Bước đầu xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu và sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin 0,1% từ cá nóc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CHU THỊ NHƢ QUỲNH

BƢỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU
CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM
BỘT ĐÔNG KHÔ CHỨA TETRODOTOXIN 0,1%
TỪ CÁ NÓC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CHU THỊ NHƢ QUỲNH

BƢỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU
CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM
BỘT ĐÔNG KHÔ CHỨA TETRODOTOXIN 0,1%
TỪ CÁ NÓC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển
2. PGS.TS. Trần Việt Hùng

HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết sơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn
PGS.TS. Trần Việt Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS.TS.
Nguyễn Mạnh Tuyển - Trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực
tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong
suốt quá trình triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô Ban giám hiệu,
Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn hóa phân tích và các bộ môn khác của
Trường đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và cán bộ Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương, cán bộ Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ
Việt Nam, Viện Pháp y Quốc gia và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực hiện nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2015
Học viên

DS. Chu Thị Nhƣ Quỳnh

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

3

1.1. TETRODOTOXIN

3

1.1.1. Danh pháp, công thức và tính chất hóa lý của TTX

3

1.1.2. Độc tính và tác dụng TTX

4

1.1.4. Ứng dụng của TTX trong y học

7

1.1.5. Nguồn cung cấp TTX

9

1.2. CÁ NÓC

10

1.2.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của cá nóc

10

1.2.2. Độc tố trong cá nóc

11

1.2.3. Thành phần độc tố trong cá nóc

11

1.2. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX

12

1.2.1. Phƣơng pháp sinh hóa trên chuột (MBA)

12

1.2.2. Phƣơng pháp ELISA

13

1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với các detector UV, FLD

14

1.2.4. Phƣơng pháp khối phổ

15

1.2.5. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GS-MS

17

1.2.6. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ

17

1.2.7. Xác định cấu trúc bằng cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

18

1.3. BỘT ĐÔNG KHÔ TTTX 0,1%

20

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƢỢNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

23

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

23

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

23

2.2.1. Nguyên liệu

23

2.2.2. Dụng cụ, máy móc, thiết bị

24

2.2.3. Hóa chất

26

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị mẫu

26
26


2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng TTX

27

2.3.3. Xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô và sản phẩm

bột đông khô TTX 0,1%

31

2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

33

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

34

3.1. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX

34

3.1.1. Định tính TTX bằng TLC

34

3.1.2. Định tính TTX bằng ESI-MS/MS

35

3.1.3. Xây dựng phƣơng pháp định tính định lƣợng TTX bằng LC-MS/MS 37
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN
LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ TTX 0,1%
3.2.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô

44

44

3.2.2. Kết quả xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng bột đông khô TTX 0,1% 51
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

55

4.1. VỀ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX

55

4.2. VỀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN
PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ TTX 0,1%

58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

62

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

Atmospheric pressure chemical

Ion hóa hóa học ở áp suất khí

ionization

quyển

CI

Chemical Ionization

Ion hóa hóa học

ESI

Electron spray ionization

Ion hóa phun sƣơng điện

FAB

Fast atom bombardment

Bắn phá nhanh nguyên tử

APCI

GC-MS

HILIC

HPLC

HR FTICR
MS
ICP-MS
LC-MS

Gas chromatography - Mass
spectrometry

Sắc ký khí khối phổ

Hydrophilic interaction liquid

Sắc ký lỏng tƣơng tác thân

chromatography

nƣớc

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High resolution fourier
transform ion cyclotron

Phổ khối phân giải cao

resonance mass spectrometry
Inductively coupled plasma
Liquid chromatography–mass
spectrometry

Phổ khối phân tích nguyên tử
Sắc ký lỏng khối phổ
Liều gây chết 50% động vật

LD50

Lethal dose 50

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

Matrix assisted laser

Phản hấp thụ và ion hóa bằng

desorption ionization

laser

Median lethal dose

Liều chết trung bình

MALDI
MLD

thí nghiệm


NMR

Nuclear magnetic resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân

SRM

Selected reaction monitoring

Chế độ chọn lọc ion

TTX

Tetrodotoxin

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số thông tin về độ độc của TTX và analog

7

Bảng 3.2. Khảo sát một số điều kiện sắc ký

38

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống

41

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phƣơng pháp

41

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại

42

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ thu hồi

43

Bảng 3.7. Hàm lƣợng TTX trong TTX thô

44

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ của 6 chất đƣợc phân lập

45

Bảng 3.9. TTX và 5 analog trong TTX thô

50

Bảng 3.10. Độ ẩm bột đông khô TTX 0,1%

52

Bảng 3.11. Tiêu chuẩn chất lƣợng bột đông khô TTX 0,1%

52


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phẳng (A) và cấu trúc 3-D (B) của phân tử TTX

3

Hình 1.2. Cấu trúc một số analog của TTX

6

Hình 1.3. Một số loài chứa độc tố TTX trong tự nhiên [47]

10

Hình 1.4. Kỹ thuật ESI-MS

16

Hình 1.5. Sơ đồ khái quát các nội dung nghiên cứu dự án

20

Hình 2.6. Hình ảnh 2 mẫu cá nóc

23

Hình 2.7. Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo Finigan LCQ Advantage Max

24

Hình 2.8. Hệ thống LC-MS ba tứ cực nối tiếp Thermo TSQ Quantum Ultra

25

Hình 2.9. Hệ thống phổ khối phân giải cao Varian 900-MS Series FTMS

25

Hình 2.10. Thiết bị cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500FT- NMR
BioSpin NMR

25

Hình 2.11. Thiết bị đông khô Modulyod (Thermo)

25

Hình 2.12. Quy trình chiết xuất TTX thô

31

Hình 3.13. Bản mỏng triển khai trên hai hệ pha động

34

Hình 3.14. Khảo sát LOD của phƣơng pháp TLC

35

Hình 3.15. Phổ ESI - MS mẫu chuẩn TTX 1μg/ml

36

Hình 3.16. Phổ MS/MS của chuẩn TTX 1 μg/ml

36

Hình 3.17. Phổ MS/MS của bột đông khô TTX 0,1%

37

Hình 3.18. Sắc ký đồ phân tích TTX theo điều kiện sắc ký A, B, C, D

39

Hình 3.19. Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo (a), mẫu TTX chuẩn 2,5µg/ml (b),
mẫu thử bột đông khô (c)

40

Hình 3.20. Đồ thị biểu hiện mối tƣơng quan nồng độ TTX và diện tích píc

42

Hình 3.21. Lọ bột đông khô TTX 0,1%

51


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc thần kinh mạnh và hiện nay chƣa
có thuốc giải độc [12]. Là một chất độc nhƣng TTX lại có những tác dụng có

ý nghĩa lớn trong y học: giảm đau trong ung thƣ; phòng tan huyết trong nhồi
máu cơ tim; dùng làm thuốc cai nghiện, thuốc gây tê; dùng trong nghiên cứu
sinh lý màng tế bào…[4], [22], [27]. TTX cho hiệu quả điều trị chỉ với mức
liều thấp thấp cỡ microgam/kg [4], [29]. Đặc biệt, TTX có tác dụng giảm đau
mạnh hơn morphin nhƣng không gây nghiện [19]. Rõ ràng, TTX có nhiều ƣu
điểm hơn so với các thuốc hiện sử dụng.
Với nhiều tác dụng ý nghĩa nhƣng là chất độc mạnh nên những năm
gần đây TTX mới đƣợc nghiên cứu và phát triển thành sản phẩm thuốc. Hiện
nay, công ty WEX Pharmaceticals Inc. Canada đang phát triển các sản phẩm
chứa TTX làm thuốc giảm đau trong điều trị ung thƣ, thuốc gây tê [4], [9]. Tại
Việt Nam, Bùi Quang Huấn và cộng sự cũng đã sử dụng chiết xuất từ cá nóc
chứa TTX trong chế phẩm Bahudo dùng làm thuốc điều trị cai nghiện [7].
Các sản phẩm đã đƣợc nghiên cứu thử nghiệm trên lâm sàng cho hiệu quả
điều trị tốt với độc tính của TTX đƣợc kiểm soát. Nhƣ vậy, tiềm năng sử dụng
TTX trong bào chế các sản phẩm làm thuốc rất lớn.
Hiện nay, TTX chủ yếu là chiết xuất, phân lập từ các nguồn tự nhiên,
trong đó cá nóc vẫn là nguồn cung cấp chính [4], [18], [30]. Tại Việt Nam, cá
nóc mới đƣợc quan tâm là một thực phẩm có giá trị thƣơng mại lớn [1] nhƣng
chƣa đƣợc quan tâm khai thác phục vụ y học. Trong khi đó, biển Việt Nam
cho có tiềm năng khai thác TTX từ cá nóc lớn với khoảng 21 loài đã đƣợc xác
định có mang độc tố [13].
Với nhiều tác dụng có ý nghĩa cho chăm sóc sức khỏe cộng đồng và sử
dụng nguồn nguyên liệu sẵn có. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
(VKNTTW) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình
phân lập tetrodotoxin (TTX) và một số độc tố thần kinh từ họ cá nóc
1


(Tetradontidae) ở biển Việt Nam có khả năng ứng dụng trong y học”. Một
trong các nội dung của đề tài này là bào chế sản phẩm bột đông khô chứa

TTX 0,1% dùng làm nguyên liệu phục vụ cho sản xuất thuốc. Nhằm kiểm
soát tốt việc bào chế sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài “Bước đầu xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên
liệu và sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin 0,1% từ cá nóc” với các
mục tiêu chính nhƣ sau:
1. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng TTX.
2. Xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu và sản phẩm bột đông
khô TTX 0,1%.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TETRODOTOXIN
1.1.1. Danh pháp, công thức và tính chất hóa lý của TTX
1.1.1.1. Danh pháp, công thức của TTX
Tên IUPAC: (4 R, 4a R, 5 R, 6 S, 7 S, 8 S, 8a R, 10 S, 12 S)-2azaniumylidene - 4, 6, 8, 12 - tetrahydroxy - 6 - (hydroxymethyl) - 2, 3, 4, 4a,
5, 6, 7, 8 – octahydro - 1 H - 8a, 10 – methano - 5, 7 - (epoxymethanooxy)
quinazolin – 10 - olate.
Công thức phân tử: C11H17N3O8.
Phân tử lƣợng: 319,27 g/mol.

(A)

(B)

Hình 1.1. Cấu trúc phẳng (A) và cấu trúc 3-D (B) của phân tử TTX
1.1.1.2. Tính chất hóa lý của TTX
TTX tinh khiết là bột tinh thể không màu, không mùi, sẫm màu ở
khoảng 2200C nhƣng không phân hủy [22].

Nhiệt độ nóng chảy 2250C [24].
Độ tan: TTX không tan trong các dung môi hữu cơ (ether,
chlorofom,…) do có một vài nhóm hydroxyl. Khung phân tử có cấu trúc lồng
nên TTX khó bị hydrat hóa nên TTX ít tan trong nƣớc. TTX tan trong các
3


dung dịch axít do có chứa nhóm guanidin perhydroquinazolin có tính kiềm.
TTX cũng có cấu trúc nội este, nên dễ bị các dung dịch axít mạnh hoặc kiềm
mạnh phân hủy. Do tính tan đặc biệt nên cách duy nhất giữ TTX bền vững
trong dung dịch là hòa tan trong axít hữu cơ yếu [42].
TTX có pKa (H2O) = 8,76; pKa (50% alcol) = 9,4 [51].
TTX là chất phân cực mạnh [33].
1.1.2. Độc tính và tác dụng TTX
1.1.2.1. Độc tính
TTX là một độc tố thần kinh có hoạt lực cao có thể gây chết ngƣời khi
dùng qua đƣờng uống với liều 1-2mg [55]. Hiện vẫn chƣa có thuốc giải độc
TTX [57]. Khi bị nhiễm độc, TTX dễ dàng có thể gây ra cái chết nhanh và dữ
dội nhất [18]. Liều chết của TTX gấp 10 lần nọc rắn hổ mang, khoảng 10-100
lần liều gây chết của độc tố nhện cái đen và 10.000 lần liều chết của cyanid
khi thử nghiệm trên chuột [4]. LD50 của TTX trên chuột nhắt theo đƣờng tiêm
tĩnh mạch là 8,7µg/kg, đƣờng tiêm dƣới da là 16μg/kg và đƣờng uống là
332μg/kg [26].
Hàng năm, có nhiều vụ ngộ độc TTX do ăn cá nóc. Tại Nhật bản, trung
bình hàng năm có khoảng 200 ca ngộ độc với tỉ lệ chết ƣớc tính là 50%.
Ngoài ra, rải rác một số trƣờng hợp ngộ độc TTX do ăn cá nóc cũng đƣợc ghi
nhận tại Mỹ và các nƣớc nằm ngoài vùng Ấn Độ – Thái Bình Dƣơng [55],
[57]. Ở Việt Nam, từ năm 1999 – 2003 có tổng số 176 vụ ngộ độc thực phẩm
liên quan đến cá nóc. Năm 2002, Bộ Y tế đã ra Quyết định 354/2002/QĐBYT [3] ban hành bản hƣớng dẫn chuẩn đoán, xử trí và phòng ngộ độc cá nóc
để nhằm giảm bớt nguy cơ tử vong do ngộ độc cá nóc.

1.1.2.2. Tác dụng của TTX
TTX phong tỏa đặc hiệu kênh Na+ trên bề mặt màng tế bào thần kinh ở
bên ngoài kênh, làm ức chế ức chế dẫn truyền ion Na+ đi vào trong tế bào nên

4


làm mất sự dẫn truyền thần kinh và phản xạ co cơ. Do đó gây ra tác dụng
giảm đau của TTX [26].
Tác dụng giảm đau, gây tê của TTX rất mạnh [26], [48]. Chỉ với một
liều nhỏ cỡ microgam TTX đƣợc sử dụng có thể đem đến kết quả giảm đau ít
nhất 2-3 tuần [45]. Để kìm hãm hoạt động của hệ thần kinh bằng cocain phải
cần đến hàm lƣợng 500g nhƣng TTX thì chỉ cần khoảng 0,03g. Nhƣ vậy,
hiệu quả tác dụng của TTX mạnh gấp 60.000 lần cocain [48].
Dù ức chế dẫn truyền thần kinh và thần kinh cơ thông qua kênh Na+
nhƣng lại không làm thay đổi tính thấm của ion K+ [26]. TTX tác động lên cả
thần kinh trung ƣơng lẫn ngoại vi liên quan các hệ thông thần kinh cơ, tim
mạch, hô hấp gây ra các tác dụng: mạch nhanh, huyết áp hạ, rối loạn nhịp tim,
khó thở, choáng váng, đau đầu, rối loạn cảm giác, yếu cơ, liệt chi dƣới, mất
phản xạ tủy và phản xạ gân xƣơng, …
TTX cũng có tác động lên vi khuẩn HIV typ 1 (HIV-1) thông qua tác
động vào hoạt động của gp-120 trên lớp vỏ HIV-1. Gp120 đóng vai trò có ý
nghĩa trong việc gây độc tế bào thần kinh. Do TTX khóa kênh Na+, gây ảnh
hƣởng tới việc khử cực màng tế bào nên ngăn sự giải phóng các chất độc nhƣ
cytokin gây độc tế bào thần kinh ở những bệnh nhân HIV/AIDS [25].
1.1.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của TTX và các analog
TTX đƣợc đặt bởi Yoshizumi Tahara năm 1909 sau khi đƣợc phân lập
từ buồng trứng của cá nóc. Cấu trúc của TTX đƣợc tính toán bởi R. B.
Woodward năm 1964 [55]. Analog của TTX đƣợc hiểu là dẫn xuất của TTX
có hoạt tính sinh học tƣơng tự TTX, liên kết cùng vị trí trên đơn vị alpha của

kênh Na+ nhƣ là TTX [30].
Có 26 analog tự nhiên đƣợc tìm thấy của TTX [55]. Một số analog là
dạng cân bằng hóa học với TTX thƣờng có trong chiết xuất TTX nhƣ 4-epi
TTX, 4,9-anhydro TTX. Các deoxy analog (5-deoxy TTX, 11-deoxy TTX,

5


6,11-dideoxy TTX và 5,6,11-trideoxy TTX), 11-oxo TTX, 4-S-cysteinyl
TTX) không phải là dạng cân bằng với TTX [38], [47], [55].

R1

R2

R3

R4

R5

H

OH

OH

CH2OH

OH

4-epi TTX

OH

H

OH

CH2OH

OH

6-epi TTX

H

OH

CH2OH

OH

OH

11-deoxy TTX

H

OH

OH

CH3

OH

6,11-dideoxy TTX

H

OH

H

CH3

OH

8,11-dideoxy TTX

H

OH

OH

CH3

H

11-oxo TTX

H

OH

OH

CH(OH)2

OH

11-nor TTX-6,6-diol

H

OH

OH

OH

OH

11-nor TTX-6(R)-ol

H

OH

H

OH

OH

TTX

Hình 1.2. Cấu trúc một số analog của TTX
Tuy có hoạt tính sinh học tƣơng tự nhau, nhƣng hoạt lực giữa TTX và
các analog khác nhau rất nhiều: độc tố của TTX là 4.500 MU, 4-epi TTX là
710 MU và 4-epi anhydro TTX chỉ là 92 MU [43].
Độc tính analog của TTX là dựa trên số và vị trị nhóm hydroxyl có mặt
trong cấu trúc. Yotsu –Yamaashita và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của
sự biến đổi đặc trƣng của một số nhóm hydroxyl của TTX trong ái lực của nó
tới màng não chuột [59]. Kết quả chỉ ra rằng hydroxyl tại C-6 và C-11 trong
khung TTX đóng một vai trong quan trong trong liên kết các chất độc này với

6


kênh Na+, tác động nhƣ phân tử cho tạo liên kết hydro. Trong nghiên cứu gần
đây, Yang và Kao chỉ ra rằng hydroxyl tại C-4, C-6, C-9, C-10, C-11 cũng
đóng vai trong liên kết với kênh Na+. Thêm nhóm hydroxyl vào C-11 trong
11-oxo TTX tạo liên kết chắc chắn với kênh Na+ bằng liên kết hydro mạnh
hơn TTX nên làm cho 11-oxo TTX là độc hơn TTX khoảng 4-5 lần [52]. 5deoxy TTX, 5,6,11-trideoxy TTX, 4-Cys TTX và anhydro TTX là có độc tính
không đáng kể. Độc tính của 5,6,11-trideoxy TTX là ít hơn TTX vì nó có ít
nhóm hydroxyl. Một số nhóm hydroxyl khác đóng vai trò làm giảm liên kết
của 5,6,11-trideoxy TTX với kênh Na+. Jang và Yotsu Yamashita đã tìm thấy

độc tính của 6,11-dideoxy TTX là cao hơn analog tổng hợp 8,11-dideoxy
TTX [55].
Bảng 1.1. Một số thông tin về độ độc của TTX và analog [60]
Mô tả

Giá trị

TTX liều trung bình gây chết ở ngƣời

8,7 µg/kg

MLD của TTX ngƣời

10000 MU (≈2mg) hay 2mg/50kg thể
trọng

LD50 TTX ở chuột

9 µg/kg

LD99 của 5,6,11-trideoxy TTX

750 µg/kg

LD50 của TTX

10 µg/kg (tiêm màng bụng chuột)

LD50 của 11-deoxy TTX

70 µg/kg (tiêm màng bụng chuột)

IC50 6,11-dideoxy TTX

420 µg/kg (tiêm màng bụng chuột)

MU (mouse unit): MU là một lượng chất độc cần để giết chết một loài chuột 20g ICR
trong 30 phút sau khi tiêm màng bụng.

1.1.4. Ứng dụng của TTX trong y học
Do đặc tính chọn lọc tác dụng lên kênh Na+ nhƣng không ảnh hƣởng
tới kênh K+ [7] nên TTX và các analog ngày càng đƣợc dùng nhiều trong các
nghiên cứu về hoạt động tế bào và trong thăm dò tác dụng để sử dụng làm
thuốc. Một số ứng dụng của TTX trong y học nhƣ sau:

7


Thứ nhất, TTX đƣợc dùng làm thuốc giảm đau. Đặc biệt, TTX đem lại
hiệu quả cắt cơn đau cho bệnh nhân ung thƣ với liều rất nhỏ nhƣng kéo dài
[27], [45]. So với morphin, TTX có hoạt lực mạnh hơn gấp 3000 lần, ít tác
dụng phụ hơn và đặc biệt là không gây nghiện [19]. Một kết quả thử nghiệm
lâm sàng khi sử dụng TTX giảm đau cho bệnh nhân ung thƣ cho kết quả tốt:
31 phác đồ điều trị với đƣờng tiêm bắp liều 15-90µg/4 ngày trên 24 bệnh
nhân. Trong đó, 17 phác đồ đã mang lại hiệu quả giảm đau trên lâm sàng, với
tác dụng giảm đau duy trì liên tục trong 2 tuần. Nhóm nghiên cứu kết luận với
liều 30µg/4 ngày dùng 2 lần/ngày có mức độ độc chấp nhận đƣợc và đem lại
hiệu quả giảm đau [29]. Hiện nay, TTX đang đƣợc Công ty International Wex
Technologies (Canada) nghiên cứu và phát triển các sản phẩm để sử dụng
trong y học nhƣ: Tectin (thuốc giảm đau), Tocudin (thuốc gây tê) và Tetrodin

(thuốc cai nghiện ma túy) [4], [9].
Thứ hai, TTX đƣợc dùng làm thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật
[5], [7]. Ngoài những tác dụng gây tê giống thuốc novocain, procain, cocain,
TTX có nhiều ƣu điểm hơn ở khả năng gây mê tại chỗ và tác dụng mạnh hơn
nhiều so với thuốc gây tê khác: TTX hiệu quả hơn thuốc gây mê cục bộ
cocain và procain khoảng 160.000 lần [50].
Thứ ba, TTX có thể sử dụng trong điều trị để chống loạn nhịp tim, co
giật [26]. Sử dụng TTX với liều lƣợng 1,3µg/kg có hiệu quả trong việc phòng
ngừa các trạng thái xơ cứng động mạch và bào chế các loại thuốc đặc trị chữa
bệnh huyết áp, rối loạn nhịp tim [4], [49].
Thứ tƣ, TTX đƣợc sử dụng trong nghiên cứu sinh lý màng tế bào, đặc
biệt trong nghiên cứu tế bào thần kinh [26], [29], [45]. TTX đã đƣợc dùng để
tính toán mật độ kênh Na+ và sự phân bố của nó trong màng tế bào [26], [45].
Thứ năm, phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị HIV/AIDS có chứa
TTX [5]. Nghiên cứu của Jie Shi và cộng sự cho thấy TTX dùng điều trị cho
bệnh nhân có sử dụng heroin có hiệu quả giảm sự ham muốn và lo lắng liên
8


quan tới nghiện heroin. Cho thấy TTX có hiệu quả trong phòng ngừa nghiện ở
ngƣời đang điều trị nghiện heroin [39]. Tại việt Nam cũng đã nghiên cứu
thành công của một số chế phẩm chứa TTX dùng cai nghiện nhƣ: Thiên
Thanh Hoàn có chứa TTX và một số vị thuốc Đông y, chế phẩm Bahudo chứa
TTX và một số thảo dƣợc [8].
Thứ sáu, triển vọng sử dụng TTX trong điều trị ung thƣ: có nghiên cứu
đã cho thấy TTX còn cho thấy khả năng giảm và ức chế hoạt động của tế bào
ung thƣ. Một nghiên cứu cho thấy TTX ức chế hoạt động của khối u ở chuột
bị gây ung thƣ, làm tăng thời gian sống cho chuột bị ung thƣ là 46% và làm
giảm số lƣợng tế bào khối u [27].
Nhƣ vậy, TTX tuy là một chất cực độc nhƣng lại có thể đem lại nhiều

giá trị trong các bệnh xã hội với nhiều ƣu điểm hơn các loại thuốc giảm đau
khác ở chỗ không gây nghiện nhƣ morphine, không xung đột với các loại
thuốc khác, liều lƣợng sử dụng rất thấp. Khả năng khai thác và phát triển các
sản phẩm từ TTX rất lớn.
1.1.5. Nguồn cung cấp TTX
Có thể thu đƣợc TTX qua nhiều cách nhƣ tổng hợp hóa học [31], bán
tổng hợp [44], sinh tổng hợp bằng phƣơng pháp vi sinh vật [4]. Tuy nhiên,
TTX chủ yếu thu đƣợc qua chiết xuất phân lập từ tự nhiên.
Năm 1909, TTX đƣợc phát hiện ở Nhật Bản khi đƣợc phân lập từ
buồng trứng cá nóc [22], [55]. Độc tố TTX đƣợc tìm thấy nhiều nhất ở các
loài cá nóc thuộc họ Tetraodontidae. Ngoài cá nóc, TTX cũng có ở những
loài sinh vật biển khác nhau nhƣ: bạch tuộc tua xanh Australian
(Hapooloclaena maculosa); cá mỏ vẹt, cá thần tiên (Ostracion spp); cá mặt
tròn đại dƣơng; một số loài ghẹ nhƣ ghẹ Philippin, ghẹ mắt đỏ (Eriphia spp,
Carcinoscorpius rotudicauda…); một số loài ốc sên biển; hai loài ếch độc
(Harlequin). Tuy nhiên, cá nóc vẫn là nguyên liệu chính để tách chiết và
nghiên cứu về TTX (Mosher, 1986) [14], [55].
9


Hình 1.3. Một số loài chứa độc tố TTX trong tự nhiên [46]
1.2. CÁ NÓC
1.2.1. Đặc điểm sinh học và phân bố của cá nóc
Cá nóc là thuộc bộ Tetrodontiformes. Bộ này chứa 10 họ còn sinh tồn
với khoảng 430 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [28]. Đặc điểm quan trọng
để nhận biết và phân biệt với các loài cá khác là cá nóc không có vây bụng và
các vây đều không có gai cứng. Tùy loài mà cá nóc có hình dạng và cách
phòng vệ khác nhau: làm phồng tròn bụng lên nhƣ quả bóng hay có nhiều gai
nhọn, tiết độc tố, ….
Trên thế giới có khoảng 246 loài cá nóc, bao gồm cả cá nóc nƣớc mặn

và nƣớc ngọt. Cá nóc sống ở các khu vực biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới
của Thái Bình dƣơng, Ấn Độ dƣơng và Đại Tây dƣơng [2], [41]. Việt Nam có
khoảng 67 loài cá nóc, chủ yếu thuộc họ cá nóc (Tetraodontidae). Chúng
phân bố khá rộng và đƣợc bắt gặp gần nhƣ ở toàn vùng biển Việt Nam [2],
[10].
Trữ lƣợng cá nóc ở biển Việt Nam năm 2005 ƣớc tính khoảng 37.387
tấn, trong đó họ Tetraodontidae chiếm khoảng 84,7% tổng trữ lƣợng [17]. Dự
kiến triển vọng khai thác có nói có thể đến 1200 tấn/năm tại một số vùng [1],
10


[10]. Trữ lƣợng cá nóc lớn, lại có giá trị kinh tế nên việc khai thác cá nóc trên
vùng biển nƣớc ta đang ngày đƣợc quan tâm qua các dự án, chƣơng trình [1].
Tại Việt Nam, ngƣời ta đã tiến hành phân tích độc tố của 35 loài. Trong
đó: 10 loài có độc tính rất mạnh, 7 loài có độc tính mạnh, 4 loài có độc tính
nhẹ, có 14 loài chƣa phát hiện thấy độc tố [13], [14].
1.2.2. Độc tố trong cá nóc
Cá nóc đƣợc coi là loài độc thứ hai trong thế giới động vật có xƣơng
sống, chỉ đứng sau cóc độc vàng [4], [43]. Tuy nhiên, không phải loài cá nóc
nào cũng độc. Độc tố trong cá nóc khác nhau theo loài. Hàm lƣợng độc tố
cũng có thể thay đổi theo mùa, vùng địa lý, giai đoạn phát triển của cá thể và
thay đổi giữa các bộ phận trong cá nóc [10]. Mức độ độc các bộ phận của đa
số các loài cá nóc có thể đƣợc sắp xếp theo trật tự giảm dần nhƣ sau: trứng,
tinh hoàn, gan, ruột, da, thịt [13], [14]. Độc tính của cá nóc thƣờng tăng cao
vào các tháng 2-3 và 7-9 trong năm, đây cũng là mùa sinh sản của cá nóc
[10], [13]. Một số nghiên cứu và đánh giá hàm lƣợng TTX trong một số loài
cá nóc ở Việt Nam thời điểm tích lũy cao nhất có thể trên 100μg/g [6], [14].
Cá nóc là nguồn nguyên liệu tiềm tàng để chiết tách TTX, hứa hẹn một tiềm
năng mới cho ngành y dƣợc Việt Nam.
1.2.3. Thành phần độc tố trong cá nóc

Độc tố chiết xuất từ cá nóc là hỗn hợp gồm nhiều chất độc thuộc nhóm
TTXs và nhóm PSPs (Paralytic Shellfish Poisons – độc tố gây liệt) [11], [40].
Phần lớn thành phần độc tố trong các loài cá nóc là thuốc nhóm TTXs gồm
TTX và khoảng 10 analog. TTX có thể đến trên 90% lƣợng chiết xuất TTXs
từ cá nóc [57]. Ngoài TTX, 3 analog chính của TTX có trong dịch chiết là
acid tetrodonic, 4-epi TTX và 4-epi anhydro TTX. So với TTX, ba chất này
không khác nhiều về đặc tính hóa học, nhƣng khác nhau đáng kể về hoạt tính
sinh học [12].

11


Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hoàng (Viện Nghiên cứu Hải sản)
trên 5 loài cá nóc (Takifugu oblongus, Arothron stellatus, Arothron hispidus,
Torquigener brevipinnis, Lagocephalus sceleratus) đƣợc thu thập ở các tỉnh
ven biển Việt Nam năm 2005 – 2006: thành phần độc tố cá nóc là hỗn hợp
nhiều độc tố. Trong đó, nhóm độc tố TTXs (TTX và các dẫn xuất 4,9-anhydro
TTX, 4-epi TTX) là thành phần chính, chiếm tỷ lệ 97,47%. Các độc tố thuộc
nhóm chất độc PSPs là saxitoxin (STX) và các dẫn xuất (neoSTX, dcSTX,
GTX6 và GTX5) chỉ chiếm tỷ lệ rất nhỏ, khoảng 2,53%. Tỷ lệ của các độc tố
cũng biến động theo từng loài, từng bộ phận, từng giới tính. Ở các loài T.
brevipinnis và L. sceleratus, TTX là thành phần độc tố chính. Ở các loài còn
lại, thành phần độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất là dẫn xuất 4,9-anhydro TTX [11].
Nhìn chung, các thành phần độc tố thƣờng có hàm lƣợng cao hơn ở cá
thể cái. Theo nghiên cứu của Chih-Yu Chen và Hong-Nong Chou (1998) định
lƣợng TTX và các dẫn chất trong hai loài cá nóc Diodon holocanthus và
Takifugu rubripes ở hòn đảo phía bắc Đài Loan đƣợc kết quả TTX chiếm
77%, 4-epi-TTX 11%, còn lại anhydro-TTX 12% [21].
1.2. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX
1.2.1. Phƣơng pháp sinh hóa trên chuột (MBA)

Phƣơng pháp MBA sử dụng chuột để thử độc tính của các chiết xuất
chứa TTX (TTX chiết xuất): Chuột thử nghiệm khỏe mạnh, cùng loài, cùng
giới tính, cùng trọng lƣợng, cùng điều kiện và chế độ nuôi. TTX chiết xuất
đƣợc hoàn tan và pha loãng thích hợp bằng acid acetic 0,02% để tiêm vào
chuột sao cho thời gian chết của chuột thử nghiệm trong vòng 30 phút. Song
song, tiêm dung môi pha loãng 1 ml acid acetic 0,02% vào khoang bụng của 3
con chuột để đối chứng. Kết quả sẽ không đƣợc chấp nhận nếu 2/3 số chuột
đối chứng bị chết [23], [53].
Phƣơng pháp này đã đƣợc chấp nhận rộng rãi trên toàn thế giới và đƣợc
sử dụng nhiều trong phân tích TTX [62]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu khảo
12


sát độc tố hay định lƣợng chiết xuất chứa TTX đều sử dụng phƣơng pháp sinh
hoá trên chuột nhƣ nhóm nghiên cứu thuộc Viện Hải Dƣơng học Nha Trang
[14]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là độ nhạy thấp, không đặc
hiệu do chiết xuất thu đƣợc có thể gồm TTX và nhiều analog cũng mang độc
tính.
1.2.2. Phƣơng pháp ELISA
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét
nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc
điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng
thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích
hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ
chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng
đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà
biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế cho việc phát hiện và định lƣợng vật
chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone, … Đôi khi nó còn đƣợc gọi
bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme Immuno Assay).

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên
hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml). So với kĩ thuật
miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an
toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác
định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng
nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng
thể.

13


- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải
phóng oxy nguyên tử từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu. Do đó làm thay
đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Phản ứng ELISA đã đƣợc sử dụng phân tích nồng độ TTX trong nƣớc
tiểu và máu của các bệnh nhân ngộ độ cá nóc thông qua sử dụng một kháng
thể đơn dòng chống TTX đƣợc phát triển bởi Kawatsu và cộng sự [36].
Phƣơng pháp này có độ nhạy khá cao, độ đặc hiệu tƣơng đối tốt, thời
gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút) nhƣng giá của các kháng thể đơn dòng
rất đắt, nên chi phí phân tích cao, khả năng ứng dụng sẽ bị hạn chế.
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với các detector UV, FLD
Sắc kí lỏng hiệu năng cao là phƣơng pháp dùng để tách và định lƣợng
các thành phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác
nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau. Pha động là chất
lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dƣới áp suất cao, còn pha tĩnh là
chất lỏng đƣợc bao trên bề mặt của các hạt chất mang hoặc đƣợc gắn hóa học
với chất mang. Pha động cùng với mẫu phân tích đƣợc bơm qua cột với tốc độ
phù hợp tùy theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn tới sự tách các chất. Các

chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector và đƣợc truyền qua bộ
xử lý kết quả.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đặc trƣng sự phân tách
giữa pha động và pha tĩnh, có thể ứng dụng để phân tích TTX [62]. Tuy
nhiên, với các detector khác nhau thì phƣơng pháp phân tích khác nhau, qua
đó độ nhạy cũng khác nhau, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng cũng
khác nhau.
- Với Detector UV: không đặc hiệu do TTX không hấp thụ UV, cần
phải sử dụng điều kiện pha động thƣờng phức tạp, độ chọn lọc thƣờng không
cao bởi trong cá nóc có rất nhiều dẫn xuất của TTX [61].

14


- Với Detector huỳnh quang (FLD): phƣơng pháp này đƣợc Yasumoto
và Mitishita ứng dụng để phân tích TTX [58]. Phƣơng pháp này sử dụng
NaOH đặc, nóng tạo thành C9-base để phát huỳnh quang. Điều này làm quy
trình định lƣợng phức tạp, hạn chế sự phục hồi TTX và giới hạn định lƣợng
của phƣơng pháp kém.
1.2.4. Phƣơng pháp khối phổ
Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry, MS) đƣợc dùng khá phổ biến để
xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Phổ khối đƣợc coi là “vân
tay hóa học” của các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là trong tổng hợp hóa dƣợc và
nhận dạng hợp chất thiên nhiên, giúp phát hiện nhanh chất và khẳng định cấu
trúc.
Cơ sở của phƣơng pháp MS là sự ion hoá phân tử trung hoà thành các
ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân
tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lƣợng nhỏ
hơn) bằng các phần tử mang năng lƣợng cao.
Sự phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang

điện tích tuân theo định luật bảo toàn khối lƣợng. Năng lƣợng bắn phá (năng
lƣợng ion hoá) là một yếu tố quyết định sự phân mảnh các hợp chất. Khi năng
lƣợng bắn phá mẫu (khoảng 10eV) bằng với năng lƣợng ion hóa phân tử sẽ
gây nên sự ion hóa phân tử. Nếu năng lƣợng ion hóa tăng lên (30-50eV) sẽ bẻ
gẫy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân
tử trung hòa có khối lƣợng bé hơn.
Quá trình phân mảnh đặc trƣng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có
mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp cho ngƣời phân tích những
thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng của chất phân tích. Quá trình
phân mảnh là cơ sở giúp ta biện giải phổ, nhận dạng hoặc khẳng định cấu trúc
của chất phân tích. Nó đặc trƣng cho từng chất, nên độ chọn lọc cao [32].

15


Các thiết bị MS có thể sơ bộ liệt kê từ kỹ thuật ion hóa: ion hóa bằng va
chạm điện tử (EI), bắn phá nguyên tử nhanh (FAB), ion hóa bằng hóa học
(CI), ghép nối với sắc ký khí (GC – MS), ion hoa bằng phun sƣơng điện tử
(ESI), ion hóa ở áp suất thƣờng (APCI)…..
EI-MS là phổ va chạm điện, dựa vào sự phân mảnh ion dƣới tác dụng
của chùm điện tử hoặc ion bắn phá với năng lƣợng khác nhau, phổ biến là
70eV. Phổ ESI-MS là phổ tạo ra bởi ion hóa bằng phun điện tử. Phổ này đƣợc
thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó
phổ thu đƣợc chủ yếu là píc ion phân tử và các píc đặc trƣng cho sự phá vỡ
các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ phá vỡ. ESI – MS đem lại hiệu quả
trong phân tích các chất có hàm lƣợng thấp. ESI – MS đƣợc sử dụng rộng hơn
EI-MS do giữ đƣợc các mảnh đặc trƣng của chất phân tích [18].

Hình 1.4. Kỹ thuật ESI-MS
Tiếp sau bộ phận ion hóa, bộ phân tích khối phổ cũng đƣợc phát triển:

bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực (bộ tứ cực, bẫy ion tứ cực iontrap), bộ
phân tích thời gian bay (TOF), bộ phân tích cộng hƣởng ion (FT ICR)….
Kỹ thuật phân tích khối phổ FT ICR MS, ESI-Orbitrap cho phổ khối
phân giải cao, chính xác. Bằng cách đo đƣợc ion phân tử có độ chính xác khối
cao, việc xác định các cấu trúc đã biết trở lên vô cùng nhanh chóng dựa vào
thƣ viện phổ và kỹ thuật phân tích các mảnh khối cơ bản (H, C, O, N, S…),
xác xuất sai lầm (hai chất khác nhau có số khối giống nhau) đƣợc đánh giá là
vô cùng nhỏ (một phần triệu) [34].
16