Biểu hiện gen tái tổ hợp trong

Chương 7
Biểu hiện gen tái tổ hợp
trong
Escherichia coli


Mở đầu
O Vector biểu hiện là vector có thể mang

các gen ngoại lai mong muốn cho phép
thực hiện sự phiên mã của các bản sao
được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA
của chúng trong Escherichia coli hay nấm
men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc
Aspergillus niger…


Các phương pháp và các
plasmid vector được sử dụng
để sản xuất các protein dung
hợp (fusion protein) và các
protein nguyên thể (native
protein) trong vi khuẩn


I. Sản xuất các protein dung hợp

1. Protein dung hợp
Gen dung hợp
ATG Gen B

Promoter

Gen A

DNA
SD
AUG

mRNA
SD
Met
N

Protein dung hợp

 SD: đoạn Shine-Dalgarno

C


Ưu điểm của protein dung hợp
 Được sản xuất với hàm lượng lớn do sự khởi đầu
phiên mã và dịch mã được điều khiển bởi các
trình tự tiêu chuẩn của E. coli
 Cho kết quả các sản phẩm ổn định hơn các
protein ngoại lai nguyên thể.
 Khối lượng phân tử lớn hơn so với hầu hết các
protein của E. coli  dễ nhận biết bằng điện di.
 Có thể được tiết ra môi trường nhờ biểu hiện của
vi khuẩn .

EcoRI

5000

2. Các hệ
thống
vector
biểu hiện
các gen
dung hợp
với gen
lacZ

Vùng tạo dòng

Pst I

Ampr
4000

1000

pUR278
(5,2 kb)

lacZ

ori

Plac
3000

Vùng tạo dòng

lacZ

lac UV5

2000

pUR278

TGTCAAAAAGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT G
BamHI
Sal I
XbaI
HindIII
ClaI

pUR288

TGTCGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT GAT
BamHI
SalI
XbaI HindIII
ClaI

pUR289

TGTCAGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT GA
BamHI
SalI
XbaI
HindIII
ClaI

pUR290

TGTCAAAAAGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCGATGA
BamHI
SalI
PstI
HindIII
ClaI

pUR291

TGTCGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCG ATG
BamHI
SalI
PstI
HindIII
Cla I

pUR292

TGTCAGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCG AT
BamHI

SalI
PstI
HindIII
ClaI


0

Phần tận cùng amino
của gen lacZ được
thay thế bằng một số
trình tự của gen cro
của bacteriophage λ
và gen lacI của E. coli.
- Stop: các codon
kết thúc dịch mã.
- Term: tín hiệu kết
thúc phiên mã của
bacteriophage fd

R

P

5000

cro

Ampr

lacI

pEX2 (5,8
kb)
4000

1000

lacZ

ori
2000

Vùng tạo dòng
3’

Term
Stop

3000

Vùng tạo dòng
PR cro

lacZ

EcoRI

BamHI

SmaI

PstI

SalI


3 Xây dựng plasmid biểu hiện và phát
hiện các protein dung hợp
Plasmid
vector

Khuẩn lạc mang
DNA ngoại lai
- Tách chiết DNA
plasmid vector,
cắt hạn chế
- Điện di

Dna ngoại lai

Sự dung hợp
trong khung đọc

Sàng lọc khuẩn
lạc sản xuất
protein dung hợp

chủng K12 71/18
hoặc JM 103 cho

các vector pUR
Vi khuẩn
E.coli

chủng M5219 cho
các vector pEX


Phương pháp sàng lọc
Tiểu thể

5-10 khuẩn lạc
LB(ampicillin)

Qua đêm, 37oC

1xSDS

Tái huyền phù

Bổ sung thêm IPTG
pU
R

37oC

Biến tính 100oC,3

40oC pE

X

phút

1 phút Ly tâm 1200g Nhiệt độ
phòng

1,2,3,4 giờ

1mL

Ly tâm

Dịch nuôi cấy

Điện di SDS

Kết quả

polyacrylamide
gel 6%


4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất
kháng thể
Có thể tách chiết theo một số cách: dùng dịch chiết
urea, sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside,
điện di SDS-polyacrylamide gel hoặc phối hợp giữa
các cách này
Sau khi điện di (ở

mục 3)

Nhuộm gel và
phát hiện băng
protein mới

Sản xuất
kháng thể

Cắt khỏi gel,
đem đông khô
khoảng 48h
Nghiền
thành
bột mịn
Tiêm vào
thỏ


II. Sản xuất các protein nguyên thể
Promoter

TAC

DNA

Gen A

SD
AUG

mRNA
SD
Protein nguyên thể

N

Met
C

 Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E. coli
bằng cách sử dụng promoter điều hòa mạnh và một trình tự
liên kết ribosome hiệu quả.
 Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome
mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ.


Các vector biểu hiện
mang promoter PL của
bacteriophage λ, promoter
(lai) trp-lac và promoter
bacteriophage T7.


1. Promoter PL của bacteriophage λ

 Đoạn chèn cDNA
mang
tín
hiệu
promoter (PL), một

vị trí được nhận
biết bởi sản phẩm
của gen N (nutL),
bản thân gen N, và
tín hiệu kết thúc
phiên
mã
phụ
thuộc rho (tL). Vị trí
nhận biết HpaI nằm
với vùng mã hóa
của gen N.

EcoRI 0
HindIII

6000

λ

1000

Ampr
PL

pKC30
(6,4 kb)

5000

nutL
N

HpaI

2000

ori

tL

4000

BamHI
3000


2. Promoter trp-lac
Hình 6. Vector
pKK177-3. pKK177-3
là một tac vector
chứa các vị trí tạo
dòng gen ngoại lai
cùng hướng với
promoter tac. Cùng
hướng với các vị trí
tạo dòng là rrnB
mang gen 5S của E.
coli và hai nhân tố kết
thúc phiên mã T1 và

T2.

Vùng tạo dòng

tac

P

5S
T1

T2

Ampr

pKK177-3
(2,9 kb)

ori

2000
1000

Vùng tạo dòng
Ptac

SalI

EcoRI
SmaI

HindIII

PstI


3. Promoter bacteriophage T7
Cho phép mức độ biểu hiện cao của
một vài gen không được biểu hiện
hiệu quả trong các hệ thống khác.

EcoRV

EcoRI 0

NheI
EcoRV

ClaI

TФ

4000

PstI

NheI

BamHI

NdeI

S10
PФ10
BglII

Ampr

1000

ori

pET-3a
(4,6 kb)

3000

Vector pET-3 mang promoter
(PФ10) của bacteriophage T7 Ф10
và yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ)

2000


Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của
một vài yếu tố:
- Mức độ bổ sung giữa chuỗi SD và đầu 3’ của 16S rRNA.
- Khoảng cách giữa chuỗi SD và codon AUG để chuỗi DNA
của eukaryote định vị.
- Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng sự liên kết ribosome.

III. Xác định mức độ biểu hiện của
gen được tạo dòng
Điện di
polyacrylamide gel
- protein quan
tâm có thể quan
sát bằng cách
nhuộm gel với
Coomassie
Brilliant Blue
hoặc bằng
thuốc nhuộm
bạc

Phân tích
Western blot
bằng lk đặc
hiệu kháng
thể-kháng
nguyên
thực hiện diện
di SDS-PAGE

Nếu mức độ biểu hiện thấp thì
nên đặt gen lacZ cùng hướng
với gen được biểu hiện.
Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc
dịch mã hạn chế biểu hiện của

gen thì những thay đổi trong hệ
thống biểu hiện có thể được
kiểm soát bằng những thay đổi
trong hoạt tính của βgalactosidase.


Protein gel (điện di SDS)

Hình 9. Sơ
đồ kỹ thuật
Western blot

Thẩm tích protein lên
màng nitrocellulose
Kháng thể 1 đặc hiệu
Gắn kháng thể 1 với protein
kháng nguyên
Kháng thể 2 có đánh dấu
enzyme
Gắn kháng thể 2 với kháng thể
1
Bổ sung cơ chất
Phát triển màu


Kháng thể 2 (thỏ/chuột) liên
AP

kết alkaline phosphatase

AP

Kháng thể 1 (thỏ/chuột)
AP

Protein kháng nguyên

Hình 10. Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể
thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme trong
Western blot


Hình 7.11. Sơ đồ kỹ thuật ELISA
Kháng nguyên được gắn
lên giếng
Kháng thể 1

Kháng thể 2
liên kết enzyme

Một giếng trong đĩa ELISA

Đĩa ELISA (microtiter plate) có 96 giếng

Enzyme
trong phức
hợp kháng
nguyênkháng thể
bắt màu
với cơ chất

IV. Tăng mức độ biểu hiện của gen được
tạo dòng
Cho DNA ngoại lai
Kiểmđược
tra bằng
dung hợp với
thử nghiệm
đoạn tương ứng của
gen lacZ
chứa năng,
xét

nghiệm miễn
Các plasmid có các
dịchđoạn
khác
promoter được
nhau
đặt tối ưu có thể nhận

Phức
tạp

biết bằng cách biến nạp
vi khuẩn Lac- và thu
được hoạt tính βgalactosidase trên các
đĩa chỉ thị lactose

Plasmid được dùng là
pLG mang gen lacZ
mã hóa đầu tận cùng
Khắc
carboxyl
có hoạt tính βphục
galactosidase
Mức độ biểu hiện thấp:
do RNA không ổn
định, sự kết thúc chưa
hoàn chỉnh, sự dịch mã
không hiệu quả, hoặc
chính protein không ổn
định


V. Tinh sạch protein
1

Thể vùi và phương pháp hòa
tan thể vùi

2

Các đuôi ái lực


1

Thể vùi và phương pháp

hòa tan thể vùi

Protein có mức độ biểu hiện cao trong E. coli
thường tạo ra các hạt nhỏ không hòa tan ở trong
tế bào chất

Thể
vùi

Ly tâm
Tiểu
thể

+
Rửa với Triston X-100 và EDTA hoặc urea


Phương pháp hòa tan thể vùi
Làm
tan tế
bào

Ly tâm

Tái
huyền
phù

PMSF
RT,và

20lysozyme
phút

Bổ sung
deoxycholic
acid
37oC và khuấy

30 phút ở RT

Bổ sung
DNase I


Phương pháp hòa tan thể vùi
Phương
pháp 1
Ly tâm
Ly tâm
Trong nước,15’

điện di

Tinh
sạch và
rửa thể
vùi
tái huyền phù

RT, 5 phút

tái huyền phù
đệm 2xSDS gel-loading dye

Phương
pháp 2