm ứng apoptosis 611
Sơ đồ 1. Chuẩn bị các dịch chiết 10

Sơ đồ 2. Qui trình chiết Alkaloid bằng acid loãng trong nước. 46
Sơ đồ 3. Qui trình chiết Alkaloid bằng acid loãng trong cồn 47

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Cấu trúc các alkaloid có khung aporphin. 4
Bảng 2. Tóm tắt quy trình phân tích sơ bộ hóa thực vật 11
Bảng 3. Các thông số về cột sắc kí. 14
Bảng 4. So sánh sự khác nhau về hình thái của tơ xanh trên cây chủ khác nhau32
Bảng 5. So sánh vi phẫu thân tơ xanh và tơ hồng 40
Bảng 6. Độ ẩm dược liệu. 41
Bảng 7. Độ tro toàn phần của dược liệu. 41
Bảng 8. Độ tro không tan trong HCl 41
Bảng 9. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật. 42
Bảng 10. Kết quả xác định từng hợp chất. 43
Bảng 11. Kết quả kiểm tra các phân đoạn của cột 49
Bảng 12. Kết quả các chất thu được qua sắc kí cột và sklm chế hóa. 50
Bảng 13. Kết quả khảo sát đặc tính lý hóa các chất thu được 50
Bảng 14. Kết quả phổ IR của A1 và A2 50
Bảng 15. Phổ NMR 1 chiều và 2 chiều của A1 so với Cassythine 51
Bảng 16. Tỉ lệ phần trăm gây độc tế bào của Atp và MeOH 56
Bảng 17. IC50 của mẫu Atp và MeOH (Phương pháp SRB) 57
Bảng 18. Tỉ lệ phần trăm gây độc tế bào của Atp, MeOH, A1 và A2 58
Bảng 19. IC50 của mẫu Atp, A1 và A2 trên dòng A549 ( WST-1) 58
Bảng 20. IC50 của mẫu MeOH, Atp, A1 và A2 trên dòng HeLa (WST-1) 59


1


Đặt vấn đề

Trong nỗ lực phát triển, khai thác nguồn tài nguyên dược liệu phong phú
đáp ứng cho nhu cầu trong nước ta hiện nay, “chiến lược phát triển ngành dược
giai đoạn đến 2010” có nêu rõ: “Phải từng bước đáp ứng nguồn nguyên liệu làm
thuốc bảo đảm sản xuất trong nước 60% nhu cầu thuốc phòng bệnh và chữa bệnh
xã hội”. Hiện nay, các nước trên thế giới đã đẩy mạnh việc nghiên cứu các chế
phẩm mới từ cây thuốc, doanh thu các thuốc từ cây cỏ chiếm tỷ phần khá cao
trong thị trường thuốc ở nhiều nước. Tỷ lệ dùng thuốc y học cổ truyền để thay
thế hoặc hỗ trợ thuốc Tây ngày càng nhiều, bằng chứng là tỷ lệ hiệu thuốc y học
cổ truyền/hiệu thuốc Tây: ở Trung Quốc: 11/10, Nhật Bản: 7/10, ở Việt Nam,
nhu cầu sử dụng thuốc cho trên 80 triệu dân hàng năm là rất lớn, nhưng tỷ lệ này
chỉ là 1/10, dù vậy, sản xuất dược ở nước ta hơn 90% nguyên liệu phải nhập
khẩu (theo báo cáo tổng kết công tác dược của cục quản lý dược Việt Nam năm
2005). Vì vậy, việc phát triển ngành dược nước ta hiện nay, nguồn dược liệu
thiên nhiên góp phần không nhỏ, thậm chí rất quan trọng với thực tế: nước ta có
nguồn dược liệu phong phú, có kinh nghiệm sử dụng thuốc từ thiên nhiên lâu đời,
có điều kiện môi trường phù hợp cho nuôi trồng phát triển nhiều loại dược liệu.
Trong đợt điều tra sơ bộ nguồn tài nguyên dược liệu vùng đồng bằng sông
Cửu Long do Trung tâm Sâm & Dược liệu thực hiện, phát hiện vùng Đồng Tháp
Mười có tơ xanh (Cassytha filiformis), mọc hoang và ký sinh trên các thực vật
khác như tràm gió (Melaleuca leucadeudron), lức (Pluchea indica) với lượng
sinh khối lớn.
Tơ xanh là một cây thuốc dân gian đã được dùng từ lâu và phổ biến tại
nhiều nước trên thế giới như ở Indonesia và Châu Phi dùng chữa giun sán, ký
sinh trùng, Trung Quốc dùng chữa vàng da ở trẻ em. Nước ta, tơ xanh cũng được
xem như một vị thuốc dân gian rất có ích, nước sắc tơ xanh dùng làm thuốc bổ,
chữa thận hư, liệt dương, mắt mờ, chân tay yếu mỏi…. [3].
Từ những nghiên cứu về dược liệu này với yêu cầu thực tiễn phát triển
nguyên liệu sạch dùng làm thuốc và thực phẩm chức năng ở trong nước, chúng
tôi thực hiện đề tài với hy vọng làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn, tiến

2

đến việc ứng dụng một dược liệu vốn rất giàu trữ lượng ở khu vực Đồng tháp
mười với mục tiêu:
- Khảo sát đặc điểm thực vật học của tơ xanh.
- Phân tích thành phần hoá thực vật, định tính và định lượng alkaloid có
trong tơ xanh
- Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ tơ xanh.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết, phân đoạn alkaloid toàn
phần và các alkaloid tách được.


Toång quan đề tài
3

1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.1. Đặc điểm sinh học và thành phần hoá học của cây tơ xanh
- Đặc điểm sinh học của cây tơ xanh [1] [3]
Tên khoa học là Cassytha filiformis L., Thuộc chi Cassytha, họ Lauraceae. Chi
Cassytha dị biệt trong họ vì là cỏ bán kí sinh có lá tiêu giảm thành vảy.
Chi Cassytha có khi tách thành họ Cassythaceae [16]. Gồm khoảng gần 20 loài,
phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, nhất là Australia có 15 loài, trong đó có 13 loài
là đặc hữu. Ở Việt Nam chi này có 2 loài là tơ xanh (Cassytha filiformis L.) và tơ
xanh chỉ (Cassytha capillaris Meissn.) [15].
Mô tả
Cây thảo leo, mọc xoắn vào nhau, thân màu lục sẫm, lá tiêu giảm thành vảy [3].
Có vòi hút nhựa nguyên cây chủ, thân có lông mịn. Gié dài 2-5cm, hoa nhỏ có 3
lá phụ, đài và vành đính thành ống tròn, tiểu nhụy thụ 9, lép 3. Bế quả cứng, đen
trong một bao hoa đồng trưởng.
Phân bố, sinh thái

Loài tơ xanh phân bố rộng rãi khắp các vùng nhiệt đới ở cả hai bán cầu từ châu
Phi đến châu Đại Dương và châu Á. Ở châu Á, tơ xanh có mặt hầu như khắp các
nước vùng Nam Á (Ấn Độ, Xrilanka) đến vùng Đông Nam Á (Indonesia,
Philippin, Thái Lan, Malaysia, Campuchia, Lào, Miama, Việt Nam.), đảo Hải
Nam và vùng Trung và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, tơ xanh cũng phân bố phổ
biến hầu như khắp các tỉnh miền núi (dưới 1500m), trung du và đôi khi gặp cả ở
các tỉnh đồng bằng ven biển và hải đảo.
Tơ xanh là một dạng sống khá đặc biệt. Toàn cây có diệp lục nhưng lại sống
bán kí sinh trên các loại cây cỏ thuộc nhiều họ thực vật khác nhau, cây ưa sáng,
chịu được khí hậu khô nóng ở các vùng đồi cây bụi, nương rẫy và rừng thưa. Khi
tơ xanh bám trên các loại cây 2 lá mầm như sim, mua, thảu táu…nó thường cắm
các giác mút vào vỏ cây chủ để trở thành đối tượng kí sinh. Ngược lại, khi nó
bám trên các thân, lá các loài cỏ cây có một lá mầm) như cỏ tranh, cỏ lông, cỏ
bông…thì không thấy có giác mút nữa mà chỉ là cây phụ sinh, các tế bào diệp lục
trên thân làm chức năng quang hợp và bảo đảm toàn bộ quá trình dinh dưỡng của
cây.
Toång quan đề tài
4

Tơ xanh ra hoa quả nhiều hằng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Tuy
nhiên, quá trình nảy mầm của hạt cần có sự cộng sinh của một loại vi khuẩn làm
mềm vỏ hạt. Cây còn có khả năng tái sinh vô tính từ những đoạn thân, cành khi
được tiếp xúc với cây chủ hoặc cây giá thể.
1.2. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài
- Thành phần hóa học của cây tơ xanh
Tơ xanh có một lượng Aporphinoid Alkaloid 0.43% gồm neolitsin, cassythin,
dicentrin, actinodaphnin, nomeolitsin, neolitsin và cassythidin [22], cathafilin,
cathaformin, cassyformin, N-methylactinodaphnin, predicentrin và ocotein. Ngoài
ra trong tơ xanh còn có các hợp chất khác như: các hợp chất lignan, aldehyd
thơm và phytosterol[18].

N
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
H

Hình 1. Cấu trúc khung aporphin
Bảng 1. Cấu trúc các alkaloid có khung aporphin.
Alkaloid R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
1.Neolitsin -OCH
2
O- H CH
3
-OCH
2
O- H
2.Nomeolitsin -OCH
2
O- H H -OCH
2
O- H
3.Cassythidin -OCH
2
O- -OCH
3

H -OCH
2
O-
H

4.Actinodaphnin -OCH
2
O- H H OH -OCH
3

H
5.Dicentrin -OCH
2
O- H CH
3
-OCH
3

-OCH
3

H
6.Cassythin -OCH
2
O- -OCH
3
H OH -OCH
3

H

Toång quan đề tài
5

- Tác dụng dược lý
Dùng chủng Salmonella typhi TA 98 tiến hành thí nghiệm gây đột biến thấy
dạng chiết từ tơ xanh có tác dụng làm giảm đột biến.
Alkaloid lautotetanin có tác dụng giống strychnin, gây co giật với liều lớn có
thể gây tử vong [3].
Aporphinoid alkaloid trong tơ xanh là các độc tố tế bào, được khảo sát là có
khả năng chống và ngăn ngừa các tế bào ung thư (thử nghiệm in vitro trên tế bào
ung thư HeLa), tác dụng kháng ki sinh trùng (thử nghiệm in vitro trên
Tripanosoma brucei brucei), những nghiên cứu của Caroline Stévigny (2004) và
cộng sự đánh giá các aporphinoid alkaloid là thành phần hoạt chất có hoạt tính
trong tơ xanh gồm actinodaphnine, cassythine, dicentrine, có tác dụng độc tế bào
trên một số dòng tế bào ung thư như HeLa, Mel-5, HL-60, chống ngưng tập tiểu
cầu và kháng ký sinh trùng Trypanosoma brucei brucei gây bệnh ngủ, đặc biệt,
nghiên cứu dược lý của tác giả này chứng minh actinodaphnine là alkaloid có tác
dụng ức chế chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư invitro (trên dòng tế bào
thường 3T3 IC
50
: 66.4 µM, trên các dòng tế bào ung thư HeLa: 30.9 µM, Mel-5:
25.7 µM, HL-60: 15.4 µM) [17, 22].
Năm 2008, Tung Hu Tsai và cộng sự công bố chiết tách được 2 aporphine
alkaloid mới đặt tên isofiliformine và cassythic acid cùng 22 hợp chất alkaloid và
flavonoid khác đã biết khác, nhóm tác giả này cũng đánh giá hoạt tính giãn mạch
trên thực nghiệm co động mạch chủ ở chuột bởi phenylendrin của các hợp chất
cassythic acid , cassythine, neolitsine, và dicentrine với IC
50
trong khoảng 0,08 –
2,48 µM so với chứng acetylcholin 3 µM [23].

Ñoái töôïng & phöông phaùp
6

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Mẫu cây tơ xanh (Cassytha filiformis L.) được thu tại Gò Tháp (Đồng
Tháp) vào khoảng tháng 2-4 năm 2006. Các nguyên liệu này được lấy trên những
loại cây chủ khác nhau: tràm gió (Melaleuca leucadeudron) họ Myrtaceae, táo
(Zizyphus cenoplia) họ Rhamnaceae, cỏ (họ Poaceae), phi lao (Casuarina
equisetifolia) họ Casuarinaceae, lức (Pluchea indica) họ Asteraceae. Một ít nguyên
liệu tươi dùng để nghiên cứu về thực vật học, còn lại rửa sạch phơi khô bảo quản ở
nhiệt độ phòng để nghiên về hóa học. Mẫu nghiên cứu thực hiện trên tơ xanh ký
sinh ở tràm gió (Melaleuca leucadeudron).
- Các dòng tế bào HeLa, ung thư phổi NIC-H460, ung thư vú MCF-7 được
cung cấp bởi PTN SHPT trường đại học Khoa học tự nhiên.
- Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư phổi A549 được cung
cấp bởi phòng Sinh hóa bệnh học, đại học Toyama, Nhật Bản.
2.1.2. Hóa chất và trang thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
Dung môi
Toluen, diethylamin, cloroform, diethyl ether, aceton, ethanol. (Trung
Quốc).
Methanol công nghiệp.
Hoá chất
Javel, carmin 1%, lục iod 0,1%, acid acetic, amoni hydroxid, anhydric
acetic, FeCl

3
, HCl, H
2
SO
4
, KOH, Mg, CaSO
4
khan, NaCO
3
.
Các thuốc thử Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Fehling, Erdman. [8]
2.1.2.2. Trang thiết bị
Tủ sấy KC-65.
Cân phân tích Meltler Toledo AB-204.
Máy cô quay BUCHI (Đức).
Đèn soi UV-VIS DESAGA SARSTEDT GRUPPE.
Kính hiển vi CETI.

Ñoái töôïng & phöông phaùp
7

Bồn siêu âm Elma LC60H (Đức).
Bếp cách thủy Memmert (Đức).
Tủ sấy chân không VWR S/P.
Máy ảnh kĩ thuật số FinePix S20 Pro
2.2. Phương pháp nghiên cứu về thực vật học
2.2.1. Thu mẫu và xử lý mẫu
2.2.1.1. Thu mẫu [9]
Mẫu cây tơ xanh được nhổ cả cây và chỉ lấy những cây trưởng thành có
mang bộ phận sinh sản.

Ghi nhãn bằng bút chì rồi buộc vào giữa mẫu. Trên nhãn: tên cây, ngày lấy,
nơi lấy, người lấy.
Thu được khoảng 8 kg nguyên liệu tươi, rửa sạch phơi khô còn 2 kg.
2.2.1.2. Xử lý mẫu
Toàn bộ mẫu cây được rửa sạch, chọn những mẫu đẹp, mang đầy đủ các bộ
phận hoa, quả để ép làm tiêu bản khô. Lưu mẫu ở Trung Tâm Sâm và Dược liệu.
2.2.2. Khảo sát đặc điểm hình thái
Tiến hành khảo sát đặc điểm hình thái của cây tơ xanh được thu thập ở Gò
Tháp (Đồng Tháp) trên cây chủ là tràm gió (Melaleuca leucadeudron).
2.2.3. Khảo sát đặc điểm vi học
2.2.3.1.Vi phẫu [9]
Chọn mẫu: chọn những mẫu tươi, không quá già hoặc non.
Cắt mẫu: cầm vật ở tay trái, kẹp giữa ngón cái và ngón trỏ, ngón trỏ làm điểm
tựa cho lưỡi lam. Tay thuận cầm lưỡi lam thật sắc để cắt mẫu.
Nhuộm phối hợp: dùng phương pháp nhuộm kép cacmin-phèn chua và xanh
methylen.
- Mẫu vi phẫu sau khi cắt được ngâm trong nước javel trong khoảng 15-30 phút
để loại các chất trong tế bào (đến khi lát cắt trắng).
- Rửa sạch mẫu bằng nước thường (3-4 lần).
- Ngâm mẫu vào dung dịch acid acetic để loại hết nước javel còn dính lại và tiếp
tục rửa sạch mẫu đến khi hết mùi acid acetic bằng nước thường.

Ñoái töôïng & phöông phaùp
8

- Nhuộm mẫu trong dung dịch nhuộm kép cacmin-phèn chua và xanh methylen
trong khoảng 15 phút. Sau đó rửa mẫu bằng nước cất.
- Quan sát lát cắt dưới kính hiển vi trong giọt glycerin 30%.
- Quan sát tổng thể, mô tả chi tiết và chụp hình minh họa.
2.2.3.2. Soi bột [10] [11]

Ghi nhận các đặc điểm cảm quan của bột: màu sắc, mùi vị.
Soi bột
Cách lên tiêu bản bột: lấy một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên
một phiến kính, nhỏ 1-2 giọt chất lỏng để soi (thường là nước), khuấy kĩ cho bột
phân tán đều trên phiến kính (có thể dùng góc của lá kính để khuấy). Đậy lá kính
bằng cách đặt nghiêng một cạnh lên phiến kính rồi hạ dần đầu kia cho đến khi lá
kính nằm ngang trên mặt phiến kính. Dùng ngón tay di nhẹ trên phiến kính cho bột
phân tán đều lần nữa. Dùng giấy thấm nước và bột thừa ở mép phiến kính.
Quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm của bột và chụp hình minh họa.
2.3. Phương pháp nghiên cứu về hóa học
2.3.1. Độ tinh khiết
Xác định độ ẩm [11] [12]
Sấy khô đĩa nhôm đựng mẫu đến khối lượng không đổi ở 105
0
C. Cân chính xác
khoảng 2g bột dược liệu vào trong đĩa nhôm, đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ
105
0
C đến khối lượng không đổi. Lấy đĩa nhôm đựng mẫu ra để trong bình hút ẩm
đến khi nguội rồi đem cân và ghi kết quả.
Thực hiện 3 lần trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình.
Độ ẩm được xác định theo công thức:
(a - b) x 100
a
A%=

Với A%: Độ ẩm của dược liệu.
a : Khối lượng dược liệu khi chưa sấy.
b : Khối lượng dược liệu khi sấy đến khối lượng không đổi.
Xác định độ tro [11] [12]

- Tro toàn phần

ẹoỏi tửụùng & phửụng phaựp
9

Chộn nung bng s ó c nung n khi lng khụng i. Cõn chớnh xỏc
khong 2g dc liu tri u ỏy chộn. t chộn cha dc liu lờn bp in
nung cho n khi dc liu chỏy thnh than v ht khúi trng.
t chộn vo lũ nung 300
o
C 600
o
C cho n khi tro trng. Dựng kp st ly
chộn nung ra v ngui trong bỡnh hỳt m. Sau ú em cõn v ghi kt qu. Tin
hnh nung li nh trờn v ghi kt qu cho n khi khi lng chộn nung khụng
i.
Thc hin 3 ln trờn 3 mu ly giỏ tr trung bỡnh.
tro c tớnh theo cụng thc:

B% =
(a - b) x 100
c - (c x A)

Vi : B%: t l tro ton phn tớnh trờn nguyờn liu khụ kit.
a : khi lng ca chộn v tro.
b : khi lng chộn khụng.
c : khi lng dc liu.
A : m dc liu.
- Tro khụng tan trong acid HCl
Ly chộn nung cha tro ton phn trờn, thờm vo chộn nung 2-3 ml HCl 10%.

y np chộn nung v un cỏch thy trong 10 phỳt. Pha loóng phn cũn li trong
chộn nung vi 5 ml nc ct núng. Lc qua giy lc khụng tro. Dựng nc ct
núng trỏng ht tro cũn ng trong chộn. Tip tc dựng nc ct núng ra tro v
giy lc n khi dch lc trung tớnh.
Cho c giy lc v tro tr li chộn nung, sy khụ, t, nung, ngui ri
cõn nh khi xỏc nh tro ton phn.
2.3.2. Phõn tớch s b thnh phn hoỏ thc vt [11]
Qui trỡnh phõn tớch s b thnh phn hoỏ thc vt ny da trờn qui trỡnh ca
Ciuley (trng i hc dc khoa Rumani).
Nguyờn tc
Chit tỏch hn hp cỏc cht cú trong nguyờn liu thc vt thnh 3 phõn on
theo phõn cc tng dn: kộm phõn cc, phõn cc trung bỡnh v phõn cc mnh.

Ñoái töôïng & phöông phaùp
10

Bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol và
nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng phản ứng đặc trưng.

Sơ đồ 1. Chuẩn bị các dịch chiết

Dược liệu
Dịch chiết cồn thủy phân
Ether ethylic/soxhlet
Ethanol hồi lưu
Nước/Cách thủy
HCl 10%/Cách thủy
Chiết lại bằng ether
HCl 10%/Cách thủy
Chiết lại bằng ether
Bã dược liệu
Bã dược liệu
Bã dược liệu
Dịch chiết ether
Dịch chiết cồn
Dịch chiết nước thủy phân
Dịch chiết nước

ẹoỏi tửụùng & phửụng phaựp
11

Bng 2. Túm tt quy trỡnh phõn tớch s b húa thc vt



Cht bộo
M giy lc
Tinh du
Cn cú mựi thm
Carotenoid

Phn ng Carr-Price
Tritepenoid t do
Phn ng Liebermann-Burchard
Coumarin
Phỏt hunh quang/ OH
-

Alkaloid
Thuc th chung
Anthraquinon
Phn ng Borntrọger
Flavonoid
Phn ng Cyanidin

Alkaloid
Thuc th chung
Coumarin
Phỏt hunh quang/ OH
-

Glycosid tim
Thuc th Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid pyron
Phn ng Cyanidin
Anthocyanidin
HCl
Proanthocyanidin
HCl/t
0

ta
Tannin
FeCl
3
5%, gelatin mui
Saponin
Tớnh to bt trong nc
Acid hu c
Na
2
CO
3


si bt
Hp cht kh
Thuc th Fehling


Triterpenoid thy phõn

Phn ng Liebermann-Burchard
Coumarin
Phỏt hunh quang/ OH
-

Anthraquinon
NaOH 10%

lp kim cú mu hng ti
Glycosid tim
Thuc th Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid
Phn ng Cyanidin


Alkaloid
Thuc th chung
Glycosid tim
Thuc th Raymond-Marthoud, xanthydrol
Flavonoid pyron
Phn ng Cyanidin
Anthocyanidin
HCl
Proanthocyanidin
HCl/t
0


ta
Tannin
FeCl
3
5%, gelatin mui
Saponin
Tớnh to bt trong nc
Acid hu c
Na
2

CO
3


si bt
Hp cht kh
Thuc th Fehling
Polyuronic
Pha loóng trong cn

ta


Triterpenoid thy phõn

Phn ng Liebermann-Burchard
Glycosid tim
Thuc th Raymond-Marthoud, xanthydrol
Anthraquinon
NaOH 10%

lp kim cú mu hng ti
Flavonoid
Phn ng Cyanidin
Dch ether
Dch cn
Dch cn
thy phõn
Dch nc
Dch nc

thy phõn

Ñoái töôïng & phöông phaùp
12

2.3.3. Định tính và định lượng alkaloid
- Định tính bằng phản ứng hoá học và SKLM:
● Định tính bằng phản ứng hóa học
- Chiết xuất
Kiềm hóa 10-20g bột dược liệu bằng NH
4
OH 25%. Chiết Alkaloid base trong
dược liệu với dung môi là cloroform bằng đun hồi lưu. Dịch chiết sau dó được lắc
với acid sulfuaric 2%. Dịch acid dùng để định tính Alkaloid bằng các thuốc thử
định tính chung.
- Phản ứng định tính
Dịch acid được chia vào 4 ống nghiệm để định tính với các thuốc thử định tính
chung của Alkaloid sau:
- Thuốc thử Mayer: Các Alkaloid sẽ cho tủa vô định hình màu trắng hay
vàng ngà.
- Thuốc thử Dragendorff: Các Alkaloid cho tủa màu đỏ cam.
- Thuốc thử Bouchardat: Các Alkaloid cho tủa màu nâu.
● Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
Chất hấp phụ: bản mỏng tráng sẵn sillicagel 60 F
254
(Merck).
Thăm dò và xác định Alkaloid trên hệ dung môi khai triển:
Toluen : ethylacetat : diethylamin ( 7 : 2 : 1).
Toluen : ethylacetat : diethylamin ( 1 : 3 : 1).
Toluen : aceton : ethanol : amoniac ( 45 : 45 : 7 : 3).

Dịch chấm: cắn Alkaloid toàn phần (trong định lượng Alkaloid) được hoà tan
trong cloroform và dịch chiết chung (trong định tính alkalloid bằng sắc kí lớp
mỏng).
Chuẩn bị dịch chấm (dịch chiết chung): Kiềm hoá 1g dược liệu bằng 1ml
amoniac 10%, sau đó chiết bằng 5ml methanol trong 10 phút ở bể siêu âm. Lọc,
dịch lọc được cô nhẹ trên bếp cách thủy còn khoảng 0,5ml. Dịch này dùng chấm
sắc kí định tính Alkaloid.
Phát hiện:
Tia UV 254nm : Có những vết tắt quang.

ẹoỏi tửụùng & phửụng phaựp
13

Thuc th Dragendorff : Phun v sy nh bn mng, xut hin nhng vt
cam n cam.
Hi Iod : H trong hi Iod, xut hin nhng vt nõu n .
- nh lng Alkaloid bng phng phỏp cõn
Cõn chớnh xỏc khong 10g dc liu, lm m bng NH
4
OH 10% v chit hi
lu trong 30 phỳt ln lt vi cloroform (50x40x40ml ), cho ti khi dch chit
khụng cũn phn ng vi thuc th Alkaloid na. Lc v gp chung dch chit vo
bỡnh lng gn. Chit Alkaloid bng dung dch acid hydrocloric 2% (20x10x10ml )
cho ti khi dch chit acid khụng cũn phn ng vi thuc th Alkaloid na. Gp
chung dch chit acid vo bỡnh lng gn, kim húa bng NH
4
OH 10% cho ti pH
10, chit Alkaloid base bng cloroform (20x10x10ml) cho ti khi dch chit
khụng cũn phn ng vi thuc th Alkaloid na. Gp chung dch chit cloroform
vo bỡnh lng gn, ra dch chit bng nc ct. Gn lp cloroform vo mt

bercher khụ v lm khan bng Na
2
SO
4
khan, gn dch chit ó lm khan vo
bercher khụ 100ml ó cõn bỡ trc. Ra lp Na
2
SO
4
bng 5ml cloroform 2 ln v
gp chung vo dch chit cloroform. Bc hi dch cloroform trờn bp cỏch thy
cho ti cn v sy cn 110
o
C cho ti khi lng khụng i. Cõn cn vi khi
lng l P(g). Thc hin 3 ln trờn 3 mu.
Tớnh hm lng Alkaloid ton phn cú trong 100g mu:
A = P x
a(1 - h)
100

Vi A: hm lng Alkaloid ton phn cú trong 100g mu.
a: khi lng dc liu em nh lng.
h: m ca mu nh lng.

2.3.4. Chit xut Alkaloid
p dng v so sỏnh hai cỏch chit xut Alkaloid khỏc nhau vi lng mu ln.
Chit xut Alkaloid bng dung dch acid loóng trong nc [14]
500g bt dc liu c chit bng acid hydrocloric 3ln (3x2x2l) theo phng
phỏp ngõm lnh trong 24 gi, cú khuy u. Lc v gp chung dch chit acid li,
ly tõm b ta. Kim hoỏ dch acid bng amoniac 10% n khong pH10. Lc dch

ẹoỏi tửụùng & phửụng phaựp
14

acid ó kim húa vi cloroform trong bỡnh lng gn cho n khi dch cloroform
khụng cho phn ng dng tớnh vi thuc th Alkaloid na. Gp chung dch
cloroform, em cụ gim ỏp v sau ú cụ trờn bp cỏch thy n cn Alkaloid thụ
v nh tớnh li bng SKLM.
Chit xut Alkaloid bng dung dch acid loóng trong cn [6][17]
300g bt dc liu c chit bng un hi lu vi dung mụi chit l methanol :
acid acetic ( 99 : 1 ), chit 3 ln (1lớt / ln).Lc v gp chung dch chit, em cụ
gim ỏp cũn khong ẳ th tớch dch chit. Ra dch ó cụ bng ether, sau ú kim
húa n khong pH 10 v chit Alkaloid trong dch ó kim húa bng cloroform
trong bỡnh lng gn. Gp chung dch cloroform, cụ gim ỏp v sau ú cụ cỏch thy
n cn Alkaloid thụ v nh tớnh bng SKLM.
2.3.5. Tinh ch v phõn lp Alkaloid [6, 11]
Cn Alkaloid sau khi chit xut c a qua sc kớ ct tỏch Alkaloid.
Cn Alkaloid thụ c trn vi bt silica gel v sy khụ chun b bt np
mu (np mu dng bt khụ). Hũa bt silica gel vo dung mụi nn chy ct l
aceton v nhi vo ct. Np mu bt khụ vo ct v tin hnh chy ct. H dung
mụi ra ct c thm dũ trờn SKLM trc, aceton:ethanol (5:5).
Bng 3. Cỏc thụng s v ct sc kớ.
Cht hp ph Silicagel 60 (0,04-0,063 mm)
230-400 Mesh. (Merck)
Lng cht hp ph 160g
Kớch thc ct ( x h) (cm) 4 x 25
Mu Alkaloid ton phn
Dung mụi ra ct (aceton:ethanol) 5 : 0
5 : 1
5 : 2

Tc dũng chy (git/phỳt) 15
Th tớch mi phõn on hng(ml) 20
Tng s phõn on 28

Sc kớ lp mng kim tra :

Ñoái töôïng & phöông phaùp
15

- Hệ dung môi khai triển : acetone : ethanol (5 : 5).
- Thuốc thử phát hiện : phun Dragendorff.
Sau khi kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn có thành phần giống nhau
được gom lại. Tiếp tục tách để tinh khiết hơn bằng sắc kí lớp mỏng chế hóa.
● Điều kiện sắc kí lớp mỏng chế hóa
Chất hấp phụ: Bột silica gel G (MERCK) cỡ hạt 5-40µm. Được tráng trên bản
mỏng dày khoảng 0,5mm, hoạt hóa ở 110
0
C trong 1 giờ.
Dịch chấm sắc kí: Các phân đoạn có chứa Alkaloid (dương tính với thuốc thử
phun Dragendorff) sau khi chạy cột sắc kí.
Dung môi khai triển: acetone : ethanol (5 : 5)
Phát hiện: Dùng tấm kính khác che bản mỏng chừa một phần nhỏ bên phải
và trái để phun thuốc thử Dragendorff. Xác định và cạo vùng sillicagel có
Alkaloid, phản hấp phụ bằng dung môi aceton. Lọc lấy dịch trong, cô đến cắn và
cân.
2.3.6. Xác định các đặc tính lý hóa của Alkaloid tách được
Các chất thu được qua sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng chế hóa được đem xác định
các chỉ tiêu:
● Điểm chảy: Được đo trên máy Stuart SMP
3

tại phòng máy Trung tâm sâm và
dược liệu.
● Phổ hồng ngoại: Được đo trên máy BRUKER-IFS48*CARLO-GC6130 tại
Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm.
● Đo phổ tử ngoại UV-vis: Được đo trên máy đo quang UV-vis Heλiosy,
cuvette thạch anh 1cm. Thực hiện tại phòng máy Trung tâm sâm và dược liệu.
● Phổ NMR được đo tại Khoa Hoá, trường đại học Khoa học tự nhiên TPHCM.

ẹoỏi tửụùng & phửụng phaựp
16

2.4. Phng phỏp nghiờn cu hot tớnh sinh hc
Chun b cỏc mu th:
- Cao MeOH ton phn (mu MeOH): Chit ngm kit 100 g nguyờn liu vi
MeOH 100 ml x 6 ln (t l 1:6; KL:TT), lc gp cỏc dch lc cụ gim ỏp n
cn thu c cao MeOH lm mu th.
- Alkaloid tng (mu Atp): mu c chit theo mc (2.3.3. : chit xut akaloid
ton phn bng dung dch acid loóng trong cn).
- A1 v A2: l hai alkaloid ó chit tỏch c, A1: Cassythine.


Mu th c pha trong DMSO v pha loóng bng mụi trng n nng thớch
hp. Mu chng õm l mu cú cựng nng DMSO vi mu th, nng
DMSO sau cựng khụng vt quỏ 0,1%.
2.4.1. Th nghim SRB
Nguyờn tc
- Th nghim SRB (Sulforhodamine B) l mt phng phỏp so mu n gin v
nhy xỏc nh c tớnh t bo ca mt cht. SRB l mt thuc nhum tớch in
õm s liờn kt tnh in c vi cỏc phn tớch in dng ca protein. Lng
thuc nhum liờn kt s phn ỏnh lng protein tng ca t bo.

- Trong th nghim, t bo c c nh, ra v nhum vi SRB. Sau ú SRB
liờn kt vi protein t bo c hũa tan to dung dch trong sut cú mu hng.
Mt quang o c ca dung dch tng quan vi lng protein tng hay s
lng t bo. S thay i lng t bo so vi mu chng phn ỏnh c tớnh t
bo ca cht nghiờn cu.
Quy trỡnh kho sỏt hot tớnh gõy c bng phng phỏp SRB
- Gii ụng ngun t bo ung th bo qun trong Nit lng, nuụi cy t bo n
th h th 4 (P4).
- Nuụi t bo trong bỡnh nuụi cy t ph khong 70 - 80%.
- Ph t bo vo cỏc ging trờn a 96 ging vi mt t bo/ging ban u l
10
4
t bo/ging (i vi dũng t bo HeLa v MCF-7) v 7,5.10
3
tb/ging (i
vi dũng NCI-H460) theo thit k (*)
- 37
o
C, 5% CO
2
, 24 gi.

ẹoỏi tửụùng & phửụng phaựp
17

- B sung mụi trng cha cht th vi nng gp ụi nng mun th (chỳ
ý: khụng loi b mụi trng c ó cú trong ging).
- 37
o
C, 5% CO2, 48 gi.

- C nh t bo trong ging vi trichloroacetic acid (TCA) :
+ i vi nhng dũng t bo bỏm dớnh: s dng dung dch TCA 50% lnh vo
mi ging (cho vo t t khụng quỏ nhanh).
+ i vi nhng dũng t bo l lng: s dng dung dch TCA 80% lnh vo mi
ging
- t a trờn vo trong t lnh (4
o
C), 1-3 gi.
- Loi b cht lng trong mi ging
- Ra nh nhng vi nc (200àl/ging) 5 ln.
- khụ t nhiờn nhit phũng, 12-24 gi.
- Nhum SRB:
+ Cho dung dch SRB 0,2% vo mi ging.
+ nhit phũng, 5-20 phỳt.
+ Loi b dung dch SRB.
+ Ra nh nhng bng dung dch acetic acid 1% (5 ln)
+ khụ t nhiờn nhit phũng 12-24 gi.
- c kt qu
+ Cho 200 àl Tris-base 10mM vo mi ging.
+ t lờn mỏy lc khong 10-15 phỳt cho n khi SRB tan hon ton.
+ o mt quang bc súng 492nm v 620nm.
(*)Thit k kho sỏt, gm:
- 1 mu chng dng: t bo vi camptothecin nng 0.01(àg/ml).
- 1 mu chng õm: t bo vi dung mụi hũa tan cht th (DMSO 0.25%)
- Cỏc mu cn th nghim hot tớnh gõy c.
- Thit k th nghim ca 1 mu, gm:
+ 2 ging t bo + mụi trng nuụi cy cú cha cht th nng kho sỏt.
+ 2 ging khụng cú t bo + mụi trng nuụi cy cú cha cht th nng
kho sỏt (2 ging blank).
X lý kt qu