Nghiên cứu qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ QUỐC PHÒNG

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH NUÔI CẤY, BIỆT HÓA
TẾ BÀO GỐC SINH TINH ĐỂ ĐIỀU TRỊ VÔ SINH
NAM GIỚI
MÃ SỐ: ĐTĐL2009T/27

Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Nguyễn Đình Tảo

8999

HÀ NỘI - 2011


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ........................................................................................ 28
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 31
2.1. Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh ....................................................... 31
2.2. Tổng quan về tế bào nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh........................ 41

2.3. Về tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh trong quá trình nuôi cấy. ........ 57
2.4. Về bảo quản tế bào dòng tinh. ....................................................................... 73
CHƯƠNG III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 85
3.1. Đối tượng nghiên cứu: ................................................................................... 85
3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 86
3.3. Trang bị, hóa chất......................................................................................... 102
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 105
4.1. Nghiên cứu về phân lập tế bào dòng tinh từ mào tinh................................ 105
4.2. Nghiên cứu về phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh ................... 107
4.3. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào dòng tinh ........................................... 111
4.3.1. Đặc điểm bệnh nhân..................................................................... 111
4.3.2. Đặc điểm cấu trúc ống sinh tinh của các bệnh nhân azoospermia .... 111
4.3.3. Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh từ mào tinh trong quá trình nuôi cấy 112
4.3.4. Biến đổi số lượng các tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh trong
quá trình nuôi cấy......................................................................... 115
4.3.5. Đánh giá tế bào gốc sinh tinh bằng GPF...................................... 121
4.3.6. Đánh giá tế bào dòng tinh bằng kỹ thuật FISH............................ 123
4.3.7. Đánh giá tế bào dòng tinh bằng kính hiển vi điện tử ................... 125
4.3.8. Đánh giá khả năng thụ tinh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ
thuật ICSI trên thực nghiệm (n = 100 noãn):............................... 126

21


4.3.9. Đánh giá khả năng thụ tinh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ
thuật ICSI trên lâm sàng (n = 125 noãn):..................................... 127
4.4. Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh ..................................... 129
4.4.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu .................................................. 130
4.4.2. Thể tích tinh hoàn......................................................................... 130
4.4.3. Kết quả nghiên cứu trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ mào tinh...... 131

4.4.4. Kết quả nghiên cứu trữ lạnh mô tinh hoàn................................... 132
4.5. Các qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tinh ............ 138
CHƯƠNG V. BÀN LUẬN ................................................................................ 157
5.1. Về lựa chọn bệnh nhân qua xét nghiệm mất đoạn nhỏ ở vùng AZF trên NST
Y ........................................................................................................ 157
5.2. Về quá trình phân lập tế bào gốc sinh tinh.................................................. 163
5.3. Nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu được từ mào tinh. ................................. 164
5.4. Nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh................................................................ 165
5.5. Vai trò của tế bào Sertoli trong nuôi cấy..................................................... 166
5.6. Phương pháp nuôi cấy ................................................................................. 166
5.7. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy............................................................. 167
5.8. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh ................ 168
5.9. Thể tích tinh hoàn và tế bào gốc sinh tinh lập............................................. 168
5.10. Trữ lạnh các tế bào dòng tinh thu nhận từ mào tinh ................................. 169
5.11. Trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh trong mô tinh hoàn của bệnh nhân ............ 176
KẾT LUẬN......................................................................................................... 182
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 184
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 185
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 201
- Danh sách bệnh nhân PESA, MESA
- Danh sách bệnh nhân trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh và mô tinh hoàn

22


DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ART

Assisted Reproductive Technology (Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản)

AID

Artificial insemination by donor (Thụ tinh nhân tạo bằng tinh
trùng của người cho)

CPA

Cryoprotective agents: Các chất bảo vệ tế trong quá trình đông lạnh

AZF

Azoospermic factor

CS

Cộng sự

CSF

Cryosurvival factor: chỉ số sống sau trữ lạnh của tinh trùng

DMSO

Dimethyl sulphoxide

G

Glycerol

HE

Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin- Eosin

IVF

In Vitro Fertilization (Thụ tinh trong ống nghiệm)

ICSI

Intracytoplasmic Sperm Injection (Tiêm tinh trùng vào trong bào
tương trứng)

NOA

Non-Obstructive Azoospermia

MESA

Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration

OA

Obstructive Azoospermia

PESA

Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration

SC

Stem Cell

TESE

Testicular Sperm Extraction

TEM

Transmission electron microscopy: Kính hiển vi điện tử truyền qua

TTTON

Thụ tinh trong ống nghiệm

WHO

World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới )

23


DANH MỤC BẢNG
Nội dung

Trang

Bảng 4.1. Tuổi và thời gian vô sinh trung bình của các nhóm bệnh nhân........ 105
Bảng 4.2. Nồng độ một số hormone của bệnh nhân.......................................... 105
Bảng 4.3. Kết quả thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh ............................... 106
Bảng 4.4. Tuổi và thời gian vô sinh của bệnh nhân nghiên cứu ....................... 111

Bảng 4.5. Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử tại mào tinh qua các thời điểm
nuôi cấy trong môi trường không bổ sung các hormone .................. 113
Bảng 4.6. Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử tại mào tinh qua các thời điểm
nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các hormone ....................... 114
Bảng 4.7. So sánh kết quả nuôi cấy các tế bào ở mào tinh trong môi trường nuôi
cấy có bổ sung và không bổ sung các hormone............................... 114
Bảng 4.8. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh chuột trong môi trường nuôi
cấy...................................................................................................... 116
Bảng 4.9. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh người trong môi trường nuôi
cấy...................................................................................................... 118
Bảng 4.10. Khả năng thụ tinh của tinh tử chuột sau nuôi cấy ........................... 126
Bảng 4.11. Sự phát triển phôi chuột ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy .............. 126
Bảng 4.12. Sự phát triển phôi chuột ngày 3 với tinh tử sau nuôi cấy .............. 127
Bảng 4.13. Khả năng thụ tinh của tinh tử sau nuôi cấy ..................................... 127
Bảng 4.14. Sự phát triển phôi ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy.......................... 128
Bảng 4.15. Sự phát triển phôi ngày 3 với tinh tử sau nuôi cấy.......................... 129
Bảng 4.16. Tuổi, thời gian vô sinh của bệnh nhân............................................. 130
Bảng 4.17. Đặc điểm thể tích tinh hoàn của bệnh nhân nghiên cứu ................. 130
Bảng 4.18. Kết quả độ di động của tinh trùng thu nhận từ mào tinh trước, sau trữ
lạnh và nuôi cấy. ................................................................................ 131
Bảng 4.19. Tỉ lệ sống của tinh trùng trước trữ lạnh và sau rã đông .................. 131
24


Bảng 4.20. Hình thái tinh trùng trước và sau rã đông........................................ 132
Bảng 4.21. Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh nhóm sử dụng chất bảo quản
Glycerol (Sperm freeze) ................................................................... 133
Bảng 4.22. Kết quả sau trữ lạnh mô tinh hoàn sử dụng Glycerol (Sperm Freeze).. 133
Bảng 4.23. Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh ở nhóm sử dụng chất bảo quản
DMSO. .............................................................................................. 135

Bảng 4.24. Kết quả sau trữ lạnh mô tinh hoàn sử dụng DMSO........................ 135
Bảng 4.25. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh trong môi trường trước và
sau bảo quản bằng DMSO................................................................ 137
Bảng 5.1. Kết quả độ di động, tỉ lệ sống của tinh trùng thu nhận từ mào tinh
trước và sau trữ lạnh của các tác giả................................................. 172

25


DANH MỤC HÌNH
Nội dung

Trang

Hình 2.1. Sơ đồ quá trình sinh tinh trùng............................................................. 58
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc một phần ống sinh tinh của người bình thường .............. 60
Hình 2.3. Cấu trúc ống sinh tinh của người bình thường (x600) ........................ 66
Hình 2.4. Cấu trúc ống sinh tinh BN do tắc (nhuộm HE, X600). ....................... 66
Hình 2.5. Cấu trúc ống sinh tinh BN không do tắc (nhuộm HE, x600).............. 67
Hình 2.6. Các tế bào dòng tinh từ bệnh nhân azoospermia không do tắc........... 68
Hình 2.7. Hình ảnh ống sinh tinh và các tế bào thu được khi tách từ ống
sinh tinh. .............................................................................................. 69
Hình 2.8. Các tế bào dòng tinh nuôi cấy ............................................................. 70
Hình 2.9. Các tế bào gốc sinh tinh nuôi cấy đang phân chia giảm phân chụp dưới
kính hiển vi điện tử ............................................................................. 71
Hình 4.1. Mẫu mô tinh hoàn sau thu hồi............................................................ 107
Hình 4.2. Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia cắt ngang (HE, x400)........... 107
Hình 4.3. Các tế bào sau phân lập bằng cách 1 (soi nổi, x100)......................... 108
Hình 4.4. Các tế bào sau phân lập bằng cách 3 (soi nổi, x100)......................... 109
Hình 4.5. Các tế bào gốc sinh tinh thu từ môi trường nuôi cấy......................... 109

Hình 4.6. Hệ thống phân lập tế bào dựa vào lực từ tính (MACS)..................... 110
Hình 4.7. Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia do tắc (HE, x600)................. 111
Hình 4.8. Ống sinh tinh bệnh nhân azoospermia không do tắc (HE, x600). ...... 112
Hình 4.9. Các tinh tử được phân lập (x600)...................................................... 115
Hình 4.10. Tinh hoàn chuột 8 ngày tuổi x100 ................................................... 117
Hình 4.11. Tinh hoàn chuột 8 ngày tuổi x400 .................................................. 118
Hình 4.12. Ngày 1 nuôi cấy x400 trên vi trường chỉ thấy tinh nguyên bào và tinh
bào 1 .................................................................................................. 119
Hình 4.13. Hình ảnh nuôi cấy 10 ngày x600. .................................................... 120
26


Hình 4.14. Các tế bào dòng tinh sau 20 ngày nuôi cấy...................................... 120
Hình 4.15. Hình ảnh các tế bào gốc sinh tinh nuôi cấy với GFP x400.. ........... 122
Hình 4.16. Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X và NST Y....................... 123
Hình 4.17. Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X và NST Y........................ 124
Hình 4.18. Hình ảnh tinh tử tròn dưới kính hiển vi điện tử x5000................... 125
Hình 4.19. Hình ảnh tinh tử đã kéo dài x3000 .................................................. 125
Hình 4.20. Tinh trùng trong nhuộm Papanicolaou (x1000) .............................. 132
Hình 4.21. Mô tinh hoàn tổn thương nặng sau trữ lạnh bằng Glycerol (x200)... 134
Hình 4.22. Mô tinh hoàn sau rã đông sử dụng chất bảo quản Glycerol (x400) .. 134
Hình 4.23. Mô tinh hoàn sau rã đông sử dụng chất bảo quản DMSO (x400) .... 136
Hình 4.24. Siêu vi thể đầu tinh trùng sau trữ lạnh sử dụng DMSO x5000 ...... 136

27


CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU
Theo các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam, thì tỷ lệ vô sinh chung từ 5

- 13%, trong đó vô sinh nam chiếm khoảng 40% [4]. Có rất nhiều nguyên
nhân dẫn đến vô sinh nam. Trong đó nguyên nhân không có tinh trùng trong
tinh dịch (azoospermia) chiếm khoảng 10-20% và là nguyên nhân khó điều
trị nhất.
Ở Việt Nam, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã được áp dụng một cách có
hiệu quả và đã mang lại hạnh phúc cho hàng ngàn cặp vợ chồng vô sinh.
Cùng với sự phát triển chung của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản của thế giới, các kỹ
thuật mới đã được triển khai và điều trị cho vô sinh nam và vô sinh nữ như
các kỹ thuật IVF, ICSI, các kỹ thuật thu tinh trùng cho các bệnh nhân không
có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia).
Trong điều trị vô sinh nam, mặc dù có nhiều tiến bộ, nhưng đối với
các bệnh nhân azoospermia, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không
do tắc thì hầu như phải xin tinh trùng. Xuất phát từ những cơ sở khoa học
trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hoá tế bào
gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới. Trong đó phân lập các tế bào gốc
sinh tinh là một bước quan trọng, là cơ sở cho những bước tiếp theo. Đã có
nhiều tài liệu công bố về nhiều phương pháp phân lập các tế bào dòng tinh
khác nhau. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm
khác nhau.
Ngày nay, với các thành tựu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, các bệnh
nhân azoospermia có thể có con của chính mình bằng tinh trùng thu được từ
mào tinh hay ống sinh tinh. Tuy nhiên, các trường hợp không có tinh trùng
trong ống sinh tinh và mào tinh vẫn chờ đợi và gặp nhiều khó khăn để có đứa

28


con của chính mình. Trước sự phát triển của khoa học và công nghệ trên thế
giới, đã biến những cái không thể thành có thể, nhiều nước trên thế giới đã
nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào dòng tinh. Từ đó nhờ kỹ thuật thụ tinh

trong ống nghiệm-tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (IVF-ICSI) đã hé mở
những hy vọng mới cho những trường hợp không có tinh trùng không do tắc
(non-obstructive azoospermia).
Nuôi cấy các tế bào dòng tinh (In Vitro culture of Spermatogenesis
cells): là phương pháp điều trị có nhiều triển vọng trong tương lai cho các
bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch không do tắc NOA (Non
Obstructive Azoospermia). Hiện nay trên thế giới một số tác giả đã tiến hành
nuôi cấy và đã có được một số thành công bước đầu. Để nâng cao hiệu quả,
tính an toàn của phương pháp này, chúng tôi tiến hành phân lập, nuôi cấy tế
bào gốc sinh tinh. Kết quả bước đầu cho thấy tế bào gốc sinh tinh phát triển
trong môi trường nuôi cấy, phân chia giảm nhiễm tạo thành các tinh tử tròn,
tinh tử đang kéo dài và tinh tử đã kéo dài. Tuy nhiên chất lượng tế bào này
như thế nào là vấn đề còn tiếp tục được nghiên cứu.
Trữ lạnh các tế bào dòng tinh nói chung và tế bào gốc sinh tinh nói
riêng giúp cho việc bảo tồn khả năng sinh sản cho nam giới trước khi điều trị
các bệnh ác tính bằng phẫu thuật, hoá chất, tia xạ cũng như một số bệnh lý
mạn tính như tiểu đường, rối loạn miễn dịch. Ngoài ra trữ lạnh tinh trùng lấy
từ mào tinh và mô tinh hoàn giúp cho tránh khỏi sinh thiết tinh hoàn nhiều lần
dế gây ra các biến chứng và tạo áp lực lớn về tâm lý cho bệnh nhân [26]. Việc
trữ lạnh tinh trùng đã trở thành thường qui trong các trung tâm hỗ trợ sinh
sản, tuy nhiên việc trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh còn nhiều vấn đề còn tiếp tục
nghiên cứu.
Ðây là một nghiên cứu có khoa học, tính nhân văn. Kết hợp với quá
trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tinh, mở ra triển vọng
cho những bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch có thể có cơ hội có
29


những đứa con của chính mình. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài với 3 mục tiêu như sau:

1. Xây dựng qui trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế
bào dòng tinh từ mào tinh ở bệnh nhân nam giới vô sinh do không có tinh
trùng,
2. Xây dựng qui trình bảo quản, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh từ
ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh thành tinh trùng,
3. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và tinh trùng được biệt
hoá từ tế bào gốc sinh tinh.
Mục tiêu cụ thể là xây dựng các qui trình và tiêu chí đánh giá tế bào như
sau:
1. Qui trình thu gom, phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh,
2. Qui trình thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh từ mào tinh,
3. Qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh,
4. Qui trình nuôi cấy, biệt hóa các tế bào dòng tinh từ mào tinh,
5. Tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và các tế bào dòng tinh sau nuôi
cấy,.
6. Qui trình bảo quản các tế bào gốc sinh tinh.

30


CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh
2.1.1. Vô sinh
Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng không có khả năng có thai sau 1
năm quan hệ vợ chồng thường xuyên và không dùng các biện pháp tránh thai.
Từ năm 1982-1985 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tiến hành nghiên
cứu và xác định: trong số bệnh nhân vô sinh có 20% nguyên nhân do nam
giới, 38% do nữ giới và 27% do cả nam và nữ, 15% không rõ nguyên nhân.
Như vậy, trên thế giới có hàng triệu bệnh nhân có nhu cầu điều trị vô sinh,

trong số đó vô sinh nam chiếm một tỷ lệ rất lớn. Có rất nhiều nguyên nhân
dẫn đến vô sinh nam. Trong đó, vô sinh do không có tinh trùng trong tinh
dịch (azoospermia) là một nguyên nhân vô sinh nam trầm trọng và khó điều
trị nhất. Theo các thống kê cho thấy gần 20% các cặp vợ chồng ở Mỹ vô sinh,
gần 25% các cặp vô sinh bị thiểu năng tinh trùng. Khoảng 2% các cặp vợ
chồng vô sinh có chồng là azoospermia. Như vậy azoospermia chiếm khoảng
8% bệnh nhân vô sinh nam.
Thông thường người ta chia azoospermia làm 2 loại là azoospermia do
tắc (obstructive azoospermia) và azoospermia không do tắc (non-obstructive
azoospermia).
Azoospermia do tắc: nhóm bệnh nhân này bao gồm bệnh nhân thắt ống
dẫn tinh, không có ống dẫn tinh, biến chứng tắc ống dẫn tinh sau các phẫu
thuật, tắc hệ thống dẫn tinh sau các viêm nhiễm. Ở các bệnh nhân này, trong
tinh hoàn vẫn xảy ra quá trình sinh tinh bình thường.
Azoospermia không do tắc: là nhóm bệnh nhân mà không thể thu được
tinh trùng từ mào tinh. Ở các bệnh nhân này, trong tinh hoàn không xảy ra
quá trình sinh tinh bình thường [4].
31


Ngày nay, đối với các bệnh nhân azoospermia do tắc (obstructive
azoospermia), bệnh nhân có thể thu tinh trùng từ mào tinh hoặc tinh hoàn để
tiến hành làm phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn
(intracytoplasmic sperm injection- ICSI). Kỹ thuật ICSI được thực hiện thành
công trên thế giới vào năm 1992 [17]. Hiện nay, kỹ thuật ICSI có thể áp dụng
cho tất cả trường hợp vô sinh do nam giới, trừ những trường hợp hoàn toàn
không có tinh trùng trong ống sinh tinh. ICSI có thể thực hiện với tinh trùng
từ tinh dịch, tinh trùng hút từ mào tinh hay tinh trùng sinh thiết từ tinh hoàn.
Hiện nay, ICSI được xem là phương pháp điều trị vô sinh nam hiệu quả nhất,
tỉ lệ có thai của một chu kỳ điều trị thường trên 30%.

Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc (non-obstructive
azoospermia), một số ít bệnh nhân vẫn có thể thu được tinh trùng từ ống sinh
tinh nhờ phương pháp TESE hoặc micro-TESE. Các bệnh nhân còn lại phải
xin tinh trùng, lượng bệnh nhân loại này rất lớn.
Bên cạnh đó, hàng năm có rất nhiều bệnh nhân nam giới bị ung thư các
loại khác nhau, đặc biệt là giai đoạn trước tuổi dậy thì, các bệnh nhân này
không thể có tinh trùng để lưu trữ giống như các bệnh nhân trưởng thành. Sau
quá trình điều trị hóa chất và phóng xạ, các bệnh nhân này sẽ trở thành vô
sinh thứ phát, không có khả năng có con sau này. Việc phân lập tế bào gốc
sinh tinh từ ống sinh tinh của các bệnh nhân này và lưu trữ các tế bào gốc sinh
tinh có ý nghĩa rất quan trọng không chỉ đối với các bệnh nhân azoospermia
không do tắc và còn rất quan trọng đối với các bệnh nhân nam giới trước tuổi
dậy thì sau quá trình điều trị ung thư, mở ra hy vọng có con cho họ sau này.
2.1.2. Ống sinh tinh
Ống sinh tinh có đường kính khoảng 150 - 250µm tuỳ theo các tác giả
khác nhau và dài từ 30 đến 70cm [1], [5], [53].
- Ống sinh tinh gồm các thành phần sau:

32


+ Lớp áo xơ bao phủ ống sinh tinh gồm vài lớp nguyên bào sợi và
nguyên bào sợi - cơ.
+ Thành ống tạo nên bởi 2 loại tế bào: tế bào Sertoli và các tế bào dòng
tinh, các tế bào dòng tinh xếp thành 4 - 8 lớp kể từ màng đáy cho đến lòng
ống sinh tinh, bao gồm: tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh bào II, tinh tử và tinh
trùng.
* Các tế bào dòng tinh
Tinh nguyên bào nằm thành một lớp trên màng đáy, đó là tế bào tương
đối nhỏ, kích thước khoảng 12 µm và nhân có nhiều hạt nhiễm sắc. Trong bào

tương có bộ máy Golgi nhỏ, các ty thể hình cầu và rất nhiều Ribosom tự do.
Trong thời kỳ trưởng thành các tinh nguyên bào trải qua một loạt quá trình
gián phân. Kết quả, chúng tạo thành các tế bào giống như các tế bào ban đầu
gọi là tinh nguyên bào nhóm A, đây là nguồn duy trì tiếp tục của tinh nguyên
bào. Chúng cũng có thể phân chia và phát triển thành tế bào lớn hơn tinh
nguyên bào lúc đầu gọi là tinh nguyên bào nhóm B, các tế bào này tiếp tục
phát triển trở thành tinh bào I.
Ngay sau khi được tạo thành, các tinh nguyên bào nhóm B bước vào kỳ
đầu lần phân chia thứ nhất của quá trình giảm phân, lúc này các tinh bào I có
46 nhiễm sắc thể. Quá trình phát triển của tinh bào I kéo dài đến hết lần 1 của
giảm phân, dài 22 ngày. Tinh bào I có kích thước lớn nhất trong các tế bào
dòng tinh và đặc trưng bởi sự có mặt của các nhiễm sắc thể ở các giai đoạn
khác nhau của quá trình xoắn bên trong nhân tế bào.
Qua lần giảm phân đầu tiên, tinh bào I trở thành các tế bào nhỏ hơn, gọi
là tinh bào II. Tinh bào II có 23 nhiễm sắc thể. Tinh bào II rất khó quan sát
trên tiêu bản tinh hoàn vì chúng tồn tại trong thời gian rất ngắn, rồi tham gia
quá trình giảm phân thứ hai.

33


Kết quả của quá trình phân chia tinh bào II tạo ra tiền tinh trùng. Đó là các
tế bào có kích thước nhỏ, đường kính 7 – 8 µm, có một hạt nhân với vùng nhiễm
sắc thể dày đặc. Vị trí của tiền tinh trùng là ở gần lòng ống sinh tinh.
Tiền tinh trùng phải trải qua một quá trình biệt hoá phức tạp gọi là quá
trình tạo tinh trùng, bao gồm các quá trình như sau:
- Bất hoạt bộ gen để bảo toàn sự hoạt động của toàn bộ gen sau này.
- Nhiễm sắc thể đóng xoắn lại, thuận lợi cho quá trình di chuyển và làm
nhân nhỏ lại. Cụ thể trong quá trình này, histone ở nhân được thay thế bằng
protamine, đây là chất giúp sắp xếp lại chuỗi ADN ở nhân gọn hơn. Nhân tế

bào tinh tử nhỏ lại và nằm sau thể cực đầu. Sau khi thụ tinh, các protamine ở
nhân tinh trùng lại được thay thế bằng histone. Tesarik và CS (2000) cho
rằng: sự thiếu hụt protamine sẽ cản trở quá trình hoàn thiện nhân trong giai
đoạn này [113].
- Sự hình thành các bộ phận làm thuận lợi cho sự tự vận động của tinh
trùng như đuôi được hình thành, đồng thời loại bớt bào tương, một trung thể
sẽ đến gắn vào 1 cực của nhân tinh trùng, đối diện với cực có cực đầu, để hình
thành sợi trục. Các ty thể sẽ biệt hóa thành những cấu trúc hình ống, xếp dọc
theo sợi trục, đóng vai trò là cơ quan tạo năng lượng cho hoạt động của đuôi
tinh trùng.
- Biệt hoá các cấu trúc giúp tinh trùng nhận diện được noãn và có khả
năng thụ tinh được với noãn như hình thành cực đầu. Kết thúc quá trình này,
tinh trùng được hình thành có hình dạng và cấu trúc đặc thù ở mức độ biệt hoá
cao và được giải phóng vào lòng ống sinh tinh.
Khoảng thời gian của quá trình từ tinh nguyên bào biệt hoá thành tinh
trùng là 72 ngày. Tuy nhiên để trưởng thành hoàn toàn về mặt chức năng, tinh
trùng phải trải qua một giai đoạn cuối cùng tại mào tinh khoảng 12 - 21 ngày.
Quá trình sinh tinh xảy ra không đồng thời cũng không đồng bộ ở các ống

34


sinh tinh. Điều này giải thích tại sao có thể gặp tinh trùng ở một số nơi của
ống sinh tinh, trong khi đó lại gặp tiền tinh trùng ở chỗ khác [1].
* Tế bào Sertoli
Tế bào Sertoli là một trong 2 loại tế bào cấu tạo nên biểu mô ống sinh
tinh. Hiện nay, tế bào Sertoli được xác định có vai trò quan trọng trong quá
trình biệt hoá cơ quan sinh dục trong giai đoạn phôi thai. Đặc biệt, tế bào
Sertoli có vai trò rất lớn quyết định đến quá trình sinh tinh của tinh hoàn.
2.1.3. Quá trình sinh tinh

Quá trình sinh tinh trải qua 3 giai đoạn sau:
+ Sinh tinh bào: là quá trình tinh nguyên bào phân chia, tạo ra tinh bào.
+ Giảm phân: sản xuất ra các tế bào tiền tinh trùng hay còn gọi là tinh tử.
+ Tạo tinh trùng: là quá trình biệt hoá tiền tinh trùng thành tinh trùng.
2.1.4 Các tế bào gốc sinh tinh
Tế bào gốc (stem cell) là quần thể các tế bào có khả năng tự phân chia
và tự đổi mới vô hạn định, ngoài ra còn có khả năng biệt hoá thành nhiều
dạng tế bào của các mô khác nhau.
Các tế bào gốc phôi, có ở phôi vào khoảng từ 3 đến 5 ngày sau thụ tinh.
Các tế bào này có khả năng tăng sinh vô hạn định và có thể tự biệt hoá thành tất
cả các dạng mô trong cơ thể. Vì vậy, các tế bào này được gọi là tế bào gốc vạn
năng (có khả năng biệt hoá thành dạng mô bất kỳ - pluripotent stem cell) [20].
Các tế bào gốc trưởng thành thì có tính đặc hiệu mô hơn, khả năng
phân chia và biệt hóa ít hơn. Do đó, các tế bào này được gọi là tế bào gốc đa
năng (chỉ có khả năng biệt hoá thành một số dạng mô cụ thể với số lượng hạn
chế – multipotent stem cell) [18].
Tính “thường biến” của tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành là
do các tế bào này có khả năng biệt hoá thành nhiều mô khác biệt với nguồn
gốc ban đầu của chúng. Vì vậy có khả năng phát triển qua lớp mầm phôi. Khả
năng tự tái tạo của tế bào gốc là đặc điểm rất quan trọng của chúng. Do đó các
35


tế bào gốc là nguồn tế bào chưa biệt hoá sơ khai. Ngược lại, hầu hết tế bào
sinh dưỡng có khả năng tự tái tạo hạn chế do đoạn cuối (telomere) của thể
nhiễm sắc bị co ngắn lại [35].
Hiện nay chúng ta có thể thu được tế bào gốc từ nhiều nguồn khác
nhau. Khả năng tạo ra nhiều chuỗi thế hệ của tế bào gốc phôi và tế bào gốc
trưởng thành đã được nghiên cứu và mô tả kỹ lưỡng qua nhiều nghiên cứu
khoa học. Cho dù tiềm năng của tế bào gốc phôi là vô cùng to lớn, nhưng việc

sử dụng các tế bào này gây ra nhiều vấn đề đạo đức đang còn tranh cãi. Do
vậy, đã có nhiều đề xuất dùng các tế bào gốc không phải từ phôi mà được lấy
từ chất đệm tuỷ xương, mô mỡ, bì, máu dây rốn và đặc biệt là trong các ống
sinh tinh làm nguồn tế bào có nhiều ứng dụng. Những tế bào này có thể biệt
hoá thành tế bào sụn, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo xương, nguyên bào cơ, tế bào
cơ tim, tế bào thần kinh đệm hình sao, tế bào gân và tinh tử, thậm chí tinh
trùng trong điều kiện in vitro và trải qua quá trình biệt hoá in vivo và điều đó
làm cho các tế bào gốc này được coi là những nguồn tế bào đầy triển vọng
cho việc sửa chữa khuyết tật ở trung phôi bì và phòng ngừa bệnh tật. Đặc biệt
việc phân lập và nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh sẽ mở ra hy vọng mới cho
các bệnh nhân azoospermia không do tắc và các bệnh nhân ung thư nam trẻ
tuổi sau điều trị hóa chất và tia xạ.
Ở người và động vật nhóm linh trưởng, Tinh nguyên bào có 2 loại là
tinh nguyên bào A và tinh nguyên bào B. Tinh nguyên bào A phân chia để tạo
thành tinh nguyên bào Apale và tinh nguyên bào Adark. Tinh nguyên bào Apale
lại tiếp tục phân chia, ở người tế bào này cứ 16 ngày lại phân chia 1 lần. Tinh
nguyên bào Adark là nguồn dự trữ tế bào gốc. Một nghiên cứu về tinh nguyên
bào, khi cho khỉ rhesus chiếu xạ, người ta nhận thấy số lượng tinh nguyên bào
Apale giảm sau 9 ngày chiếu xạ, trong khi đó số lượng tinh nguyên bào Adark
không đổi. Điều này cho thấy được sự khác nhau giữa khả năng phân chia tế
bào của các tế bào này. Vì tia xạ chỉ phá hủy các tế bào đang phân chia. Khi
36


có sự thiếu hụt tế bào, tinh nguyên bào Adark mới biến thành tinh nguyên bào
Apale và tiếp tục phân chia. Như vậy sự nằm im, không phân chia của tinh
nguyên bào Adark có chức năng giữ cho AND không bị tổn thương (khác với
động vật không phải linh trưởng) [3].
Vì vậy việc phân lập tốt các tế bào này rất quyết định đến khả năng
thành công sau nuôi cấy và cấy ghép sau này [17].

Các tế bào gốc sinh tinh là các tế bào nằm sát với màng đáy của ống
sinh tinh. Tế bào có nhân hình oval, hạt nhân nằm sát với màng nhân. Bào
tương sẫm màu với bộ máy Golgi nhỏ, ít ty thể và nhiều Ribosom tự do. Ngày
nay các nghiên cứu cho thấy CD24 và CD9 (CD9 còn có ở các tế bào gốc ở vị
trí khác) có ở tế bào gốc sinh tinh, không có CD34 [25].
Theo Shosei Yoshida, 2010 tỷ lệ các tế bào gốc sinh tinh của biểu mô
ống sinh tinh rất ít chỉ chiếm < 1% tổng số tế bào. Hiện nay người ta đã
nghiên cứu và nhận thấy có rất nhiều gen quyết định quá trình sinh tinh như
gen Plzf, một gen ức chế (transcriptional repressor). Nếu chuột mất gen này
thì quá trình sinh tinh không bình thường. Ngoài ra gen Bcl6b cũng giúp cho
việc duy trì sự tồn tại các stem cell. Ngoài ra các gen khác khi bị biến đổi
cũng làm thay đổi như Taf4b, Utp14b. Nhưng gen Etv5 ngoài tác động lên tế
bào stem cell còn tác động đến tế bào Sertoli. Gần đây người ta nhận thấy gen
nanos2 có vai trò then chốt trong việc duy trì và phát triển của stem cell [122].
Ở người tinh nguyên bào Adark được biết đến là tế bào có chức năng dự
trữ, rất ít phân chia trong điều kiện bình thường. Tinh nguyên bào Apale có
chức năng sinh ra các tế bào tiếp theo đó là tinh nguyên bào B; để sau đó
thành tinh bào [8].
Tanaka Atsushi, 2003 cho rằng tiêu chuẩn chọn tinh bào: đó là các tế
bào hình tròn, đường kính từ 12-15µm. Mito Kanatsu-Shinohara, 2004 cho
rằng CD9 chính là marker bề mặt để phát hiện các tinh nguyên bào ở chuột.
[22], [104].
37


2.1.5 Mào tinh
Ống mào tinh là một ống đơn, cong queo, độ dài khoảng 4 - 6m. Chính
ống này cùng mô liên kết xung quanh và mạch máu tạo nên thân và đuôi của
mào tinh hoàn. Biểu mô của mào tinh hoàn là biểu mô trụ cao giả tầng, gồm
có các tế bào đáy hình tròn và tế bào chính hình trụ. Các tế bào này nằm trên

màng đáy và bao quanh bên ngoài màng đáy là các tế bào cơ trơn và mô liên
kết lỏng lẻo giàu mạch máu. Sự co bóp của tế bào cơ trơn giúp tinh trùng di
chuyển dọc theo chiều dài của ống. Bề mặt của tế bào chính có các vi nhung
mao dài, không đều gọi là stereocilia. Các vi nhung mao này không có cả thể
gốc lẫn cấu trúc vi ống ở bên trong, trái lại, lông chuyển bình thường thì lại có
cả hai cấu trúc trên. Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, trong bào tương
của tế bào chính, lưới nội bào có hạt phát triển phong phú và bộ Golgi lớn
nằm bao quanh nhân không có hạt chế tiết trong bào tương. Các tế bào chính
tiết glycerophosphocholine, chất có thể ức chế quá trình tạo chất
(Capacitation), một quá trình chuẩn bị cho tinh trùng để thụ tinh. Đồng thời
các tế bào này cũng sản xuất ra glycoprotein, mà glycoprotein này gắn chặt
vào màng bào tương của tinh trùng nhưng chức năng của hiện tượng này chưa
rõ. Biểu mô của ống mào tinh tham gia vào quá trình hấp thu và tiêu hoá các
chất thải được bài tiết ra trong quá trình sinh tinh. Các tế bào đáy nhìn chung
là không được biệt hoá và có thể là tiền thân của tế bào chính. Bao xung
quanh biểu mô là lớp tế bào cơ trơn, mà càng về cuối ống mào tinh thì càng
trở nên dày hơn. Sự co bóp của tế bào cơ trơn có tác dụng đẩy tinh trùng ra
ngoài ống mào tinh. Chính vì vậy tại ống mào tinh không có các tế bào gốc
sinh tinh [1], [4], [14].
2.1.6. Các phương pháp phân lập tế bào gốc sinh tinh
Việc nghiên cứu phân lập các tế bào gốc sinh tinh đã có từ thập kỷ 60
của thế kỷ XX [47]. Cho đến nay đã có nhiều phương pháp phân lập tinh
nguyên bào khác nhau, với kết quả cũng rất khả quan.
38


2.1.6.1. Phương pháp Percoll
- Được các tác giả Bucci và CS, 1986; Morena và CS, 1996, Koh và
CS, 2004 thực hiện theo nguyên lý các tế bào có kích thước khác nhau sẽ bị
giữ lại khi đi qua lớp Percoll có nồng độ khác nhau [19]. Theo phương pháp

này, tỉ lệ làm giầu tinh nguyên bào có thể lên đến trên 80%. Tuy đây là
phương pháp có hiệu quả chưa cao, nhưng dễ áp dụng.
2.1.6.2. Phương pháp STAPUT
- Được Dirami và CS thực hiện 1999. Đây là phương pháp phân lập
tinh nguyên bào có dùng các enzyme EDTA-trypsin và DNase I để tách rời
các tế bào ở biểu mô ống sinh tinh. Sau đó, các tế bào được đưa vào buồng
phân tách tế bào (Staput chamber) với nguyên lý hoạt động dựa vào trọng
lượng khác nhau của các loại tế bào. Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp
không cao [19].
2.1.6.3. Phương pháp dùng kháng thể bề mặt FACS
- Phương pháp FACS (Fluorecence activated cell sorting) được
Shinohara và CS, 2000; Fujita và CS, 2005; Guan và CS, 2006; Geens M và
CS tiến hành năm 2007; Mucksová J, 2009. Tỉ lệ làm giầu tinh nguyên bào
theo phương pháp này lên đến 97%, tuy nhiên giá thành đắt đỏ do trang bị
máy móc và hóa chất cao phức tạp [91].
2.1.6.4. Phương pháp sử dụng màng nền (màng đáy – laminin)
Phương pháp này được Pasi P tiến hành vào năm 1985, theo nguyên lý
các tinh bào và tế bào Sertoli bám vào màng đáy khi nuôi cấy còn các tinh
nguyên bào thì không bám vào màng đáy, do đó nổi lên trên. Theo một số tác
giả hiệu quả của phương pháp này có thể đạt 80 – 95%, do vậy đây là phương
pháp phân lập tế bào gốc sinh tinh khá hiệu quả và dễ thực hiện [92].
2.1.6.5. Phương pháp dùng lực từ tính MACS
Phương pháp MACS (Magnetic cell sorting) do Von Schonfeldt và CS
thực hiện 1999; Vander Wee và CS thực hiện 2001; Buageaw và CS thực hiện
39


2005. Đây là phương pháp này dựa trên nguyên lý: các kháng thể gắn vào các
kháng nguyên đặc hiệu trên bề mặt tế bào, ví dụ như các kháng thể c-kit,
GFR-α-1, Thy-1, α-6 và β-1 integrin, CD-9 là một loại protein vận chuyển

qua màng (tetraspanin transmembrane protein). Nhưng nhược điểm của
phương pháp từ trường đó là, một số tế bào các kháng nguyên không biểu
hiện rõ ràng, điều đó dẫn đến số lượng các tế bào thu được ít và lẫn các tế bào
ít biệt hóa khác. Hơn nữa các tế bào này không thể phát triển một mình để tạo
thành một quá trình sinh tinh đầy đủ trong môi trường nuôi cấy [96]. Vì thế
phương phát d ùng lực từ tính MACS ít được ứng dụng trong phân lập tế bào
gốc sinh tinh, do vậy, có nhiều tác giả đã tiến hành nuôi cấy các tế bào dòng
tinh không cần phân lập tế bào gốc sinh tinh mà nuôi cấy các tế bào gốc sinh
tinh cùng với tế bào Sertoli và các tế bào dòng tinh [99].
2.1.6.6. Phương pháp Clump – picking
Phương pháp Clump-picking được một số tác giả thực hiện gần đây
như Sousa, 2002. Đây là phương pháp dựa vào đặc điểm hình thái các tế bào
dòng tinh dưới hệ thống kính hiển vi đảo ngược vi thao tác để tiến hành lựa
chọn các tế bào. Ví dụ như: Đặc điểm của tinh nguyên bào A, khi quan sát
dưới kính hiển vi đảo ngược là có một hay vài hạt nhân nổi lên màng nhân.
Trong nghiên cứu cho thấy sau 1 tuần nuôi cấy các tinh nguyên bào có thể nối
các nhánh bào tương lại với nhau [102].
2.1.6.7. Phương pháp Flow Cytometry.
Để làm “giàu” tế bào, dịch thu được sẽ được cho qua “Flow
Cytometry”, phương pháp này nhằm giữ lại các tế bào cần giữ. Nguyên lý giữ
lại dựa vào kích thước và tính chất của các hạt dương tính với “FITCpositive”. Các tế bào được nhuộm FITC-conjugated anti-rabbit antibody (F0382; Sigma) trong vòng 30 phút ở nhiệt độ từ 6-80C, để xác định tế bào nào
dương tính với FITC. Quá trình sau đó được thực hiện trên máy Beckman

40


Counter flow cytometer FC500 (Krefeld, Germany), với kích thước lỗ 505 –
545nm.
- Ngày nay phương pháp Flow Cytometry đã trở thành phương pháp
quan trọng trong việc, phân tích và phân loại các loại tế bào trong tinh hoàn.

Như chúng ta đã biết trong các tế bào từ tinh hoàn thì tinh tử tròn, tinh tử
đang kéo dài, đã kéo dài và tinh trùng đều có bộ nhiễm sắc thể la 1N, các tế
bào còn lại là 2N và 4N có ở một số giai đoạn của tinh bào và tinh nguyên
bào. Các tế bào từ tinh hoàn sẽ được nhuộm bằng phương pháp fluorescent
dye. Shino-hara và CS, 2000; Hermann và CS, 2009 đã sử dụng phương pháp
FC để đánh giá phương pháp phân lập tinh nguyên bào. Ryu và CS, 2005,
Geising A và CS, 2010 đánh giá các tế bào sau nuôi cấy [44].
2.2. Tổng quan về tế bào nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh
2.2.1. Kỹ thuật vi thao tác trong hỗ trợ sinh sản [trích dẫn từ 115]
- 1987 Laws King và CS đã tiêm tinh trùng vào khoang dưới màng
zona.
- 1988, Lanzendorf và CS là người đầu tiên tiêm tinh trùng vào bào
tương noãn.
- 1990, Silber và CS đã thành công với đứa trẻ đầu tiên ra đời từ thụ
tinh trong ống nghiệm bằng tinh trùng thu được từ mào tinh.
- 1992, Palermo và CS đã thực hiện thành công kỹ thuật ICSI cho bệnh
nhân thiểu năng tinh trùng nặng.
- Devoey và CS, 1994; Silber và CS, 1994 đã tiến hành thành công kỹ
thuật ICSI với tinh trùng lấy từ mào tinh [35].
- Với sự phát triển của kỹ thuật ICSI, nhiều nhà khoa học đã tiến hành
tiêm tinh tử, thậm chí cả tinh tử tròn vào bào tương noãn và đã thu được thành
công đáng kể. Tesarik và CS, 1995; Bernabeu và CS, 2000; Balaban và CS,
2000, đã tạo thành phôi từ các tinh tử và đã có những đứa trẻ khỏe mạnh ra
đời. Tuy vậy, tất cả các tác giả đều công bố tỷ lệ rất thấp [22], [23], [105].
41


- Hiện nay, nhiều tác giả đã tiến hành tiêm các tinh tử và tinh trùng sau
nuôi cấy vào bào tương noãn và đã thu được kết quả [23], [86], [102].
2.2.2. Nghiên cứu về nuôi cấy tế bào dòng tinh [trích dẫn từ 102]

Nghiên cứu nuôi cấy các tế bào dòng tinh đầu tiên được tiến hành cách
đây gần 1 thế kỷ (Goldschmit và CS, 1915; Champy và CS, 1920; Michailow
và CS, 1937) nhưng kỹ thuật nuôi cấy hết sức đơn giản.
De Felici và McLaren (1983) theo dõi sự tồn tại của tế bào sinh dục
nguyên thủy được phân lập ở phôi chuột từ 11,5-12,5 ngày tuổi, nuôi cấy
bằng các đĩa petri và thấy rằng chúng không thể tồn tại ở 370C trong bất kỳ hệ
thống nuôi cấy nào, nhưng có thể tồn tại ở 300C ít nhất 1 tuần. Các tế bào sinh
dục nguyên thủy không bước vào phân chia giảm nhiễm trong bất kỳ điều
kiện nuôi cấy nào nhưng có thể tiếp tục bước vào quá trình phân chia nguyên
nhiễm. Một số yếu tố, như yếu tố ức chế bạch cầu leukemia (LIF) có khả năng
chống lại yếu tố chết theo chương trình của tế bào sinh dục nguyên thủy (De
Felici. TGF – β1, AMPvòng, các polipeptit (PACAPs) của tuyến yên, và
vitamin A có tác dụng kích thích sự tồn tại phát triển của tế bào sinh dục
nguyên thủy.
Người ta cũng thấy rằng các tế bào sinh dục nguyên thủy hoặc các tế
bào dòng tinh cần đến môi trường có các tế bào thân để tồn tại và phát triển.
Điều này xác định là trong cơ thể tế bào sinh dục nguyên thủy không di cư
vào giải sinh dục thì chúng thoái hóa sớm.
Với các tiến bộ về phát triển các hệ thống nuôi cấy gồm nuôi cấy các tế
bào mầm phân tán hay tập trung hay được phân lập và làm sạch trước khi
nuôi cấy hoặc đồng nuôi cấy. Cùng với việc phát triển các công cụ thiết yếu
để theo dõi tốt hơn các tế bào dòng tinh trưởng thành cũng như phân tích mối
liên quan giữa tế bào Sertoli và các tế bào mầm.
Với mục đích làm giàu tế bào Sertoli và các đám nhỏ tế bào mầm khi bị
tách ra mà không bẻ gẫy các mối liên hệ của chúng. Kierszenbaum, 1994;
42


Rosalia Sa, 2008 đề xuất quy trình cho việc nuôi cấy tế bào Sertoli - tế bào
mầm như sau:

1. Dùng enzym để tách cấu trúc trung gian giữa tế bào Sertoli và tế bào
mầm càng ít càng tốt.
2. Tập hợp các đám lớn mật độ tế bào Sertoli để giữ trạng thái liên kết.
3. Sử dụng môi trường hóa học xác đinh bổ sung các hocmon như là
testosteron, các yếu tố phát triển.
4. Thường xuyên thay đổi môi trường nuôi cấy.
Kết quả cho thấy các tinh tử tròn có thể mọc đuôi trong môi trường
nuôi cấy và diển biến theo thời gian thay thế các histone trong các tinh
nguyên bào nuôi cấy là phù hợp với quan sát được trong tự nhiên
Trước đó Hadley et al, 1985 đã sử dụng một màng đáy tổng hợp và
thấy rằng một số tinh nguyên bào có thể phát triển thành tinh bào 1 trong môi
trường nuôi cấy có tế bào Sertoli.
Từ giữa những năm 70, người ta đã làm giàu được các tế bào dòng tinh
ở các đoạn phát triển khác nhau. Tuy nhiên, việc loại bỏ các tế bào khỏi môi
trường sinh lý và nuôi cấy in vitro là vấn đề tiếp tục được nghiên cứu. Thứ
nhất, sự phân lập nguyên vẹn vài lớp tế bào dòng tinh là không thể thực hiện
được do sự liên quan đến cấu trúc phức tạp của tế bào Sertoli. Thứ hai, trong
nuôi cấy riêng biệt sự trao đổi chất của các tế bào dòng tinh có thay đổi rất
lớn và các tế bào này không thể tồn tại được vài giờ hay vài ngày (Grooteged
et al, 1977, 1989; Jutte et al, 1981, 1982; Le Magueresse và Jégou, 1988;
Matsui et al 1991; Risley và Morse-Gaudio, 1992) do chúng rất dể bị tổn
thương khi phân lập. Các tế bào dòng tinh, đặt biệt là các tinh tử có thể tổng
hợp nhiều protein khác nhau trong thời gian nuôi cấy ngắn hạn (Gerton và
Millette, 1986). Tuy nhiên, người ta không biết là các sự kiện này có đúng
sinh lý hay không hoặc là chúng phản ứng lại các kích thích trong điều kiện
nuôi cấy, bởi vì các tế bào không chết ồ ạt trong các điều kiện thử nghiệm
43


này. Các tinh tử ở chuột có thể mọc đuôi trong vòng 24h nuôi cấy. Nhiệt độ

tốt nhất để các tế bào dòng tinh hoạt động (đặc biệt là tinh tử) là 340C. Lactat
và pyruvat làm chất nền cho các tế bào dòng tinh và tinh tử sớm tốt hơn
glucoza trong môi trường nuôi cấy do chúng không bị chuyển hóa.
Người ta thấy rằng tinh bào I được phân lập từ chuột chưa trưởng thành
đã được điều trị trong nuôi cấy với axit okadaic, một loại phosphatase có khả
năng ức chế mạnh, đã đạt được phân bào giảm nhiễm trong vòng vài giờ khác
với quá trình tương tự trong tự nhiên phải mất vào ngày (Handel et al, 1995;
Tarsounas et al, 1999), vì thế axit okadaic có khả năng khiến tế bào đi tắt đến
giai đoạn phân chia giảm nhiễm. Nếu cơ chế này cho phép sẽ rất có giá trị vì
hầu hết tế bào dòng tinh bị ngưng trệ ở trung kỳ bởi vì chúng thiếu thoi phân
bào giảm nhiễm. Điều này chứng tỏ rằng các tế bào mầm bị thoái hóa sau khi
quá trình sinh tinh bị suy giảm một cách nghiêm trọng.
Tất cả các thử nghiệm nuôi cấy được thực hiện với các tế bào dòng tinh
phân lập và làm sạch ở động vật và người cho thấy rằng sự khác biệt của
chúng là rất lớn và phụ thuộc vào sự hỗ trợ của tế bào Sertoli, điều này phù
hợp với kết luận của Wolff và Haffen (1965).
Kỹ thuật này mở ra một triển vọng hết sức to lớn về điều trị vô sinh
nam, bảo vệ các loài đang bị tuyệt chủng, về công nghệ cấy chuyển gen động
vật và để xác định nguồn gốc ngưng trệ quá trình sinh tinh trong đột biến hoặc
các động vật thí nghiệm bị thay đổi (Brinster và Nagano, 1998; Johnson,
2000; Schlatt, 2000; Hill, 2006).
Tế bào Sertoli là tế bào nuôi dưỡng cho các tế bào dòng tinh, do đó có
rất nhiều nỗ lực dành cho việc nghiên cứu và phát triển nuôi cấy tế bào này.
Tế bào Sertoli lần đầu tiên được Dorringon, Steinberger, Welsh và Wiebe
phân lập và nuôi cấy 1975 từ tinh hoàn chuột. Yếu tố chính của kỹ thuật này
là sử dụng enzyme, ly tâm các đám tế bào Sertoli và lọc rửa. Ngày nay kỹ
thuật này đã được cải tiến, thành cơ bản thường qui. Các động vật chưa
44