Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy và bảo vệ gan của hạt vải (semen litchi chinensis)

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
TÁC DỤNG CHÓNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ GAN CỦA HẠT VẢI
(SEMEN LITCHICHINENSIS)
Pham Thi Anh', Hồ Thanh Nga
HDKH; PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển^
‘Cao học 16 - Trường Đại học Dược Hà Nội
^Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: bảo vệ gan, tác dụng chống oxy hóa, semen litchi.
Tóm tắt
Mục tiêu: Khảo sát thành phần hóa học, tác dụng chổng oxy hóa và bảo vệ
gan của hạt vải. Phương pháp nghiên cứu: Định tính và định lượng các nhóm
chất bằng phản ứng hóa học theo phương pháp thường quy; phân lập các chất
bằng sắc ký cột. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan trên mô hĩnh gây tổn thương gan
cấp bằng carbon tetraclorid; định lượng MDA theo phương pháp Wasowich và
Balahoroglu. Kết quả chính và kết luận: về thành phần hoả học: Định tính được
trong hạt vải có một so nhóm hợp chất: flavonoid, coumarin, anthranoid,
saponin, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất béo, sterol, caroten,
acid hữu cơ; phân lập được 1 chất tinh khiết là acid procatechuic và hỗn hợp 2
chất đã xác định được cấu trúc là procyanidin A I và procyanidin A2. về tác
dụng sinh học: Hạt vải có tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm
DPPH trong đó cắn chiết phân đoạn ethyl acetat có tác dụng mạnh nhất. Dịch
chiết ethanol 50% hạt vải có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây viêm gan cấp
bằng carbon tetraclorỉd ở mức liều thử tương đương với 10 g dược liệu/kg chuột,
nhưng yếu.
Đặt vấn đề
Vải (Litchi chinensis Sonn.) là loài cây nhiệt đới và cận nhiệt đới được
trồng rất phổ biến trên thế giới. Tại Việt Nam, vải là loài cây ăn quả có giá trị
Idnh tế và dinh dưỡng cao, được trồng ở hầu hết các tỉnh miền Bắc. Một trong
những dư phẩm của quá ừình chế biến, sử dụng vải là hạt vải và thưòng bị loại
bỏ như là rác thải. Hiện nay, một số nhà nghiên cứu trên trên thế giới đã và đang
được chú ý đến tác dụng hạ đưÒTig huyết, hạ lipid máu, chống ung thư, đặc biệt là

tác dụng chống oxy hóa của hạt vải. Do vậy, có thể thấy hạt vải là nguồn dược
liệu tiềm năng cung cấp các chất chống oxy hóa như flavonoid, tanin, các họp
chất polyphenol [2, 3] ... ở Việt Nam, hạt vải được sử dụng như một vị thuốc cổ
truyền với công năng lý khí chỉ thống, cũng như được sử dụng theo kinh nghiệm
dân gian tuy nhiên mức độ còn hạn chế. Vì vậy, để góp phần phát huy giá trị của


hạt vải chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "'Nghiên cứu thành phần hóa học, tác
dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của hạt Vải (Semen Lỉtchi chinensis Sonn./’
với mục tiêu: Khảo sát thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa, vệ gan
của hạt vải.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Hạt vải được thu hái ở Thanh Hà, Hải Dương vào tháng 5-6 năm 2012.
Mau cây có hoa được TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học
Dược Hà Nội, giám định tên khoa học là: Litchỉ chinensis Sonn., Họ Bồ hòn
(Sapindaceae). Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật,
XrưÒTig Đại học Dược Hà Nội, mã tiêu bản: HNIP/17853/13. Các hóa chất đạt
tiêu chuẩn phân tích; chuột nhắt trắng đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ưong cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu
Thành phần hóa học: Chiết xuất và định tính các nhóm chất bằng các phản
ứng hóa học thường quy; định lượng các chất tan trong n-hexan, ethyl acetat, nbutanol bằng phương pháp cân; phân lập các chất bằng sắc ký cột (silicagel, cỡ
hạt: 0,040 - 0,063 mm, Merck), xác định cấu trúc chất phân lập được dựa trên các
thông số vật lý và các phương pháp phổ.
Tác dụng sinh học:
- Sàng lọc khả năng chống oxy hóa in vitro: Thực hiện theo phương pháp
thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH của Philip Molyneux (2004) [6],
- Kliảo sát tác dụng bảo vệ gan: Thử nghiệm được tiến hành trên chuột
nhắt trắng gây tổn thương gan cấp bằng C C I4 của Turner R.A (1965), có cải tiến

phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [7], Định lượng AST, ALT, bilirubin
trong huyết thanh bằng máy định lượng sinh hóa tự động sử dụng kit của hãng
DIALAB GmbH (Áo). Định lượng MDA trong gan bằng phương pháp
Wasowich và Balahoroglu [1,8].
- Xử lý số liệu: Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê
dùng trong y sinh học bằng phần mềm Microsotf Office Excel 2007.
Kết quả nghiên cứu
về thành phần hóa học
Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu hạt vải bằng phản ứng hóa học:
- Bằng các phản ứng định tính thường quy cho thấy, trong hạt vải có một
sô nhóm hợp chất sau: ílavonoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid
amin, đường khử, polysaccharid, chất béo, sterol, caroten, acid hữu cơ.


- ‘Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong các cắn phân đoạn cho kết quả:
hàm lưọfng chất tan trong phân đoạn cồn nước (N) là 1,50%, cao nhất trong các
phân đoạn khảo sát. Tiếp theo là phân đoạn n-hexan (H) 0,70%, phân đoạn nbutanol (B) 0,63%) và phân đoạn ethyl acetat (E) 0,27%. Định tính các chất trong
các phân đoạn cho kết quả: trong cắn H có sterol, caroten, chất béo. Trong cắn E
có flavonoid, anthranoid, saponin, tannin, acid hữu cơ. cắn B có flavonid,
saponin, cắn N có flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid,
tannin và coumarin.
Phãn lập các chất:
- Từ 30 g cắn phân đoạn ethyl acetat, bằng phương pháp sắc ký cột với
chất hấp phụ là silicagel pha thường, hệ dung môi rửa giải là hồn hợp
dicloromethan và methanol với tỷ phù hợp đã phân lập được 238 mg chất MSI
và 534 mg chất MS2.
- Tiến hành chạy phổ và so sánh các dữ liệu phổ của MSI thu được với
acid 3,4 dihydroxy benzoic thấy có sự tương đồng. Bước đầu nhận định chất
MSI là acid 3,4 dihydroxy benzoic có công thức cấu tạo như sau:

- Dựa vào tài liệu tham khảo và phổ khối lượng dự kiến công thức cấu tạo
của chất MS2 là hồn hợp gồm 2 chất Al và A2.
- So sánh với dữ liệu phổ chuẩn, bước đầu nhận định MS2 là hồn hợp của
2 đồng phân procyanidin Al và procyanidin A2 với công thức cấu tạo như sau:

Procyanidin Al
Procyanidin A2
về tác dụng chống oxy hóa
- Mau nghiên cứu: Cao hạt vải chiết bằng ethanol 50% (HVTl), ethanol
80% (HVT2), n-hexan (HVH), ethyl acetat (HVE) và n-butanol (HVB).
- Mầu đối chứng; Quercetin (Sigma).


- Kết quả: Kết quả thí nghiệm sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro,
với thử nghiệm dọn gốc DPPH cho thấy, các cao hạt vải đều thể hiện có tác dụng
chống oxy hóa nhưng mẫu thử HVH kliông thể hiện tác dụng rõ rệt với % ức chế
DPPH ở nồng độ 200 /xg/ml là 12,87%. Do vậy, chúng tôi không tiến hành xác
định IC50 của mẫu này. Kết quả sàng lọc thu được 4 mẫu cao chiết có tác dụng
dọn gốc tự do DPPH được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do DPPH
QE

M âu

HVTl

H V T2

HVB

HVE

% ư c chê

% ư c chê

% ư c chê

% ư c chê

Cu,
'/íg/ml

% ư c chê

200

95,85 ± 0,48

91,32 ± 3 ,0 2

92,19 ± 1,35

96,13 ± 1,11

93,23 ± 0,9

200
100

93,0 ± 0 ,3 7

40

73,2 ± 0 ,3 9

73,43 ± 1,38

72,72 ± 3 ,9 6

92,36 ± 2,97

60,15 ± 1,68

50

53,9 ± 0,47

52,48 ± 1 ,5 0

53,69 ± 1,36

74,65 ± 1,91

25

23,8 ± 1,05

16,88 ± 0 ,5 4

23,49 ± 0 ,8 1

49,54 ± 0 ,7 2

12,5

29,36 ± 0 ,7

12,23 ± 0 ,1 1

11,68 ± 0 ,9 5

22,98 ± 1,38

36,99

50,82

47,4

26,87

1,6
0,32

6,88 ± 1 ,5 6

IC 5

5,10

Kêt quả thí nghiệm cho thây, cao chiêt phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính
dọn gốc tự do DPPH cao nhất (IC50 26,87 jUg/ml), tiếp theo là cao ethanol 50%,
cao n-butanol và cuối cùng là cao chiết bằng ethanol 80%. Tuy nhiên hoạt tính
chống oxy hóa của các mẫu thử đều kém hơn Quercetin.
Tảc dụng bảo vệ gan
- Mâu nghiên cứu: Căn cứ kết quả thử tác dụng chống oxy hóa, chúng tôi
lựa chọn mẫu cao chiết ethanol 50% hạt vải (tác dụng mạnh nhất) để tiến hành
thử tác dụng bảo vệ gan với 2 mức liều tưoĩig đưong với 5 g dược liệu/ kg và 10
g dược liệu/ kg thể trọng chuột.
- Tiến hành thử nghiệm: chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô,
mỗi lô 1 2 con:
Lô 1 (chứng sinh học - Csh): uống nước cất + tiêm dầu olive.
Lô 2 (chứng bệnh lý - Cbi ): uống nước cất + tiêm ccydầu olive.
Lô 3 (chứng dương - Csi): uống silymarin 100 mg/kg + tiêm CCLt/dầu olive.
Lô 4 (thử thuốc HV5): uống cao hạt vải với liều tương đương 5 g dược
liệu/kg thể trọng chuột nhắt trắng + tiêm CClVdầu olive.
Lô 5 (thử thuốc HVIO): uống cao hạt vải với liều tương đương 10 g dược
liệu/kg thể trọng chuột nhắt trắng + tiêm CCU/dầu olive.
Gây tổn thương gan chuột các lô 2, 3, 4, 5 bằng cách tiêm phúc mạc dung
dịch C C I4 liều 0,lml/10g chuột pha ừong dầu olive vào các ngày thứ 1, 3, 5 trong
thời gian nghiên cứu.
Chuột được cho uống nước cất hoặc mẫu thử với liều quy định liên tục
trong 8 ngày. Ngày thứ 8 , sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột lấy huyết thanh


định lượng AST, ALT, bilirubin bằng máy định lưọfng sinh hóa tự động, sử dụng
kit của hãng DIALAB GmbH (Áo). Lấy gan để tiến hành định lượng MDA. Kết
quả định lượng AST, ALT trong huyết thanh chuột gây độc gan bằng CCI4 được
trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên enzym AST và ALT
T
T

Lô
Chứng sinh lý
Chứng bệnh lý
Sylimarin
HVTl (5g/kgTT)
HVTl
(lOg/kgTT)

1
2
3
4
5

n

Hoạt độ
AST(UI/L)

% giảm so
vói iô (2)

10
12
11
12

185,31 ±79,6
4064,32 ± 374,32
2730,66 ± 1483,5
3196,8 ± 1297,76

32,8
21,50

12

3029,30 ± 1504,80

34,27

(2)

44,015 ± 18,87
4177,06 ±921,17
2364,79 ±1613,55
3217,80 ± 1523,73

34,38
21,58

2697,075 ± 1434,03

25,6

(AST, A].T )

P4.2>0,05 (ALT); P4-2< 0,05 0 \ST)
P3.2<0,01; P5.2<0,05

P2.,<0,0001

p

% giảm
so vói iô

Hoạt độ ALT
(UI/L)

Kêt quả định lượng nông độ bilirubin trong huyêt thanh chuột gây ngộ độc
gan bằng C C I4 được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cao HVTl lên nồng độ bilirubin.
TT

Lô

n

Nồng độ bilirubin
(^mol/1)

1
2

Chứng sinh lý
Chímg bệnh lý

10
12

19,01 ±3,30
26,62 ± 7,55

3

Sylimarin

11

19,22 ±3,84

<0,01

12

21,27 ±3,43

<0,05

12

21,17 ±2,88

<0,05

4

5

HVTl
(5g/kgTT)
HVTl
(lOg/kgTT)

p so vói

p so vói

p so vói

(2)

(3)

(4)

% giảm
so vói lô
(2)

27,80
>0,05

20,10
>0,05

20,45

Kêt quả định lưọTig MDA trong dịch đông thê gan chuột gây độc gan băng
CCI4 được trình bày ừong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tác dụng chống oxy hóa in vivo
% giảm so vói lô
(2)

p so vói (2)

10
12
11

Nông độ MDA
(nmoI/lOOmg gan)
27,04 ±5,41
52,56 ± 12,42
37,98 ± 8,73

41,33

<0,01

12

49,45 ± 9,89

5,90

>0,05

12

47,09 ± 10,07

10,40

>0,05

TT

Lô

n

1
2
3
4

Chứng sinh lý
Chứng bệnh lý
Sylimarin
HVTl
(5g/kgTT)
HVTl
(lOg/kgTT)

5

Bàn luận
vể thành phần hóa học
Kết quả định tính thành phần hóa học cho thấy trong hạt vải có chứa nhiều
nhóm chất như flavonoid, tanin, saponin, cumarin, acid béo... Trong đó có các
hợp chất polyphenol. Đây là những họp chất được biết có tính chống oxy hoá
mạnh. Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của hạt vải cho thấy phân đoạn ethyl
acetat có tác dụng mạnh nhất. Do vậy, để nghiên cứu kỹ hơn về thành phần hóa
học và tác dụng sinh học của hạt vải, chúng tôi đã tiến hành chiết xuất và phân
lập chất trong phân đoạn này và thu được 2 chất MSI và MS2. Trong đó đã xác
định được cấu trúc MSI là acid protocatechuic. Hai hợp chất này lần đầu tiên
được phân lập lần từ dược liệu hạt vải Việt Nam.
Acid protocatechuic là một axit phenolic phân bố rộng rãi trong thực vật.
Acid protocatechuic được coi là một thành phần có tác dụng của một số loại
thuốc thảo dược truyền thống ở Trung Quốc như Cibotium barometz (L.) J.Sm,
Stenoloma chusanum (L.) Ching, Ilex Sims chinensis... Các kết quả nghiên cứu
đã công bố cho thấy, trên động vật acid protocatechuic có hiệu quả trong ức chế
các tác nhân gây ung thư như diethylnitrosamine (ung thư gan), azoxymethane
(ung thư ruột kết), amin N-nitrosobis (2-oxopropyl) (ung thư tuyến tụy) và Nmethyl-N-nitrosourea (ung thư dạ dày). Trong các nghiên cứu in vitro, acid
protocatechuic có khả năng bắt giữ tế bào, tiêu diệt tế bào thông qua nhiều con
đường làm kích hoạt protein kinase (MAPK) sau đó kích hoạt ty thể qua trung
gian caspase trong ung thư dạ dày người và các tế bào khối u khác của cơ quan
tiêu hóa [4].
Ngoài ra, PCA được nhiều công trình nghiên cứu báo cáo là có rất nhiều
tác dụng dược lý khác, có thể liên quan chặt chẽ với khả năng chống oxy hóa.
Chất này đã được báo cáo có tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do các tác
nhân hóa học gây ra trong cơ thể.
Chất MS2 đã được xác định là hỗn họp của 2 đồng phân procyanidin Al
và procyanidin A2. Procyanidin là một ílavonoid có mặt phổ biến trong các loại
trái cây, hạt, lá, hoa và vỏ của nhiều loài thực vật. Họp chất này có nhiều hoạt

tính sinh học và tác dụng dược lý liên quan đến khả năng loại bỏ các gốc tự do,
chẳng hạn như kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, chức năng chống dị ứng
và giãn mạch, cũng như ức chế sự peroxy hóa lipid, chống kết tập tiểu cầu và làm
tăng tính thấm mao mạch, điều chỉnh hoạt động của hệ thống enzym, bao gồm
cyclo-oxygenase và lipo-oxygenase [5].


về tác dụng sinh học
Hạt vải thể hiện tác dụng chống oxy hóa mạnh trên in vitro với thử nghiệm
dọn gốc tự do DPPH. Kết quả này phù họp với các nghiên cứu đã được công bố
trên thế giới.
Nghiên cửu tác dụng chống oxy hóa ừên in vivo của hạt vải thông qua việc
định lượng MDA trong gan chuột với 2 liều thử HV5 và HVIO đều làm giảm sự
tăng của MDA tuy nhiên kết quả không có ý nghĩa thống kê (p>0,05), do vậy để
khẳng định được tác dụng bảo vệ gan có liên quan đến khả năng chống oxy hóa
hay không, cần tiến hành thêm các nghiên cứu khác.
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây viêm gan cấp bằng
carbon tetraclorid thông qua việc định lượng AST và ALT và bilirubin trong máu
đã thu được: Khi dùng liều 5 g dược liệu/kg đă làm giảm hoạt độ của enzym ALT
tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nhưng khi tăng liều lên gấp 2
lần thì ALT giảm mạnh, đồng thời hoạt độ AST cũng giảm mạnh hơn, có ý nghĩa
thống kê. Chứng tỏ tác dụng bảo vệ gan của hạt vải phụ thuộc vào liều sử dụng.
Kết luận và kiến nghị
Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học
của hạt vải, rút ra một số kết luận sau:
- về thành phần hóa học: Trong hạt vải có một số nhóm chất: ílavonoid,
coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất
béo, sterol, caroten, acid hữu cơ. Hàm lượng chất tan trong nước của hạt vải là
1,50%, trong n-hexan là 0,70%, trong n-butanol là 0,63% và trong ethyl acetat là

0,27%. Từ hạt vải đã chiết tách và phân lập được 1 chất tinh khiết là acid
procatechuic và hỗn hợp 2 chất đã xác định được cấu trúc là procyanidin AI và
procyanidin A2.
- về tác dụng sinh học: hạt vải có tác dụng chống oxy trên in vitro qua thử
nghiệm dọn gốc tự do DPPH với IC50 lần lượt là 36,994 /ig/ml (cao ethanol
50%); 50,824 /xg/ml (cao ethanol 80%); 47,4 /ig/ml (cao n-butanol) và 26,874
jLig/ml (cao ethyl acetat). Cao chiết ethanol 50% hạt vải liều tương đương 10 g
dược liệu/kg thể trọng chuột nhắt có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc
gan cấp bằng C C I4 thông qua giảm rõ rệt hoạt độ enzyme AST, ALT và nồng độ
bilirubin trong huyết thanh.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu, phân lập hoạt chất từ hạt vải và tiếp tục nghiên cứu
tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan trên nhiều mô hình khác nhau để làm cơ sở
cho việc đưa dược liệu hạt vải sử dụng trong y học.


Tài liệu tham khảo
1. Balahoroglu R., Dulger H., Ozbek H. (2008), Protective effects of antioxidants
on the experimental liver and kidney toxicity in mice, European Journal o f
General Medicine, 5 (3), pp. 157-164.
2. c.p. Khare (2008), Indian Medicinal Plants: An Illustrated Dictionary,
Springer, pp. 379.
3. Debasis Bagchi, Manashi Bagchi, Sidney J. Stohs, Dipak K. Das, Sidhartha D.
Ray, Charles A. Kuszynski, Shantaram s. Joshi, Harry G. Pruess (2000), Free
radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health
and disease prevention, Toxicology, 148, pp. 187-197.
4. F. Shahidi, M. Naczk (2004), Phenolics in food and nutraceuticals, Press,
Boca Raton, pp. 403.
5. M.T. Mitjavila, J.J. Moreno (2012), The effects of polyphenols on oxidative
stress and the arachidonic acid cascade, implications for the

prevention/treatment of high prevalence diseases, Biochemical Pharmacology,
84, pp. 1113-1122.
6. Philip Molyneux (2004), The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidantactivity, Songklanakarin Journal
o f Science Technology, 26 (2), pp. 211-219.
7. Turner R.A (1965), Screening methods in pharmacology, Test for hematocity,
l,pp. 299-300.
8. Wasowich w , Neve J, Peretz A. (1993), optimized steps in fluorometric
determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum importance
of extraction pH and influence of sample preservation and storage, Clin Chem,
39, pp. 2522-2526.
9. Xu X, Xie H, Wang Y, Wei X (2010), A-type proanthocyanidins from lychee
seeds and their antioxidant and antiviral activities, Journal o f Agric Food
Chem, 58(22), pp. 1667-72.