Xây dựng phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương chó bằng UPLC MS MS

phase and lipid rafts in model and biological membranes", Curr. Opin. Colloid Interface So'., 8(6), p. 459-468.
4. Morand K, Bartoletti AC, Bochot A, Barratt G, Brandely ML, Chast F (2007), Liposomal amphotericin B eye drops to treat fungal keratitis:
physico-chemical and formulation stability, Int. J. Pharm., 344(1-2), p. 150-153.
5. Richard T. Proffit, Jill Adler-Moore,Su-Ming Chiang (1999), Amphotericin B liposome preparation, patent USA.
5. Rojanapanthu Pleumchitt, Sarisuta Narong ,Chaturon Korakot (2003), "Physicochemical properties of amphotericin B liposomes
prepared by reverse-phase evaporation method", Drug Dev.Ind.Pàm., 29(1), p. 31-37.
7. Singodia D, Verma A, Khare P, Dube A, Mitra K, Mishra PR (2012), Investigations on feasibility of in situ development of amphotericin
B liposomes for industrial applications,! Liposome Res., 22(1), p. 8-17.
8. Thomas L. Leimke, David A. Williams, Victotia F. Roche and S. William Zito (2013), Foye's principle of medicinal chemistry, Wolter
Kluver/Lippincot William & Wilkins, 7th edition, p. 1469.
9. Torchilin Vladimir, Weissig Volkmar (2003), Liposomes: A practical approach, OUP Oxford, p. 27-4.

Xây dựng phương pháp định lượng
Loratadin và Pseudoephedrin trong
huyết tương chó bằng UPLC-MS/MS
Đinh Thị Hải Bình', Nguyễn Thị Kim Oanh^ Nguyễn Thanh HảP, Trịnh Văn Lẩu''
Lê Thị Quế^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^

'Trường Cao đãng Dược Hỏi Dương, ^KhoaDược, Trường Đợi học Y Thái Bình,
^Khoa YDược, Đọi học Quốcgia Hà Nội, ^Hội đổng Dược điển Việt Ham,
^Trường Đại học Dược HàMội
SUMMARY
An UPLC-M5/MS method was developed and validated for the determination o f loratadine and pseudoephedrine sufate in dog
plasma. The chromatographic cor)ditions are as follows: column: Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3.0 mm; 2.1 ụm); mobile phase:
acetonitrile -0.05% formic acid (70:30 v/vj; flow rate o f200 ụl/min; injection volume o f 25 ụl; internal standard is domperidone;positive
electrospray ionization; detection: MS/MS with m/z o f259.17; n 7.06 and 175.08 for loratadine, pseudoephedrine and domperidone,
respectively. Loratadine and pseudoephedrine were extracted from plasma samples with a mixture o f diethyl ether - chloroform (8:2
v/v). It was proved that the method was stable, accurate, precise, very sensitive and suitable for determination o f loratadine and
pseudoephedrine in plasma sample.
Từkhoá: Loratadin, pseudoephedrin, UPLC-MS/MS, huyết tương.

Đặt vấn đề

Loratadin (LOR) là một thuốc kháng histamin thế
hệ II có tác dụng làm giảm triệu chứng của viêm mũi
dị ứng do giải phóng histamin, có thời gian bán thải
dài. Pseudoephedrin (PSE) là một chất có tác dụng
co mạch làm giảm xung huyết hữu hiệu, thời gian
bán thải ngắn. Việc kết hợp 2 chất này trong một
chê' phẩm tạo nên tác dụng chữa viêm mũi dị ứng

rất hiệu quả [1], đặc biệt khi bào chế dưới dạng viên
phóng thích có kiểm soát thì hiệu quả điểu trị tăng rõ
rệt. Trong nghiên cứu phát triển dạng sản phẩm viên
bao phóng thích có kiểm soát chứa hai dược chất
này, bên cạnh đánh giá tương đương bào chế (giải
phóng hoạt chất in vitro) thì việc đánh giá sinh khả
dụng in vivo trên cơ thể sống của chế phẩm nghiên
cứu so với chế phẩm đối chiếu là rất cắn thiết, trong
đó bước căn bản là đánh giá nống độ thuốc trong


dịch sinh học. Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu
định lượng PSE và LOR trong huyết tương [3],[4],[5],
[6] được công bố, nhưng ở Việt Nam chưa có công
bổ nào được đăng tải.
Bài báo này trình bày kết quả xây dựng phương
pháp định lượng đồng thời LOR và PSE trong huyết
tương bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết nối
với khối phổ (UPLC-MS/MS), phương pháp này có
khả năng ứng dụng đánh giá sinh khả dụng của chế

phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa hai thành
phần LOR và PSE trên động vật (chó).
Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Hóa chất, động vật thí nghiệm
- Chất chuẩn: Loratadin hàm lượng 99,24%, độ
ẩm 0,02%; Pseudoephedrin hydroclorid hàm lượng
100%, độ ẩm 0,01%; Domperidol hàm lượng 99,44%
tính theo nguyên trạng do Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ương cung cấp.
- Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho
HPLC hoặc PA (Merck - Đức).
- Huyết tương trắng: được lấy từ chó khỏe mạnh
chưa dùng thuốc.
- Động vật thí nghiệm: Chó đực, khỏe mạnh, 10
± 0,5 kg.
- Mẫu thử: là huyết tương chó sau khi uống viên
nén Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough), số
lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014,
hàm lượng ghi nhãn Pseudoephedrin Sulfat 120 mg
và Loratadin 5 mg.
Thiết bị
-Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters XevoTQD
- Waters (Mỹ);
- Các thiết bị và dụng cụ khác: cân phân tích
Sartorius CP224S (d=0,1 mg), Đức. Máy ly tâm lạnh
Sartorius sigma 2 - 16 K, Đức. Máy lắc xoáy Vortex
ZX3 VELP - 236, Ý. Tủ lạnh sâu MDF -192, Đức. Tất cả
các thiết bị dụng cụ đểu được chuẩn hóa theo quỵ
định ISO/ lEC 17025 năm 2005.

Phương pháp nghiên cứu
- Các dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một
lượng chất chuẩn hòa tan trong một thể tích chính
xác methanol để được dung dịch chuẩn gốc LOR,
PSE có nồng độ chính xác khoảng 250 ụg/mL (Các

dung dịch gốc được pha riêng). Từ các dung dịch
chuẩn gốc này pha loãng trong MeOH thành các
nồng độ thích hợp sao cho khi thêm huyết tương
trắng vào ta thu được mẫu huyết tương chứa đổng
thời LOR và PSE có nổng độ từ 0,2/10 và 50/2500 ng/
ml (LOR/PSE).
- Dung dịch chuẩn nội (IS): cân chính xác một
lượng domperidon, hòa tan trong một thể tích chính
xác methanol để được dung dịch có nồng độ chính
xác khoảng 250 ụg/ml. Sau đó pha loãng trong
MeOH đến nồng độ khoảng 125 |jg/ml.
- Sử dụng các phương pháp kết tủa protein và
chiết lỏng - lỏng trong xử lý mẫu để chiết tách LOR
và PSE trong mẫu huyết tương.
- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu
năng cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS) trong
định lượng LOR và PSE trong huyết tương. Điều kiện
khối phổ và sắr ký được lựa chọn sau khi thực hiện:
tối ưu hóa điều kiện khối phổ, khảo sát các loại cột
tách khác nhau, các loại pha động có thành phần, tỉ
lệ khác nhau.
- Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích
theo hướng dẫn của FDA các chỉ tiêu: tính chọn lọcđặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ
chính xác, giới hạn định lượng dưới, độ ổn định.

- Xác định nổng độ PSE và LOR trong huyết tương
của chó sau khi uống chế phẩm viên phóng thích có
kiểm soát chứa loratadin 5 mg và pseudoephedrin
120 mg. Tính kết quả dựa vào đường chuẩn được
xây dựng trong cùng ngày phân tích với hệ số tương

quan r > 0,99.
Kết quả nghiên cứu

Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích
Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Pha dung dịch chuẩn LOR và PSE với nồng độ 1
ng/mL trong MeOH. Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ
thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa cùng với
dòng pha động. Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ
một lẩn và quét toàn phổ để tìm ion có cường độ
tín hiệu cao nhất, tươnq ứng với ion mẹ của chất
phân tích từ đó xác địni I được m ảnh ion m ẹ với giá

trị m/z của LOR, PSE và IS lần lượt là 383,17; 166,04
và 426,17.


Sau khi xác định được ion mẹ, tiến hành điểu
chỉnh để tối ưu điểu kiện nguồn ion hóa với hai
thông số là hiệu điện thế mao quản và hiệu điện thế
cone để cường độ ion mẹ lớn và ổn định nhất. Kết
quả đã lựa chọn được giá trị tối ưu với hiệu điện thế
mao quản là 4,0 KV; Hiệu điện thế cone lẩn lưcrt là
46V; 20 V và 54 V với LOR, PSE và IS.

Việc xác định nồng độ LOR và PSE được tiến hành
dựa trên các mảnh con. Kết quả với PSE, ở mức thế
phân mảnh 18 V cho mảnh ion con m/z có giá trị
117,06 cho cường độ tín hiệu lớn và ổn định nhất, với
LOR giá trị này là 28 V tương ứng ion con m/z bằng
259,17 và với IS là 28 V, ion con m/z bằng 175,08.
Khảo sát chương trình sắc ký
Sử dụng các cột sắc ký có pha tĩnh là C18 của các
hãng khác nhau, qui cách khác nhau như cột Themo
Hypersil GOLD C18 (50 mm X 2,1 mm; 1,9 |jm),
octadecylsilan Acquity UPLC- BEH C18 (50 X 2,1 m m ;
1,7 |jm) và Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3,0 mm; 2,1
um), ba hệ dung môi pha động là acetonitril: dung
dịch amoni acetat 10 mM (50:50), acetonitril; dung
dịch acid acetic 0,1% (80:20), acetonitril: dung dịch
acid formic 0,05% (70:30), ba mức lưu lượng dòng
pha động (200, 400 và 500 |jl/phút) và ba mức thể
tích tiêm mẫu (5,10 và 20 fil).
Kết quả khi phân tích trên cột Themo Hypersil
GOLD C18 các pic tách khỏi nhau tốt nhưng chưa đạt

độ phân giải đường nền, đối với cột Acquity UPLCBEH C18 các pic xuất hiện sớm nhưng không ổn
định. Khi phân tích trên cột Shimpark UPLC C18 các
pic LOR, PSE và IS cho đáp ứng tương đối tốt, hình
dáng pic cân đối, thời gian lưu ngán.
Khảo sát với 3 hệ pha động cho thấy, hệ pha
động gổm acetonitril: dung dịch acid formic 0,05%
cho các pic LOR, PSE và IS có hình dạng khá cân đối,
đáp ứng pic giữa các lần sắc ký ổn định hơn hẳn so
với khi phân tích với hai hệ pha động còn lại. Tốc độ

dòng pha động là 200 nl/phút và thể tích tiêm mẫu
10 nl là hợp lý cho phép phân tích với thời gian lưu
khá ngắn (khoảng 3 phút), hình dạng pic cân đối,
đáp ứng pic đảm bảo yêu cầu định lượng.
Từ kết quả khảo sát, điểu kiện phân tích được
lựa chọn là: cột sắc ký Shimpark UPLC C18 (50 mm
X 3,0 mm; 2,1 |am); nhiệt độ cột 30°C; pha động
acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (70:30); lưu

lượng dòng 200 Ịjl/phút; thể tích tiêm mẫu 10 |al.
Kiểu khối phổ MS/MS, ion mẹ/ ion con của LOR, PSE
và IS có m/z lắn lượt là 383,17/259,17; 166,04/117,06
và 426,17/175,08.
Khảo sát phương pháp xử lý mâu
Chuẩn bị các mẫu huyết tương tựtạo chứa chuẩn
LOR, PSE và IS nồng độ lẩn lượt là 50 ng/mL, 500 ng/
mL và 200 ng/mL. Tiến hành xử lý mẫu bằng cách
tủa protein hoặc chiết lỏng - lỏng.
Khi dùng tác nhân gây tủa protein khác nhau như
acid percloric, acid tricloacetic, acid trifluoroacetic
hoặc dung môi hữu cơ methanol, acetonitril. Kết
quả là cường độ tín hiệu thu được của mẫu không
ổn định, pic của LOR bị doãng, chưa đạt độ phân giải
đường nền. Tiếp tục khảo sát cách dùng acetonitril
tủa protein, sau đó chiết bằng dicloromethan, kết
quả cho thấy thời gian xử lý mẫu kéo dài do quá trình
trải qua hai bước và thời gian bay hơi dicloromethan
tương đối lâu, không phù hợp với việc phân tích
nhiều mẫu trong cùng ngày.
Với phương pháp chiết lỏng - lỏng dùng hỗn hợp

dung môi diethyl ether: cloroform (8:2), kết quả cho
thấy hệ dung môi này khắc phục được nhược điểm
khi chiết bằng một dung môi riêng rẽ (với cloroform
thường dễ tạo nhũ tương bể mặt phân cách, nằm
ở lớp dưới gây khó khăn khi tách lấy dung môi, với
diethyl ether cho tỷ lệ thu hồi thấp). Khảo sát lượng
dung môi sử dụng, thời gian lắc, kiềm hoá hoặc
không kiểm hoá mẫu thử,... từ đó xác định được quy
trình xử lý mẫu như sau: lấy 1 ml huyết tương, thêm
100 ụl dung dịch IS, lắc xoáy 30 giây. Thêm 0,5 ml
dung dịch amoniac 0,1 M, lắc xoáy 30 giây. Thêm 5
ml hỗn hợp diethyl ether: cloroform (8:2). Lắc xoáy
10 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy
3,5 ml dung môi hữu cơ ở lớp trên, cô dưới dòng khí
nitơ ở 40°c tới cắn. Hòa tan cắn trong 1,00 ml pha
động và tiêm sắc ký.
Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng
dẫn của US- FDA [7],
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá
dựa vào so sánh thời gian lưu, các pic của chất phân
tích và IS phải được nhận diện rõ ràng và có hình
dạng cân đối. Đáp ứng pic của mẫu trắng so với mẫu
chuẩn (mẫu LLOQ) tại thời gian lưu của chất phân


- ề .
tích không quá 20%, tại thời gian lưu của IS không quá 5%.
Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp được xác định dựa trên mối tương quan hổi quy giữa nồng
độ LOR, PSE và tỷ lệ giữa diện tích pic của LOR, PSE và chuẩn nội.

Độ đúng và độ chính xác của phương pháp được thực hiện ở 3 mức nồng độ LQC, MQC và HQC, mỗi mức
nồng độ tiến hành 6 lán song song. Nổng độ ứng với các mức LQC, MQC và HQC của LOR/ PSE lẩn lượt là
0,6/30 ng/ml, 25/1250 ng/ml, 40/2000 ng/ ml.
Giới hạn định lượng của phương pháp dựa vào pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, hình dạng
cân đối và có đáp ứng ít nhất bằng 5 lẩn đáp ứng của mẫu trắng tại thời gian lưu của chất phân tích, độ đúng
nằm trong khoảng 80 -120% so với nồng độ thực và độ chính xác có RSD không quá 20%.
Kết quả được trình bày ở hìnhl và bảng 1.
LQC01

.

0.20

0.40

0.60

0.80

11»

1.20

1,40

1,60

1,80

2.1X1

LQC01
100

2.20

2.40

M RM oí3ChannelsES+
426.17 > 175-08 (D om f«ttin )

2,60

I
go
100

0.06 0^1

3.00
3,20
M RM o(3ChannelíES+
m i7 > 2 S 9 .1 7 (L o ra la « w )
4.41e3

02 0

2.80

2.18

Ab

Ba

MRMof3ChannetsẼS^
426.17 > 175.06 (Oomperidon)

099 MO

2-
D.40

0.60

0.80

1,00 ' 1.20

1.40

M
RM
orSCTHVHÌsES^
383.17 > 259.17{LoratadinB)

ICO
Bb

___ -lẽ.
Ũ.2Ũ

0.40

0.60

0.80

1.00

lio

3.10 3 i3

1.40

1,60

1.00

2.00

2 Ì0

140

2.60

2.80

LQC01

3.Ũ0

0^

3.20

Ữ4Ũ

0.60

OÌO

1.00

l iO

140

1.60

1.60

2.00

2^

2.40

2.60

MRMdaCtmekES*

nm

11W

I? f i

un

Ifiíi

im

ĩCfi

?7fi

?4fi

3.00

3 i0

N 6 .M > 117.06 (P H u d C M p M n )

133

Ac

2.60

■í

'

255

2.75 213 ị ; *

V
Bc

ĩÁ n

aón

IM

3 jf i

1,20

1,40

1,60

1.80

2 00

2.ffl

24 0

2.60

2 00

3 .w

3,20

A
Hình 1. Sâckỷđỗ A) mâu huỵểt tươnq chứũ lOR, PSE và IS:Aơ: IS: AblOR:Ac:PSE: Bj màu huỵỗ tương tráng Ba: /5; B b M ; BcPSE.
Báng l Tóm tát két quà thẳm định phương pĩháp
Chỉ tiêu

Giới han chẩsnhân

LOR

PSE

r t i a i M l h l độ tuyến tính

0 ,2 -1 0 n g /m l

1 0-2500n g /m l

P h N h g trình hói quy

y = 0 ,0 0 4 4 x -0,0261

y = 0,0164x + 0,0065

r = 0,9983

r = 0,9995

0,2 ng/ml

lO ng/m l

91,13% a-113,33% b
103,53%C

9 4 ,2 7 % a-1 1 4 ,2 % b
102,3%c

97,57% a-113,54% b
107,6%c

90,18% a-112,95% b
99,11%c

8 6 ,7 4 % a - m ,6 7 % b

102,06%c

85,36% a-100,63% b
92,62%c

6,47%

6,24%

Độ tuyến
tính

Hê số tương quan
Giới hạn
đ ịn h l^

r > 0,998

Đáp ứng pic mẫu LLOQ/ mẫu trắng > 5
LQC

Độ đúng

MQC

8 5 -1 1 5 %

HQC
LQC
Độ chính

xác

MQC

RS0< 15%

HQC
LQC
Tỉ lệ thu
hổi

MQC
HQC

3 0 -1 1 0 %
(RSD < 15%)

5,03%

5,83%

8,52%

4,83%

90,93% (RSD = 9 ,5 % )

40,67% (RSD = 8,6% )

84,18% (RSD = 9,9% )

51,23% (RSD = 8,8% )

93,28% (RSD = 4,6% )

53,42% (RSD = 2,7% )

‘giá trị nhỏ nhót, ‘’giá trị l ề nhát, ‘giá trị trung bình.

Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trong điểu kiện bảo quản ở nhiệt độ -40°c, mẫu thử đựng trong ống
nghiệm thủy tinh nút xoáy, sau 15 ngày và ở bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ. Xác định lượng chất phân tích
giảm đi sau thời gian bảo quản so với lượng chất phân tích trong mẫu mới chuẩn bị. Tiến hành ở 2 mức nổng độ
là LQC và HQC của LOR/ PSE lẩn lượt là 0,6/30 ng/ml và 40/2000 ng/ ml. Kết quả được trình bày ở bi ng 2.

1.60


BÀI NGHIÊN CỨU
Báng 2. Két quờ khảo sát độ ồn định cùa mâu (n = 6)
chát
phân
tích

M ẫu đểở n h iêtđ ô
phòng sau 6 giờ

LOR

M ẫuđểở-40"Csau
15 ngày

LOR
PSE

Điểu kiện bảo quản

Mẫu HQC

Mẫu LQC

% giảm
so với ban
đáu

Nóng độ ban
đáu (ng/ml)

Nống độ sau
bảo quản
(ng/ml)

% giảm
so với ban
đáu

RSD
(% )

Nóng độ ban
đáu (ng/ml)

Nóng độ sau
bảo quản
(ng/ml)

0,63

0,61

3,17

4,9

41,36

40,13

2,97

3,2

1885,5

4,40

5.5

PSE

29,6

1972,4

RSD
(% )

28,09

5,10

3,5

0,63

0,57

9,52

6,5

41,36

39,52

4,45

6,4

28,81

28,56

0,87

2,1

1972,4

1919,5

2,68

1,9

Kết quả ở bảng 1, 2 và hình 1 cho thấy phương
pháp có tính chọn lọc cao với LOR và PSE với giá
trị m/z của ion mẹ/ion mảnh đổi với LOR, PSE
và IS lẩn lượt là 383,17/259,17; 166,04/117,06 và
426,17/175,08. Khoảng nống độ tuyến tính xây
dựng khá rộng với hệ số tương quan đạt yêu cẩu của
LOR 0,2 - 50 ng/ml (r - 0,9983), PSE 10 - 2550 ng/ml
(r = 0,9995), dự đoán sẽ bao phủ toàn bộ nổng độ mẫu
huyết tương trong nghiên cứu sinh khả dụng. Giới hạn
định lượng dưới nhỏ với LOR và PSE lẩn lượt là 0,2 ng/
ml và 10 ng/ml, độ đúng cao với LOR đạt từ 102,06%
-107,60%, với PSE: 92,62% đến 102,30%, độ chính xác
tốt với giá trị RSD của LOR dưới 10% và của PSE dưới
6%. Tỷ lệ thu hồi hoạt chất ở cả ba khoảng nồng độ đạt
yêu cau và ổn định: IS (DOM): xấp xỉ 97%, LOR: 93% và
PSE 53%. Hoạt chất ổn định trong các điểu kiện bảo

quản 6 giờ ở nhiệt độ phòng và sau 15 ngày ở -40°c.
Các kết quả thẩm định đều đạt theo yêu cẩu của FDA.
Bước đầu ứng dụng định lượng Loratadin và
Pseudoephedrin trên mẫu thực
Cho chó uống 1 viên Clarinase repertabs với 50
ml nước. Lấy 3,0 ml máu ở tĩnh mạch cổ vào ống
chống đông chứa heparin tại các thời điểm trước khi
uống thuốc, sau khi uống thuốc 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4;
7; 9; 11; 24; 30; 35; 48 giờ. Lắc nhẹ. Ly tâm 3000 vòng/
phút trong 10 phút, lấy huyết tương và bảo quản ở
-40°c tới khi phân tích.
Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký theo phương pháp
đã xây dựng. Dựa vào đường chuẩn xây dựng trong
cùng ngày phân tích (với r > 0,99) tính nồng độ LOR
và PSE trong mẫu thực. Kết quệ'được trình bày ở
hình 2 và bảng 3.
pseud o ep h ed rin
2500

60
th òi gian (giờ)

Bòng ỉ. Một sỗ thông số DĐHtrên chó của LOR và PSE
A U C „_.

Thông số

c „ (n g / m l)

U ( g ìờ )

AUC„.«
{ng/ml*giờ)

AUCo,
(ng/ml*giờ)

LOR

28,68

2,5

184,43

189,68

97,2

6,3

PSE

2148,90

4

12053,61

12115,90

99,5

3,9

1 A Ư C (|_„ J

ĩ,„ ( g iờ )


Bàn luận

LC-MS/MS dùng định lượng thuốc trong dịch
sinh học đã nâng cao được tính chọn lọc, độ nhạy
của phương pháp phân tích. Kết quả định lượng vẫn
đảm bảo độ đúng ngay cả khi pic chất phân tích chưa
tách hoàn toàn khỏi pic khác do giá trị đáp ứng của
pic chất phân tích ứng với tỉ số m/z riêng của chất đó
chứ không chung một điểu kiện như khi phát hiện
bằng detector thông thường khác. Giới hạn định
lượng nhỏ (0,2 ng/ml với LOR và 10 ng/ml với PSE)
rất phù hợp khi xây dựng đường cong nống độ - thời
gian trong đánh giá sinh khả dụng của thuốc. Việc
kết nối UPLC và MS/MS giúp cho giảm thiểu thời
gian phân tích mẫu chỉ còn 2,2 phút (giảm khoảng
7 lẩn) so khoảng 15 phút khi sử dụng HPLC - MS/MS
nên sẽ tiêu tổn ít dung môi, đỡ ô nhiễm môi trường
và kinh tế hơn.
Xử lý mẫu bằng cách chiết lỏng - lỏng với hỗn

hợp dung môi diethyl ether: cloroform (8:2) sau khi
đã kiểm hóa huyết tương bằng dung dịch amoniac
0,1 M cho hiệu suất chiết cao, ổn định (DOM: 97%,
LOR: 93% và PSE 53%) so với nghiên cứu [3] dung
môi chiết là ethyl ether, khôny có quá trình kiềm hóa
chuyển hoạt chất về dạng trung tính nên hiệu suất
chiết thấp hơn (LOR: 63% và PSE 40%).
Việc sử dụng một chất chuẩn nội domperidon
trong phân tích đống thời LOR và PSE đã giúp
đơn giản hóa quy trình phân tích hơn so với
nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc sử
dụng hai chất chuẩn nội là diazepam cho LOR và
phenylpropanolamin cho PSE [6].
Kết quả phân tích LOR và PSE trong 14 mẫu thực

sau khi cho chó uống viên phóng thích có kiểm soát
chứa loratadin 5 mg và pseudoephedrin Sulfat 120
mg trong vòng 48 giờ đã chứng minh được sự phù
hợp của phương pháp đã xây dựng. Nồng độ trong
huyết tương của LOR nằm trong khoảng 0,2 ng/ml 28,7 ng/ml và PSE 10 ng/ml - 2148,9 ng/ml đểu nằm
trong khoảng nồng độ tuyến tính đá khảo sát. Thời
gian bán thải dài với LOR là 6,3 giờ và PSE là 3,9 giờ
nên thời gian lấy mẫu trong vòng 48 giờ phù hợp
cho nghiên cứu, điểu đó có thể được minh chứng
bằng giá trị AUC(^^g/AUC|^ đểu lớn hơn 97% đối với
cả hai chất.
Mặc dù tỉ lệ thành phần trong viên PSE/LOR là
24 (120/5) nhưng tỉ lệ nồng độ trong huyết tương là
74 (2148,9/28,68) là vì viên nén Clarinase Repertab
chứa hai thành phẩn LOR hàm lượng 5 mg và PSE

120 mg, trong đó LOR và Vi lượng PSE (60 mg) thiết
kế giải phóng bình thường, còn '/2 lượng PSE được
thiết kế giải phóng kéo dài nên nghiên cứu trên vẫn
có ý nghĩa vể mặt dược động học.
Kết luận

Đã xây dựng được phương pháp định lượng
loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương chó
bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết nối với khối
phổ (UPLC-MS/MS) có độ chính xác cao, độ đúng tốt,
khoảng tuyến tính khá rộng, tính chọn lọc cao, thời
gian phân tích khá nhanh với quy trình xử lý mẫu
đơn giản. Kết quả nghiên cứu này rất khả thi để ứng
dụng định lượng hai dược chất LOR và PSE trong
huyết tương chó sau khi uống chế phẩm viên phóng
thích có kiểm soát chứa hai thành phẩn này.

TÀI LIỆU THAM KHÀO
1. Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia ViêtNam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 2130 - 2136.
2. Ge QH, Zhou z, Zhi XJ, etal.(2007), "Simutaneous determination of pseudoephedrin and chlorpheniramine in human plasma by HPLCu v detection methods", Journal ofAOACInternational, Volume 93, Number 3, May 2010, pp.891 - 903.
3. Jianguo Sun, Guạngi Wang, Wei Wang, Shuai Zhao, Yi Gu, Jinwen Zhang, Mingwen Huang, Fen Shao, Hao Li, Qi Zhang, Haitang Xie (2005),
"Simultaneous determination of loratadine and pseudoephedrine sulfat in human plasma by liquid chromatography - electrospray mass
spectrometry for pharmacokinetic stud\es", Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis,wiume 39, pp 217 - 224.
4. Laurian Vlase, Silvia Imre, Dana Muntean, Sorin E. Leucuta (2007), "Determination of loratadin and its active metabolite in human
plasma by high - performance liquid chromatography with mass spectrometry detection", Journal o f Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, Volume 44, Issue 3,27 July 2007, pp.652- 657.
5. Macek J.et al (2002), "Rapid determination of pseudoephedrin in human plasma by high - performance liquid chromatography",


Journal o f Chromatography B, 766, pp.289- 294.

6. F.Zeeshan, (2008), "Simultaneous Determination of Loratadine and Pseudoephedrine Using High Performance Liquid Chromatography
Method", 22"'' MSPP scientific meeting 2008, Oral 48.
7. U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evalution and Research (2001),
Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation.

Chiết tách Enzym Protease ngoại bào từ
Bacillus subtììỉs natto
Đàm Thanh Xuân, Đinh Thị Thanh Thảo, Đinh Thu Hương, Lê Ngọc Khánh

Trường Đại học Dược Hà Nội

SUMMARY
Study on extracellular protease enzyme extractiori from the cultured medium o f Bacillus subtilis natto. Results show that 60%
ammonium sulfate saturation concentration is the optimal concentration to precipitate enzyme with highest activity o f proteose
(172.54 nKat) arid also prevent the present o f other enzymes in the B. subtilis nano culture medium (amylase and cellulose).
Electrophoresis results o f some segments obtained after purified with column chromatography and gel filtration through Sephadex
G - 75 showed that the highest protease activity segment might contain nattokinase enzyme with a molecular weight in the range o f
27-28 KDa and also capable o f fibrinolytic action.
Từ khóa: Bacillus subtilis natto, enzym ngoại bào, protease.

Đặt vấn đề

Bệnh tim mạch đang trở thành vấn để thời sự
vì sự gia tăng căn bệnh này trong cộng đồng cùng
với sự phát triển của xã hội. Hiện nay, các thuốc
tiêu huyết khối trên thị trường như Urokinase,
Streptokinase, Alteplase,... được sử dụng chủ yếu
trong cấp cứu tai biến, chi phí khá đắt tiền và gây
ra nhiều tác dụng phụ. Nattokinase là một enzym
có khả nàng tiêu huyết khối được lên men nhờ vi

khuẩn Bacillussubtilisnatto [2], Nhiểu nghiên cứu đã
chứng minh khả năng làm giảm lượng fibrinogen
trong huyết tương của Nattokinase. Nghiên cứu
này nhằm mục tiêu tách chiết và tinh chế enzym
protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto, xác
định các tính chất cơ bản của enzym thu được như
trọng lượng phân tử, hoạt tính protease, khả năng

tiêu fibrin... để hướng tới việc chủ động tạo nguồn
nguyên liệu enzym nattokinase bằng phương pháp
lên men sinh học.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cúu

Nguyên liệu
Chủng Bacillus subtilis natto - nguồn gốc Nhật
Bản được nuôi cấy và lưu giữ tại Bộ môn Công
nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Pepton, cao thịt của Merck; Sephadex G75 của
Sigma; casein, tinh bột, thạch, CMC... và các một số
hóa chất cẩn thiết khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
Enzynn nattokinase của Đài Loan (20.000 FU/g).
Thiết bị
Tủ cấy, tủ ấm nuôi vi sinh vật, máy lắc ổn nhiệt,
máy ly tâm...