SÀNG LỌC MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GÂY BỆNH CHO NGƯỜI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
SÀNG LỌC MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT CÓ KHẢ
NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GÂY BỆNH CHO NGƯỜI

CBHD: ThS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
SVTH: TRẦN THỊ CẨM NHUNG
MSSV: 60601709

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011


LỜI CẢM ƠN

Thế là khoảng thời gian đại học đã dần kết thúc, đối với tôi đó là một bước
ngoặt rất lớn, một khởi đầu thực sự với bao lo lắng và hoan hỷ. Khoảng thời gian tôi
gắn bó với giảng đường Đại học suốt bốn năm rưỡi không phải là một thời gian dài để
tôi tự hoàn thiện bản thân mình, cũng không phải là một thời gian ngắn để tôi trau dồi
kiến thức, nhận ra giá trị cuộc sống và học tập được nhiều từ thầy cô, bạn bè, đặc biệt
là tập thể lớp HC06BSH.
Suốt quá trình hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ. Đầu
tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Công nghệ Sinh học- Trường Đại học Bách
Khoa TP HCM đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt bài thực nghiệm của mình.
Ngoài ra, tôi cũng gửi lời tri ân đến quý Thầy, quý Cô trong Bộ môn, đặc biệt là Th.s
Lê Thị Thủy Tiên- người đã trực tiếp hướng dẫn tôi. Bên cạnh đó, tôi cũng xin cám ơn
tất cả các thành viên tại phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 của Bộ môn Công nghệ
sinh học đã đồng hành cùng tôi, cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi
trong quá trình làm việc. Một lần nữa, tôi xin cám ơn gia đình tôi, những người luôn

bên tôi, ủng hộ tôi, động viên tôi trong suốt thời gian qua.


TÓM TẮT

Hợp chất thứ cấp được thực vật sản xuất không ngừng, là nhân tố có vai trò
quan trọng trong hàng rào phòng thủ của thực vật chống lại tác nhân ngoại cảnh, động
vật và vi sinh vật. Một số hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu và kết luận có tính
kháng khuẩn mở ra một bước ngoặt mới trong lĩnh vực nghiên cứu thuốc có nguồn gốc
từ tự nhiên thay thế kháng sinh. Đề tài này được thực hiện nhằm sàng lọc một số loài
thực vật có khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh cho người. Các chủng vi sinh vật sử
dụng gồm 3 chủng Gram dương bao gồm Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRSA
ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 29212; 2 chủng Gram âm gồm E.coli
ATCC 25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Trong hơn 20 loài thực vật
khảo sát chỉ có chất chiết từ Diệp hạ châu có thể ức chế được cả 5 chủng vi khuẩn
bệnh trên. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết thô từ 312,5-2500 mg bột
dược liệu/ml, MIC của dịch chiết alkaloid từ 39,0625-156,25 mg bột dược liệu/ml.


MỤC LỤC

MỤC LỤC...................................................................................................................i
Danh mục chữ viết tắt................................................................................................iv
Danh mục ảnh.............................................................................................................v
Danh mục bảng..........................................................................................................vi
Danh mục hình .........................................................................................................vii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................viii
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................1
1.1 Tính kháng khuẩn của thực vật .............................................................................1
1.1.1 Lịch sử sử dụng ...............................................................................................1

1.1.2 Sử dụng và xu hướng phát triển .......................................................................2
1.2 Các nhóm hợp chất chính có tính kháng khuẩn của thực vật .................................2
1.2.1 Phenolic và polyphenol ...................................................................................2
1.2.2 Terpenoid ........................................................................................................4
1.2.3 Alkaloid ..........................................................................................................7
1.3 Cơ chế tác động lên vi sinh vật..............................................................................9
1.3.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn ............................................................9
1.3.2 Ức chế quá trình chuyển hóa .........................................................................11
1.3.3 Ức chế tổng hợp protein ................................................................................11
1.3.4 Ức chế tổng hợp acid nucleic ........................................................................12
1.4 Các phương pháp chiết tách, định tính, định lượng .............................................13
1.4.1 Phương pháp chiết tách .................................................................................13
1.4.2 Phương pháp định tính và định lượng ............................................................ 13
i


1.4.3 Phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn .......................................................14
1.5 Vi sinh vật dùng trong thí nghiệm ......................................................................16
1.5.1 Staphylococcus aureus ..................................................................................16
1.5.2 MRSA ............................................................................................................17
1.5.3 E.coli ............................................................................................................17
1.5.4 Streptococcus faecalis ...................................................................................18
1.5.5 Pseudomonas aeruginosa ..............................................................................19
1.6 Một số công bố ...................................................................................................19
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ...................................21
2.1 Nguyên vật liệu ..................................................................................................21
2.1.1 Nguyên liệu ...................................................................................................21
2.1.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng .......................................................................24
2.2 Phương pháp ......................................................................................................24
2.2.1 Xử lý nguyên liệu ..........................................................................................24

2.2.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu ..........................................................................24
2.2.3 Phương pháp nhuộm và quan sát vi thể .........................................................24
2.2.4 Chiết hợp chất thứ cấp thô .............................................................................25
2.2.5 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn ....................................................................25
2.2.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu .................................................................26
2.2.7 Tách chiết từng nhóm hợp chất thứ cấp .........................................................26
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................................30
3.1 Xử lý nguyên liệu ............................................................................................... 30
3.2 Chiết hợp chất thứ cấp thô ..................................................................................32
3.3 Vi sinh vật chỉ thị ............................................................................................... 32
ii


3.4 Tính kháng khuẩn của thực vật ...........................................................................33
3.5 Xác định MIC dịch chiết thô cây Diệp hạ châu ...................................................41
3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm hợp chất thứ cấp trong cây Diệp hạ châu .......41
3.6.1 Chiết alkaloid ................................................................................................ 42
3.6.2 Chiết hợp chất phenolic .................................................................................43
3.6.3 Chiết saponin ................................................................................................ 43
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................46
4.1 Kết luận ..............................................................................................................46
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................47
PHỤ LỤC.................................................................................................................50

iii


Danh mục chữ viết tắt

CFU:

Colony-Forming Unit

DNA:

Deoxyribonucleic acid

E.:

Entercoccus

E.coli:

Escherichia coli

fMet:

N-formylMethione

Gry:

Gryrase

MH:

Mueller Hinton

MIC:

Minimum inhibitory concentration

mRNA:

Messenger Ribonucleic acid

MRS:

de Man-Rogosa-Sharpe

MRSA:

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

NA:

Nutrient agar

Ps. :

Pseudomonas

RNA:

Ribonucleic acid

Sta. :

Staphylococcus

Str. :

Streptococcus

tRNA:

Transfer Ribonucleic acid

iv


Danh mục ảnh

Ảnh 1.1: Vòng vô khuẩn ..........................................................................................15
Ảnh 1.2: Hình thái đại thể và vi thể chủng Staphylococcus aureus ...........................17
Ảnh 1.3: Hình thái đại thể và vi thể E.coli ............................................................... 18
Ảnh 1.4: Hình thái đại thể và vi thể Streptococcus faecalis ......................................18
Ảnh 1.5: Hình thái đại thể và vi thể Pseudomonas aeruginosa .................................19
Ảnh 2.1: Nguyên liệu thí nghiệm ..............................................................................23
Ảnh 3.1: Hình dạng vi thề các chủng vi khuẩn .........................................................33
Ảnh 3.2: Tính kháng khuẩn của cây Dừa cạn ...........................................................36
Ảnh 3.3: Tính kháng khuẩn của cây Dâm bụt ...........................................................37
Ảnh 3.4: Tính kháng khuẩn của cây Bù ngót ............................................................ 37
Ảnh 3.5: Tính kháng khuẩn của cây Sống đời ..........................................................38
Ảnh 3.6: Tính kháng khuẩn của cây Bồ công anh Việt Nam ....................................39
Ảnh 3.7: Tính kháng khuẩn của lá Lốt ......................................................................39
Ảnh 3.8: Tính kháng khuẩn của cây Diệp hạ châu ....................................................40
Ảnh 3.9: Định tính alkaloid từ dịch chiết alkaloid cây Diệp hạ châu ........................42
Ảnh 3.10:Định tính hợp chất phenolic và tannin từ dịch chiết phenolic cây Diệp hạ
châu .........................................................................................................................43

Ảnh 3.11: Định tính thành phần saponin trong Diệp hạ châu ....................................43
Ảnh 3.12: Xác định MIC của cắn alkaloid cây Diệp hạ châu ....................................44

v


Danh mục bảng

Bảng 2.1: Nguyên liệu và nơi thu hái .......................................................................21
Bảng 2.2: Định tính alkaloid ....................................................................................27
Bảng 3.1: Kết quả độ ẩm nguyên liệu ......................................................................31
Bảng 3.2: Hình dạng các chủng vi khuẩn dùng trong đề tài ......................................33
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn ...........................................................35
Bảng 3.4: Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết thô cây Diệp hạ châu ..................41
Bảng 3.5: Kết quả xác định MIC cắn alkaloid Diệp hạ châu .....................................44

vi


Danh mục hình

Hình 1.1: Cấu trúc peptidoglycan ...............................................................................9
Hình 1.2: Cấu trúc màng sinh chất ...........................................................................11
Hình 1.3: Cơ chế ức chế tổng hợp protein ................................................................ 11
Hình 1.4: Cơ chế ức chế tổng hợp DNA ...................................................................12
Hình 2.1: Quy trình chiết hợp chất thứ cấp thô .........................................................25
Hình 2.2: Quy trình chiết alkaloid bằng chloroform .................................................27
Hình 2.3: Quy trình chiết hợp chất phenolic và tannin bằng acetone ........................28
Hình 2.4: Quy trình chiết saponin ............................................................................29

vii


MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc sử dụng thuốc kháng sinh không hợp lý gây nhiều tổn hại cho
con người, từ vấn đề an toàn thực phẩm, ô nhiễm môi trường đến công tác chữa trị
bệnh bởi dư lượng kháng sinh gây tăng khả năng kháng thuốc và tạo ra chủng kháng
kháng sinh gây khó khăn trong công tác điều trị. Để giải quyết vấn đề trên, việc tìm
kiếm nhân tố kháng sinh từ tự nhiên ngày được quan tâm, thu hút nhiều nghiên cứu
của Dược sỹ, y bác sỹ, nhà nghiên cứu bệnh lý thực vật và vi trùng học... Tìm kiếm và
nghiên cứu thuốc có nguồn gốc tự nhiên hứa hẹn sẽ chọn lọc ra được nhiều loại thuốc
mới đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về mặt chăm sóc sức khỏe cho con người.
Con đường để tìm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên thường là chiết xuất, phân
lập hợp chất tinh khiết từ các dịch chiết toàn phần thử hoạt tính sinh học, xác định cấu
trúc và xác định hoạt chất trên chất tinh khiết từ đó tìm hướng phân lập với khối lượng
lớn, bán tổng hợp hay tổng hợp những chất có tiềm năng nhất.
Nhằm giải quyết vấn đề tìm kiếm kháng sinh tự nhiên, đề tài “Sàng lọc một số
loài thực vật có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh cho người” được đặt ra và giải
quyết.
Mục tiêu:

­

Tìm hiểu các hợp chất thứ cấp của thực vật, các phương pháp thu nhận và

phân lập.

­

Tìm hiểu cơ chế tác dụng của thuốc lên vi khuẩn.

­

Nắm rõ các phương pháp thử nghiệm tính kháng khuẩn của dịch chiết thực

vật.

­

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết thô thực vật và dịch chiết

phân lập (nếu có)

viii


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tính kháng khuẩn của thực vật
Gần đây, ngành dược phẩm và các nhà khoa học đã giành mối quan tâm to lớn
đến dược liệu và phân tích thành phần kháng sinh thực vật thay thế cho kháng sinh,
thuốc trừ sâu hóa học có nhiều mối nguy hiểm với con người và thiệt hại đối với môi
trường và hệ sinh thái. Nhiều loại dược liệu có khả năng chống lại các vi khuẩn gây
bệnh và hiện nay người ta đang điều tra cơ chế hoạt động của chúng và phân lập các
hợp chất hoạt động. Việc khai thác các cây có giá trị dược liệu để điều trị nhiễm khuẩn
trên thực vật và con người là việc phát triển nhân tố kháng sinh mới.
1.1.1 Lịch sử sử dụng
Từ thời cổ đại, con người đã biết dùng thực vật làm thuốc chữa bệnh, cho đến
nay các cây thuốc này đã được ứng dụng đa mục đích. Cây thuốc đã được sử dụng

trong nhiều thế kỷ như một biện pháp khắc phục bệnh và cung cấp một nguồn mới hợp
chất hóa học hoạt tính giống như kháng sinh tự nhiên. Dược liệu được sử dụng nhiều
trong y học cổ truyền, Đông y, hệ thống thuốc hiện đại, dinh dưỡng tự nhiên, bổ sung
thức ăn, thuốc dân gian, dược phẩm, hóa chất trung gian tổng hợp các loại thuốc…
Ước tính rằng có hơn 14-28% các loài thực vật được sử dụng trong y học và 74% đã
được phát hiện là có hoạt tính sinh học [5].
Từ năm 1950, khi phòng thí nghiệm Cyanamid Co của Mỹ thử nghiệm các mức
vitamin B12 từ nguyên liệu môi trường nuôi cấy Streptomyces aureofaciens nhận thấy
gà thí nghiệm phát triển hơn so với bình thường mà nguyên nhân không phải do B12
mà là chlortetracycline có trong dịch nuôi cấy kể trên.Phát hiện trên khiến thuốc kháng
sinh được dùng trong chăn nuôi nhằm mục đích tăng trọng cho gia súc, gia cầm. Khi
nhiều nghiên cứu về thiệt hại của việc dùng kháng sinh trong chăn nuôi và hậu quả dư
lượng kháng sinh ảnh hưởng đến sức khỏe con người thì việc cấm dùng hay hạn chế
bớt thuốc kháng sinh trong chăn nuôi đã được phổ biến. Tuy nhiên, vì hiệu quả và

1


năng suất chăn nuôi, vấn đề tăng trọng cho vật nuôi và bảo vệ vật nuôi khỏi bệnh tật đã
thúc đẩy nhiều nghiên cứu tìm ra vật liệu có thể thay thế kháng sinh.
1.1.2 Sử dụng và xu hướng phát triển
Hợp chất thứ cấp của thực vật có tác dụng dược lý mạnh và con người đã biết
sử dụng chúng vào nhiều mục đích như sản xuất nước hoa, tinh dầu thơm, dược liệu
phơi khô tỏa mùi…Ngày nay, việc phân lập thành phần có hoạt tính để sản xuất thực
phẩm chức năng đang là xu hướng phát triển tiềm năng.
Các nghiên cứu về cây thuốc dân gian rất quan trọng đối với y học hiện đại và
cần có phương pháp chuẩn để có thể kết luận và so sánh kết quả kiểm tra. Hiện nay,
các nhà khoa học đang nghiên cứu cây trồng có đặc tính kháng sinh, đây sẽ là một lợi
ích cho phương pháp khai thác và trong thí nghiệm thử hoạt tính kháng khuẩn để giải
thích kết quả cho y học cổ truyền. Hàng ngàn chất hóa học từ thực vật đã được kiểm

tra trong phòng thí nghiệm về tính kháng khuẩn, sau đó sẽ được thử nghiệm để đánh
giá hiệu quả kiểm soát tỷ lệ mắc bệnh ở cây trồng, thực vật và con người. Hiện nay, sự
hợp tác giữa các dược sỹ, y bác sỹ, nhà nghiên cứu bệnh lý học thực vật và vi trùng
học rất quan trọng và cần thiết [5].
1.2 Các nhóm hợp chất chính có tính kháng khuẩn của thực vật
Thực vật có khả năng tổng hợp chất thơm, hầu hết nó là phenol hoặc dẫn xuất
oxy. Chúng đều là hợp chất thứ cấp, hiện nay đã phân lập được khoảng 12000 loại,
chiếm tỷ lệ ước tính dưới 10% tổng số hợp chất thứ cấp [7]. Trong nhiều trường hợp,
đa số hợp chất thứ cấp có vai trò bảo vệ cây trồng chống lại các loài ăn chúng như vi
sinh vật, côn trùng và động vật. Ví dụ như nhóm terpenoid tạo mùi hôi, nhóm quinon
và tannin tạo sắc tố trên thực vật, một số hợp chất tạo hương vị và một số được dùng
làm dược phẩm và thực phẩm cho con người.
1.2.1 Phenolic và polyphenol [7],[3]
1.2.1.1 Định nghĩa:
Là nhóm chất hữu cơ chứa một nhóm hydroxyl (-OH) gắn với một nhóm
hydrocarbon thơm.
2


Nhóm phenol có thể đơn chức hay đa chức, một hay nhiều nhân thơm, gốc
hydrocarbon liên kết vào nhân thơm có thể no hay không no, mạch hở hay mạch vòng.
1.2.1.2 Phân loại:

­

Phenol và phenolic acid: đa số thảo mộc chứa ceffeic acid có hiệu quả

kháng virus, vi khuẩn và nấm. Catechol (2 nhóm –OH) và pyrogallol (ba nhóm –OH)
đều là hydroxylate phenol là một chất độc đối với vi khuẩn. Vị trí và số lượng nhóm
hydroxyl trên vòng phenol có tác dụng gây độc đối với vi khuẩn, nhóm hydroxyl càng

nhiều thì càng độc.

­

Quinone: là chất hữu cơ chứa vòng thơm liên kết với 2 nhóm ceton. Nhóm

chất này gây màu, gây phản ứng hóa nâu trên vết cắt trái cây, rau và là chất trung gian
trong sự tổng hợp melanin trên da người. Sự chuyển hóa từ diphenol sang diketon
(quinine) dễ dàng qua phản ứng oxy hóa.

­

Flavone, flavonoid, flavonol: là nhóm phenolic mà cấu trúc có chứa một

nhóm carbonyl, bộ khung cơ bản là C6-C3-C6. Nghiên cứu cho thấy nhóm chất này làm
thay đổi và chống lại nhân tố dị ứng, virus và chất gây ung thư, nó có tác dụng chống
viêm, chống vi khuẩn, chống ung thư in vitro.

­

Tannin: là những chất đa phenol. Gồm hai loại là tannin thủy phân và tannin

không thủy phân. Trong thực vật, tannin tham gia quá trình trao đổi chất, quá trình oxy
hóa khử của cây. Tannin có tính kháng khuẩn bảo vệ cho cây. Tannin có nhiều ở thực
vật bậc cao lớp hai lá mầm, họ thực vật có nhiều tannin là họ Sim, họ Bàng, họ Sam.

­

Coumarin: là phenolic được tạo thành bằng sự kết hợp giữa vòng benzene

và vòng α-pyrone. Nó tạo ra mùi đặc trưng ở cỏ khô. Coumarin có tác dụng chống
viêm, giãn mạch, kháng khuẩn.
1.2.1.3 Tính chất:

­

Tính chất vật lý:
Màu sắc: đa số các hợp chất phenolic kết tinh từ không màu đến vàng

nhạt rồi vàng, có thể có màu đỏ cam (flavanoid). Một số loại thuộc nhóm anthocyanin

3


có màu thay đổi tùy theo môi trường, trong môi trường acid thì tạo muối oxonium màu
đỏ, trong môi trường kiềm thì tạo thành anion quinoid màu xanh.
Độ tan không giống nhau tùy thuộc vào cấu trúc của hợp chất đó. Ví dụ:
tannin tan được trong nước, rượu, acetone, đa số không tan trong ether. Flavonoid
glycoside không tan trong ether, tan được trong nước nóng, tốt nhất là cồn nóng.

­

Tính chất hóa học:
Tính acid cao do vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxy và liên kết

tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử oxy này với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl.
Tính acid cao hơn rượu và thấp hơn carboxylic acid.

­

Tính chất sinh học:
Có nhiều tác dụng sinh học như thông tiểu (quexitin trong dấp cá), chống

viêm, chống dị ứng (vỏ cây Núc nác,…), kháng sinh (Kim ngân hoa, Sài đất, Xạ
can…), chống loét dạ dày tá tràng (Cam thảo bắc,…), thuốc sát trùng nhẹ, cản sự lên
men của vi khuẩn, điều trị ngộ độc kim loại và alkaloid…
1.2.2 Terpenoid [7]
1.2.2.1 Định nghĩa:
Nhóm terpenoid còn được gọi là isoprenoid, thuộc lớp terpene, là hydrocarbon
đồng phân C10H16 (Kékulé). Hiện nay, terpene dùng để chỉ tất cả các hợp chất có sườn
C5H8 (isoprene). Chúng là hợp chất thứ cấp chịu trách nhiệm về tạo hương thơm ở
thực vật. Gồm hai nhóm chính: tinh dầu và saponin.
1.2.2.2 Tinh dầu:

­

Tính chất vật lý:
Ở nhiệt độ thường, tinh dầu tồn tại dưới dạng lỏng, rất dễ bay hơi, rất ít

tan trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ, dầu béo. Đa số không màu hoặc có
màu vàng nhạt đến vàng đậm, một số có màu xanh hay đỏ. Thường có vị cay hắc, có
tỷ trọng nhẹ hơn nước. Nhiệt độ sôi tương đối cao.

­

Tính chất hóa học:
4


Tùy theo từng loại mà tinh dầu có tính acid hay trung tính.

Một số tinh dầu có nối đôi nên tham gia phản ứng trùng hợp, hóa nhựa,
được ứng dụng trong kỹ nghệ verni, xi đánh giày để tạo ra một lớp màng.
Khi đốt cháy tinh dầu cho ngọn lửa nhiều khói.
Tinh dầu có nhiều nhóm chức khác nhau trong phân tử nên tinh dầu có
những phản ứng đặc trưng riêng biệt của từng nhóm chức. Ứng dụng để kiểm nghiệm
tinh dầu.

­

Tính chất sinh học:
Tinh dầu có tác dụng sát trùng da và đường hô hấp, được sử dụng làm

thuốc sát trùng, thuốc ho, dầu bôi xoa bóp.
1.2.2.3 Saponin [3]
a) Định nghĩa:
Saponin còn được gọi là saponosid là một nhóm glycoside lớn, phân bố rộng rãi
trong thực vật.
b) Phân loại:
Dựa vào cấu trúc hóa học, chia làm hai nhóm chính:

­

Saponin triterpen: khung cơ bản thường có 30C, trong nhân có 21-22C, ngoài

nhân có 8-9C.

­

Saponin steroid: khung cơ bản có 27C.

c) Tính chất:

­

Tính chất vật lý:

Saponin có vị đắng, nồng, thường ở dạng vô định hình, khó tinh chế.
Giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa và
tẩy sạch.

­

Tính chất hóa học:

5


Saponin tan trong acetone, ether, hexane, do đó, người ta dùng các chất này để
tủa saponin.
Saponin có thể bị kết tủa bởi chì acetate, bari hydroxid, amoni sunfat.
Saponin khó bị thẩm tích, dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá
trình chiết xuất.
Saponin có thể làm vỡ hồng cầu ở những nồng độ rất loãng.

­

Tính chất sinh học:

Saponin có tác dụng trên sinh vật hạ đẳng như nấm, men, mốc; tác dụng chống
nấm rất mạnh.

Saponin rất độc với động vật máu lạnh. Đối với động vật có vú, nếu uống thì
độc ít, khi tiêm thì độc tính cao hơn rất nhiều.
Saponin kích ứng màng nhầy gây hắt hơi, long đờm, lợi tiểu.
Có tác động làm mau lên sẹo.
Kích thích nhẹ lên hệ thần kinh.
Điều hòa hệ tim mạch.
Saponin họ Ngũ gia bì có tác dụng tăng lực, bổ khí huyết, dung trị các chứng
suy nhược.
 Định tính


Phản ứng tạo bọt: cho bột dược liệu vào ống nghiệm có chứa nước, lắc

mạnh, nếu xuất hiện bọt bền trong 15 phút thì dược liệu có chứa saponin.


Phản ứng phá huyết: ống nghiệm chứa 1ml dung dịch 1% và 1ml dung

dịch máu đã loại fibrin 2% pha trong đệm phosphate, lắc nhẹ, để 2-12 giờ, nếu: ống
hoàn toàn đỏ và trong tức là có phá huyết; ống có hai lớp, lớp trên không màu, lớp
dưới đỏ tức không phá huyết.

6


1.2.3 Alkaloid
1.2.3.1 Định nghĩa: [3]
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ trong công thức phân
tử, có tính base, alkaloid có hoạt tính dược lực rất mạnh ở liều rất nhỏ, cho phản ứng
đặc trưng với một số thuốc thử chung của alkaloid

Alkaloid rất phổ biến trong thực vật, nó có mặt trong nhiều bộ phận của cây với
nồng độ khác nhau và nhiều loại khác nhau. Hàm lượng alkaloid trong cây tùy thuộc
vào nhiều yếu tố như: khí hậu, ánh sáng, tính chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận
thu hái… Trong cây, alkaloid thường ở dạng muối của các acid hữu cơ khác nhau, tan
trong dịch tế bào hoặc kết hợp với tannin.
1.2.3.2 Phân loại: [17]
Dựa theo sự giống nhau của khung carbon hoặc tiền chất. Alkaloid thường được
chia thành các nhóm chính sau:

­

Nhóm pyridine: piperine, coniine, trigonelline, arecaidine, guvacine,

pilocarpine, cytisine, nicotine, sparteine, pelletierine.

­

Nhóm pyrrolidine: hygrine, cuscohygrine, nicotine.

­

Nhóm tropane: atropine, cocaine, ecgonine, scopolamine.

­

Nhóm quinoline: quinine, quinidine, dihydroquinine, dihydroquinidine,

strychnine, brucine, veratrine, cevadine.

­

Nhóm isoquinoline: alkaloid gốc thuốc phiện như: morphine, codeine,

thebaine, papaverine, narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine.

­

Nhóm phenethylamine: mescaline, ephedrine, dopamine, amphetamine.

­

Nhóm idol: các tryptamine (DMT, N-metyltryptamine, psilocybine,

serotonine); các ergoline (từ ngũ cốc, cỏ như ergine, ergotamine, acid lysergic...); các
beta-carboline (harmine, harmaline, yohimbine, reserpine, emetine); các alkaloid từ chi
Ba gạc như reserpine.

­

Nhóm purine: các xanthine (caffeine, theobromine, theophylline).
7


­

Nhóm terpenoid: các aconite (aconitine) và các steroid (solanine,

samandarin, muscarine, choline, neurine).

­

Các alkaloid từ dừa cạn (chi Vinca) và các họ hàng của nó như vinblastine,

vincristine là các chất chống ung thư.
1.2.3.3 Tính chất [3]

­

Tính chất vật lý:
Alkaloid chủ yếu được cấu tạo bởi các nguyên tố C, H, O, N, tồn tại ở

trạng thái đặc ở nhiệt độ thường (morphine, codeine, strichnine, quinine, reserpine).
Chúng có thể kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid
không có điểm chảy vì bị phân hủy bởi nhiệt độ trước khi chảy.
Alkaloid mà thành phần cấu tạo không có O thường ở trạng thái lỏng.
Chúng có thể bay hơi được và thường bền vững, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi, nên
cất được bằng hơi nước.
Đa số alkaloid không màu và có vị đắng.
Hầu hết các alkaloid và các muối alkaloid thường không màu, trừ một số
ít có màu như berberine, palmatine, chelidonine có màu vàng.
Các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ
như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzene. Các muối alkaloid thì ngược lại.

­

Tính chất hóa học:
Alkaloid dễ tạo tủa, có thể dùng các thuốc thử sau để định tính alkaloid:
Thuốc thử Mayer (K2HgI4) cho tủa trắng hay vàng nhạt.
Thuốc thử Boucharda (Iodo-Iodua) cho tủa nâu.
Thuốc thử Dragendorff (KbiI4) cho tủa vàng cam đến đỏ.

­

Tính chất sinh học:
Hầu hết các alkaloid có hoạt tính sinh học, nhiều alkaloid thường rất độc.

Tác dụng của alkaloid thường khác nhau:
8


Ức chế thần kinh trung ương như morphine, codeine, scopolamine,
reserpine,...
Kích thích hệ thần kinh trung ương như strychnine, cafeine, lobeline...
Kích thích hệ thần kinh giao cảm như ephedrine, hordenine...
Liệt thần kinh giao cảm như ecgotamine, yohimbine...
Kích thích phó giao cảm như pilocarpine, reserpine...
Liệt phó giao cảm như hyosyamine, atropine...
Phong bế hạch giao cảm như nicotine, sparteine, cornitine...
Gây tê tại chỗ (cocaine), trị co giật (paraverine).
Tác dụng trên huyết áp: tăng (ephedrine), giảm (reserpine).
Tác dụng lên tim: ajmaline, quinidine...
Diệt ký sinh trùng: quinine, emetine, conexine, isopelletierine, arecoline.
1.3 Cơ chế tác động lên vi sinh vật
Cơ chế kháng khuẩn và diệt khuẩn chủ yếu là tác động trên quá trình tổng hợp
protein, bao gồm tạo phức đầu dịch mã hay giai đoạn kéo dài; ức chế quá trình tổng
hợp acid nucleic; ức chế quá trình trao đổi chất và ức chế quá trình hình thành vách tế
bào vi khuẩn.
1.3.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn [2]

Hình 1.1: Cấu trúc peptidoglycan

9


Thành tế bào vi khuẩn có vai trò bảo vệ hình dạng vi khuẩn và chịu áp suất
thẩm thấu cao bên trong nên là thành phần cần thiết cho sự tồn tại của vi khuẩn. Thành
của tất cả vi khuẩn đều cấu tạo bởi peptidoglycan (còn gọi là mucopeptid hay murein).
Peptidoglycan gồm các chuỗi polysaccharide nối với nhau bởi các dây peptid ngang
tạo thành cơ cấu mạng lưới rất vững chắc. Các polysaccharide gồm Nacetyglucosamin (NAG) xen kẽ với N-acetylmuramic acid (NAM) bởi liên kết α-1,4
glycoside. Trên NAM có các nhánh tetrapeptide khác nhau tùy loại vi khuẩn. Trình tự
thông thường của tetrapeptide gồm: L-alanine, acid D-glutamic, acid diaminopimelic
(hoặc L-lysin) và D-alanine. Cơ chế tác động trên thành tế bào vi khuẩn là do sự can
thiệp vào sử tổng hợp thành peptidoglycan qua các giai đoạn:

·

Giai đoạn 1: Tổng hợp uridindiphosphate (UDP) acetyl muramyl

pentapeptide. Phản ứng cuối của giai đoạn này là thành lập dipeptide: D-alanine Dalanine cần 2 enzyme alanine racemase và D-alanine D-alanine synthetase. Những hợp
chất có cấu trúc tương tự như D-alanine cạnh tranh với nó để gắn vào enzyme.

·

Giai đoạn 2: Phản ứng kết hợp UDP-acetyl muramyl pentapeptide và

UDP-acetylglucosamin thành một chuỗi dài nhờ xúc tác của transglucosidase. Các hợp
chất hóa học thực vật có thể ức chế transglucosidase.

·

Giai đoạn 3: Hoàn tất đường nối ngang của hai peptidoglycan kế cận. Sự

tổng hợp peptidoglycan có sự tham gia của PBP (penicillin binding protein) ở trên mặt
hay nằm xuyên qua màng sinh chất PBP là receptor của penicillin. Glycin cuối cùng
của phân tử pentapeptide thứ nhất gắn với D-alanine thứ tư của pentapeptide thứ hai,
đồng thời phóng thích D-alanine thứ năm, phản ứng này cần transpeptidase, enzyme
này có thể bị ức chế bởi hợp chất hóa học thực vật.

10


1.3.2 Ức chế quá trình chuyển hóa

Hình 1.2: Cấu trúc màng sinh chất
Màng sinh chất là nơi trao đổi giữa tế bào vi khuẩn với môi trường bên ngoài.
Màng này có tính thấm chọn lọc để kiểm soát các thành phần bên trong tế bào. Nếu
màng sinh chất bị tổn thương, các phân tử lớn và ion thoát ra ngoài nên vi khuẩn chết.
Hợp chất thứ cấp có cấu tạo thuộc nhóm polyen tác động như một chất tẩy loại cation
làm xáo trộn tính thẩm thấu của màng nguyên sinh chất khiến các ion như Mg2+, K+,
Ca2+ thoát ra khỏi tế bào. Một số tác động theo cơ chế ức chế tổng hợp lipid màng sinh
chất.
1.3.3 Ức chế tổng hợp protein

Hình 1.3: Cơ chế ức chế tổng hợp protein [26]
Sự dịch mã khởi đầu khi có sự hình thành phức đầu dịch mã gồm các nhân tố
30S, IF1, IF2, IF3, mRNA, fmet-tRNA tạo thành phức khởi đầu, tiểu đơn vị lớn sau đó
mới kết hợp vào để bắt đầu dịch mã. Quá trình kéo dài: peptidyl RNAt ở vị trí P
chuyển dây peptide đang được thành lập sang aminoacyl RNAt ở vị trí A nhờ xúc tác

11

của peptidyltransferase. Sau khi chuyển dây peptide, tRNA rời vị trí P để nhường chỗ
cho peptidyl RNAt mới nối trước đó đến. Một aminoacyl RNAt mới lại đi vào vị trí A.
Hợp chất tự nhiên có thể can thiệp vào tất cả các quá trình tạo thành phân tử
protein như can thiệp vào sự hình thành phức đầu dịch mã (30S-fmet-tRNA-mRNA);
gắn với receptor chuyên biệt trên ribosome 30S gây biến dạng ribosome dẫn đến đọc
sai mã ở tiểu đơn vị 30S nên mang vào các acid amin không đúng, vì vậy tạo ra các
protein không hoạt tính; gắn vào tiểu đơn vị 50S, ức chế hoạt động của enzyme
peptidyl transferase, peptide ở vị trí P không thể chuyển sang vị trí A, cũng có thể ức
chế sự chuyển peptidyl RNAt từ vị trí A sang vị trí P nên aminoacyl RNAt mới không
thể chiếm vị trí A để kéo dài chuỗi peptide.
1.3.4 Ức chế tổng hợp acid nucleic
1.3.4.1 Ức chế sự tổng hợp DNA
Trong qúa trình nhân đôi DNA, cần thiết có sự tham gia của enzyme DNA
gyrase (là enzyme topoisomerase II với vi khuẩn Gram âm và topoisomerase IV với vi
khuẩn Gram dương) để tháo xoắn và dãn mạch DNA, từ đó enzyme helicase mới cắt
liên kết hydro tạo điểm Ori khởi đầu sao chép. Ức chế sự tổng hợp DNA là làm bất
hoạt enzyme gyrase, từ đó quá trình nhân đôi, tái sắp xếp lại đoạn DNA, nối đoạn cắt
bị ngăn chặn và gây chết vi khuẩn.
DNA gyrase và topoisomerase IV có cấu trúc protein tương tự nhau, gồm hai
tiểu đơn vị Gry-A và Gry-B với chức năng khác nhau. Đầu tiên, Gry-A gắn vào DNA
xoắn kép. Nhờ một phân tử ATP, Gry-B tách sợi DNA ra tạo đầu sole ở 4 cặp base.
Tiếp đó, phân tử thuộc nhóm quinolone sẽ kết hợp vào hai đầu mạch còn lại vì thế
không thể mở vòng để sao chép.

Hình 1.4: Cơ chế ức chế tổng hợp DNA.
12


1.3.4.2 Ức chế tổng hợp RNA

Quá trình phiên mã là chuyển thông tin di truyền từ DNA sang mRNA nhờ
enzyme RNA polymerase. Từ mRNA đó lại dịch mã ra protein. Quá trình ức chế tổng
hợp RNA do hợp chất hóa học có thể kết hợp làm sai khác cấu trúc của enzyme RNA
polymerase, vì thế enzyme này không thực hiện được vai trò của nó trong phiên mã và
dịch mã.
1.3.4.3 Ức chế tổng hợp acid folic
Đối với nhiều sinh vật, acid p-aminobenzoic (PABA) là tiền chất để tổng hợp
acid folic. Acid folic là loại vitamin B9 cần thiết để tạo tế bào mới và duy trì chúng, nó
cần thiết cho quá trình nhân đôi DNA và tránh đột biến DNA. Việc thiếu acid folic làm
chậm quá trình tổng hợp DNA và phân chia tế bào. Một số hợp chất hóa học thực vật
có cấu trúc tương tự như PABA (như kháng sinh sulfonamide) nên chúng có khả năng
cạnh tranh với PABA trong quá trình tổng hợp acid folic, cuối cùng tạo chất giống
acid folic nhưng không có hoạt tính sinh học.
Hợp chất thứ cấp còn có thể ức chế enzyme dihydrofolat reductase nên ngăn
biến dihydrofolat thành dạng hoạt động là tetrahydrofolat để tổng hợp purin rồi acid
nucleic.
1.4 Các phương pháp chiết tách, định tính, định lượng
1.4.1 Phương pháp chiết tách
Tách chiết là phương pháp phân đoạn dược liệu từ mô thực vật bằng cách sử
dụng dung môi thích hợp và kỹ thuật tách chiết. Dung môi khuếch tán vào mô thực vật
rắn và hòa tan hợp chất phân cực. Chất lượng của dịch chiết thực vật phụ thuộc vào vật
liệu và chọn lựa phương pháp tách chiết [5]
1.4.2 Phương pháp định tính và định lượng
Sau khi có được dịch chiết thực vật thô, có nhiều phương pháp phân tích hóa
học và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp trong thực vật. Một số phương pháp
nghiên cứu được dùng để định tính, định lượng như:
 Phương pháp sắc ký bản mỏng
13

Là phương pháp tách chiết, có bản chất là sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh rắn được
trải thành lớp mỏng trên bản kính, nhựa hay kim loại. Giọt mẫu nhỏ trên đường xuất
phát cách rìa 2-3cm, rìa bản được nhúng vào một dung môi thích hợp (pha động).
Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi chuyển động dọc theo lớp hấp phụ và vận
chuyển các cấu tử của hỗn hợp với các vận tốc khác nhau nhằm tách các cấu tử. Sự
khuếch tán vừa theo chiều dọc, vừa theo chiều ngang.
 Phương pháp sắc ký khí
Là kỹ thuật phân tách trong đó pha động là khí hoặc hơi.
 Phương pháp phổ khối lượng
Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để đo đạc tỷ lệ khối lượng
trên điện tích của ion, dùng thiết bị chuyên dụng là phổ khối kế. Phương pháp này
được ứng dụng để xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của
phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó; xác định kết cấu các đồng vị của
các thành phần trong hợp chất; xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát
từng phần tách riêng của nó; định lượng hợp chất trong một mẫu dùng các phương
pháp khác; nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí; xác định các thuộc tính vật lý,
hóa học hay sinh học của hợp chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau.
 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography)
Là phương pháp chia tách, trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh là chất rắn
chứa trong cột được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một
chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion hay phân loại theo kích cỡ.
1.4.3 Phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn
Kiểm tra tính kháng khuẩn là một phương pháp đánh giá dược lý của thực vật.
Dược lý, về cơ bản là tác dụng của các hợp chất thứ cấp hiện diện trong thực vật,
không phải là một chất duy nhất mà là sự kết hợp của nhiều chất (Parekh và cộng sự,

14