Nghiên cứu đa dạng sinh học của chi kim ngân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THÀNH CÔNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC
CỦA CHI KIM NGÂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THÀNH CÔNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC
CỦA CHI KIM NGÂN

CHUYÊN NGÀNH : DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ : 60720406
Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. Trần Văn Ơn
TS. Hoàng Quỳnh Hoa

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN
Em xin được bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn và lời cảm ơn sâu sắc nhất tới
PGS. TS. Trần Văn Ơn và TS. Hoàng Quỳnh Hoa - Bộ môn Thực vật, Trường
Đại học Dược Hà Nội, thầy cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, truyền cảm
hứng và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. NCS. Phạm Hà Thanh Tùng và
ThS. Nghiêm Đức Trọng- Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, hai
thầy như những người anh trai đã luôn chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình nghiên
cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các chị kĩ thuật viên và các em sinh viên
nghiên cứu khoa học - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ,
tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm
tại bộ môn.
Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh chị và
bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học tập, nghiên cứu
và hoàn thành đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 10 năm 2015
Học viên

Nguyễn Thành Công


ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Kim Ngân (Lonicera L.) ...................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của Lonicera L. ................................... 2
1.1.2. Đa dạng di truyền của chi Lonicera L. trên thế giới............................ 4
1.1.3. Thành phần hóa học ............................................................................. 7
1.1.4. Công dụng và tác dụng sinh học .......................................................... 9

1.2. Đại cương về phương pháp phân loại thực vật dựa vào chỉ thị
phân tử ............................................................................................................... 10
1.2.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR ......................................................... 10
1.2.2. Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN) trong
nghiên cứu đa dạng sinh học........................................................................ 11
1.2.3. Phương pháp mã hóa ADN (“ADN barcoding”) trong phân loại
học ................................................................................................................ 11
1.2.4. Vùng phiên mã nội của ADN Ribosom (ITS – rADN) ..................... 13
1.3. Phương pháp vân tay sắc ký ........................................................................... 13
1.3.1. Vài nét về phương pháp vân tay sắc ký trong nghiên cứu................. 13
1.3.2. Phương pháp vân tay sắc ký dựa vào kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao (HPTLC). .............................................................................. 14
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................16
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 16
2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 16
2.3. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 16
2.3.1. Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn......................................................... 16
2.3.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ......................................................... 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 18
2.4.1. Nghiên cứu hình thái và giải phẫu ..................................................... 18
2.4.2. Xây dựng cây phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái .................. 19
2.4.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền ............................................................ 19
2.4.4. Nghiên cứu thành phần hóa học. ....................................................... 21
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................24


3.1. Đặc điểm thực vật và đa dạng sinh học của chi Lonicera L. ở
miền Bắc Việt Nam ........................................................................................... 24

3.1.1. Đặc điểm hình thái của các loài trong chi Lonicera L. ..................... 24

3.1.2. Xây dựng cây phân loại dựa trên đặc điểm hình thái. ....................... 38
3.1.3. Đặc điểm giải phẫu thân và lá của Lonicera spp.. ............................ 38
3.2. Đa dạng di truyền các loài trong chi Lonicera L. ......................................... 44
3.2.1. Tách chiết ADN ................................................................................. 44
3.2.2. Kết quả khuếch đại ADN (PCR) ....................................................... 44
3.2.3. Xác định trình tự ADN ribosom vùng ITS. ....................................... 45
3.2.4. So sánh trình tự ADN ribosom vùng ITS .......................................... 46
3.3. Thành phần hóa học của các loài trong chi Lonicera L. .............................. 47
3.3.1. Sắc ký lớp mỏng các mẫu Lonicera spp.. ........................................... 47
3.3.2. Bán định lượng Acid Chlorogenic trong các mẫu Lonicera spp.
bằng phương pháp HPTLC. ......................................................................... 51
3.3.3. Thẩm định phương pháp .................................................................... 52
Chương 4. BÀN LUẬN ......................................................................................54
4.1. Về đặc điểm thực vật và đa dạng sinh học. .................................................... 54
4.1.1. Xác định tên khoa học các mẫu nghiên cứu ...................................... 54
4.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu ................................................................ 55
4.2. Về đa dạng di truyền ........................................................................................ 55
4.2.1. Trình tự ADN ribosom vùng ITS ...................................................... 55
4.2.2. Đa dạng di truyền các mẫu Lonicera spp.. dựa vào trình tự ADN
ribosom vùng ITS. ....................................................................................... 56
4.3. Về thành phần hóa học .................................................................................... 57
4.3.1. Sắc ký đồ của chi Lonicera spp. ........................................................ 57
4.3.2. Sơ bộ bán định lượng ......................................................................... 59
4.4. So sánh kết quả nghiên cứu của 3 phương pháp ........................................... 60
KẾT LUẬN .........................................................................................................61
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ
viết tắt
ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

Acid Deoxyribo Nucleic

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

Công cụ tìm kiếm đồng bộ trình tự

bp
C

Base pair
Cystein

Cặp base nitơ
Cystein

G

Guanin

Guanin

GAP

HPLC

Good Agricultural Practice
High performance liquid

Thực hành trồng trọt tốt
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC
ITS
PCR
RAPD
Rf
RNase A
RSD
TAE
TLC
UV
WHO

Tên đầy đủ

chromatography
High Performance Thin Layer
Chromatography
Internal Transcribed Spacer
Polymerase Chain Reaction
Random Amplified polymorphic
DNA
Retention factor

Ribonuclease A
Relative Standard Deviation
Tris- acetat - EDTA
Thin Layer Chromatography
Ultraviolet Radiation
World Health Organization

Diễn giải

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Vùng phiên mã nội
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Phân tích đa hình AND khuếch đại
ngẫu nhiên
Hệ số lưu giữ
Ribonuclease A
Độ lệch chuẩn tương đối
Tris- acetat - EDTA
Sắc ký lớp mỏng
Tia cực tím
Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các mồi dùng trong kỹ thuật RAPD ..........................................................4
Bảng 1.2 Chia nhóm Lonicera nghiên cứu [39]. .......................................................5
Bảng 2.1 Danh mục các mẫu nghiên cứu ................................................................16
Bảng 2.2 Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Lonicera L. .........................18
Bảng 2.3 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR ..............................................20
Bảng 2.4. Chuẩn bị dịch chiết theo từng mẫu nghiên cứu ........................................22

Bảng 2.5 Dãy nồng độ của dung dịch chuẩn (mg/ml) .............................................23
Bảng 3.1 Đặc điểm vi phẫu thân các loài Kim ngân nghiên cứu .............................41
Bảng 3.2 Đặc điểm vi phẫu lá của các loài Kim Ngân nghiên cứu .........................44
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7

Đặc điểm nucleotids của các mẫu nghiên cứu. ........................................45
Các đoạn ADN bảo thủ đặc trưng cho tất cả các mẫu nghiên cứu...........46
Bảng so sánh hệ số tương đồng các mẫu nghiên cứu...............................47
Bảng các vết sắc kí xuất hiện tại các mẫu ................................................48
Bảng các vết sắc kí xuất hiện khi tổng hợp các mẫu ...............................49

Bảng 3.8 Bảng kết quả bán định lượng hàm lượng acid chlorogenic……………..52
Bảng 3.9 Bảng nồng độ chất chuẩn và diện tích pic tương ứng ..............................52


Hình 1.1
Hình 1.2

DANH MỤC CÁC HÌNH
Cấu trúc hóa học của một số hợp chất chính trong Kim Ngân .............8
Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [20]. ........................................13

Hình 3.1

Đặc điểm hình thái mẫu KN1 (Lonicera confusa DC.) .......................25

Hình 3.2

Đặc điểm hình thái của mẫu KN2(Lonicera dasystyla Rehder.) .........27

Hình 3.3

Đặc điểm hình thái của mẫu KN3 (Lonicera sp.1)..............................29

Hình 3.4

Đặc điểm hình thái mẫu KN4 (Lonicera sp.2) ....................................31

Hình 3.5

Đặc điểm hình thái mẫu KN5 (Lonicera japonica Thunb.) .................33

Hình 3.6

Đặc điểm hình thái của mẫu KN6 (Lonicera macratha (D.Don)

Spreng.) .............................................................................................................35
Hình 3.7

Đặc điểm hình thái của mẫu KN7 (Lonicera reticulata Champ.) ........37

Hình 3.8

Mối quan hệ gần gũi của các loài Kim ngân nghiên cứu ....................38

Hình 3.9

Đặc điểm cấu tạo giải phẫu thân KN1 ................................................39

Hình 3.11

Vi phẫu lá ............................................................................................43

Hình 3.12

Đặc điểm vi phẫu lá các loài Lonicera spp nghiên cứu......................43

Hình 3.14

Hình ảnh điện di quá trình PCR ..........................................................45

Hình 3.15

Mối quan hệ gần gũi của các loài Kim Ngân ......................................47

Hình 3.17

Sắc kì đồ hoa, cuộng, lá các mẫu KN5, KN6, KN7 ............................48

Hình 3.18

Mối quan hệ gần gũi giữa các loài Kim ngân .....................................49

Hình 3.19

Mối quan hệ gần gũi giữa các loài Kim ngân dựa theo sắc kí đồ

HPTLC của cuộng ............................................................................................50
Hình 3.20

Mối quan hệ gần gũi giữa các loài Kim ngân .....................................50

Hình 3.21

Mối quan hệ gần gũi giữa các loài dựa theo sắc kí đồ HPTLC ..........51

Hình 3.22

Hình ảnh bán định lượng hoa, cuộng, lá của .......................................53

Hình 3.23

Hình ảnh bán định lượng hoa, cuộng, lá của .......................................53

Hình 4.1
Hình 4.2

Đoạn gen bảo thủ cho các mẫu nghiên cứu .........................................56
Đoạn gen thể hiện sự khác biệt của KN2 và KN4 ..............................56


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm, Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và
phong phú. Chúng không những là nguồn lương thực mà còn là nguồn dược liệu
chữa trị nhiều bệnh cho con người. Do vậy, nghiên cứu phát triển thuốc và các sản
phẩm chữa bệnh từ cây cỏ là một xu hướng được quan tâm trên thế giới cũng như ở

Việt Nam ngày nay, trong đó có Kim ngân.
Dân gian ta từ xưa đã biết sử dụng cây Kim Ngân làm thuốc để chữa các bệnh
mụn nhọt mẩn ngứa … Dược liệu Kim ngân bao gồm Kim ngân hoa và Kim ngân
cuộng có nguồn gốc từ một số loài trong chi Lonicera L., như Lonicera japonica
Thunb. (Kim ngân), Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy (Kim ngân lông),
Lonicera confusa DC. (Kim ngân lẫn), Lonicera macrantha (D. Don) Spreng. (Kim
ngân hoa to), Lonicera dasystyla Rehd. (Kim ngân dại),…[2]. Trong thực tế, còn
nhiều loài được dùng với tên Kim Ngân thuộc chi Lonicera chưa được xác minh rõ
tên khoa học, nguồn gốc, chất lượng,….Điều này dẫn đến khó khăn trong việc chuẩn
hóa các vị thuốc này trong quá trình sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong cả y học
cổ truyền và công nghiệp dược.
Từ lý do trên đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học của chi Kim Ngân ”, được
thực hiện với các mục tiêu:
 Xác định tính đa dạng về hình thái, di truyền và hóa học của các loài Kim ngân
có nguồn gốc ở miền Bắc Việt Nam.
 Xác định hàm lượng Acid Chlorogenic trong các loài nghiên cứu.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung chính sau:


Về đặc điểm hình thái:

 Mô tả, phân tích và so sánh đặc điểm hình thái và đặc điểm giải phẫu của thân,
lá của các loài Kim ngân thu được.
 Giám định tên khoa học của các mẫu thu được.


Về tính đa dạng di truyền:

 Phân tích và so sánh ADN của các mẫu nghiên cứu.


Về hóa học:

 Phân tích sắc kí đồ của các mẫu nghiên cứu dựa trên sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao (HPTLC).
 Bán định lượng thành phần chính trong hoa (Kim ngân hoa) và cành mang lá
(Kim ngân cuộng) của các mẫu nghiên cứu bằng HPTLC.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Kim Ngân (Lonicera L.)
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của Lonicera L.
1.1.1.1. Vị trí phân loại của Lonicera L.
Theo hệ thống phân loại của A. Takhtajan (1987), chi Kim ngân (Lonicera L.)
thuộc họ Kim ngân (Caprifoliaceae), Bộ Tục Đoạn (Dipsacales), Phân Lớp Hoa
Hồng (Rosidae), Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta).
Trên thế giới, chi Lonicrea L. có khoảng 180 loài, phân bố ở châu Á, châu Âu và
Bắc Mỹ,... Trung Quốc có độ da dạng cao nhất với hơn 100 loài. Các loài phổ biến
gồm có Lonicera periclymenum (Kim ngân châu Âu), Lonicera japonica (Kim ngân
Nhật, phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam) và Lonicera sempervirens.
Theo khóa phân loại Trung Quốc đặc điểm chung của chi Lonicera có các đặc
điểm chung như: Cây bụi, dây leo, lá có thể rụng hoặc xanh quanh năm. Thân rỗng
hoặc đặc có mầu nâu hoặc phủ lông trắng. Lá hình bầu dục dài. Cụm hoa xim. Hoa
màu trắng, sau chuyển sang vàng. Quả hình cầu, nâu đen. Trung Quốc có khoảng 57
loài, các loài có thể kể đến như Lonicera hypoleuca., Lonicera Spinosa., Lonicera

Calcarata…..[53].
1.1.1.2. Tính đa dạng của các loài trong chi Lonicera L. ở Việt Nam

Ở Việt Nam, chi Lonicera L. có khoảng 10 loài, phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng
núi và trung du phía Bắc như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây
(cũ), Hòa Bình, Thái Bình, Hà Bắc, Nình Bình, Thừa Thiên Huế, Kon Tum…[3] ,
[7], [10].
Các loài Kim ngân đã được xác định có ở Việt Nam bao gồm: Kim ngân hoa to,
Kim ngân lông (Lonicera macrantha (D. Don) Spreng.), Kim ngân hoa, Nhẫn đông
(Lonicera japonica Thunb.), Kim ngân lá to (Lonicera hildebrandia Coll. et Hemsl.),
Kim ngân lông (Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy ), Kim ngân mốc (Lonicera
hypoglauca Miq.), Kim ngân nhẵn, Kim ngân dại (Lonicera dasystyla Rehd.), Kim
ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall. in Roxb.), Kim ngân rối (Lonicera confusa
DC.), Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl.), Kim ngân trung bộ (Lonicera
annamensis Fukuoka) [3], [10].
1.1.1.2.1. Kim ngân, Dây nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb.).
Cây dây leo thân cuốn. Cành non có lông mịn, thân già xoắn. Lá nguyên, mọc
đối. Phiến lá hình trứng, dài 4-7cm rộng 2-4cm, cả hai mặt lá đều có lông mịn. Hoa

2


mọc từng đôi một ở các nách lá gần ngọn. Khi mới nở, cánh hoa màu trắng, sau
chuyển sang vàng nhạt, mùi thơm nhẹ. 5 cánh hoa dính liền nhau thành ống ở phía
dưới, miệng ống có 2 môi. 5 nhị thò ra ngoài cánh hoa. Bầu dưới. Quả hình trứng, dài
chừng 5mm, màu đen.
Mùa hoa tháng 3-4, quả tháng 6-8. Cây mọc phổ biến ở các tỉnh miền Bắc ngoài
ra còn được trồng ở một số nơi [10].
1.1.1.2.2. Kim ngân dại, Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla Rehd).
Cây leo bằng thân quấn. Các nhánh non có lông rồi nhẵn, màu nâu đỏ. Lá mọc
đối, có phiến mỏng, hình trái xoan- ngọn giáo dài 2-8cm, rộng 1-4cm, tròn hay hình
tim ở gốc, nhọn thành mũi ở đầu, mặt trên nhẵn, mặt dưới nhạt và hơi có lông mịn,
với 3-4 cặp gân phụ; cuống lá hơi hẹp có rãnh ở trên, dài 2-8cm. Hoa trắng, thành

xim 2 hoa ở nách các lá ở ngọn, cuống có lông. Quả đơn, nhẵn, hình cầu, đường kính
8mm [10]
Ra hoa vào tháng 4.
1.1.1.2.3. Kim ngân hoa to (Lonicera macrantha ( D. Don) Spreng).
Dây leo quấn to. Nhánh có lông cứng vàng. Lá có phiến bầu dục, dài 4-11cm,
rộng 3-4,5cm, có lông. Cụm hoa ở nách lá, dạng xim co, có cuống, mang 2-3 hoa.
Hoa to, màu vàng. Đài có 5 răng cưa nhỏ. Tràng cao 5-6cm, môi trên có thùy, môi
dưới 1. Bầu 3 ô. Quả mọng to 7-8mm, màu đen [10].
Ra hoa vào tháng 3.
1.1.1.2.4. Kim ngân lá mốc, Kim ngân mặt dưới mốc (Lonicera hypoglauca Miq).
Dây leo khá mảnh. Thân non, cuống, mặt dưới lá có lông mịn dày vàng. Lá có
phiến hình trái xoan, dài 3-10cm, rộng 2,5-3,5cm; gốc tròn hay hơi lõm, chóp lá tù,
mặt dưới mốc, có lông mịn, gân ở gốc 3-4; cuống 1cm. Cụm hoa xim, 2 hoa dài 3,54,5cm; màu trắng rồi vàng; bầu và lá dài có lông mịn. Tràng có lông dài ở mặt ngoài,
ống tràng 2,5cm, môi dài 1,5cm, môi dưới hẹp. Quả dài 7-8mm, màu đen [10].
Ra hoa vào tháng 5.
1.1.1.2.5. Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC.).
Cây leo 2-4m. Cành có lông hơi xám. Lá có lông, phiến lá hình trái xoan, dài 46cm, rộng 1,5-3cm, tròn hay gần hình tim ở gốc, nhọn hay gần nhọn ở đầu, nhẵn ở
mặt trên, có lông mặt dưới. Cụm hoa xim hai hoa ở nách các lá ở ngọn. Hoa dài 1,62cm, lúc đầu trắng sau chuyển sang màu vàng [10]
Ra hoa tháng 6-9, quả tháng 10-11.

3


1.1.1.2.6. Kim ngân lông (Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy).
Cây dây leo bằng thân quấn, nhiều khi cao tới 9m. Cành có nhiều lông xù xì gồm
lông đơn, cứng, hơi xám và lông tuyến có hình trái xoan, phiến lá dài 5-12cm, rộng
3-6cm, tròn hay gần hình tim ở gốc, nhọn ở đầu; mép nguyên, hơi cuộn xuống phía
dưới, nhẵn ở mặt trên, có lông xù xì ở mặt dưới, nhất là trên các gân. Cụm hoa xim
hai hoa ở nách các lá gần ngọn, có lông xù xì. [10]
1.1.2. Đa dạng di truyền của chi Lonicera L. trên thế giới

Các nghiên cứu đa dạng di truyền hiện được thực hiện trên loài Lonicera xylosteum và các phân loài của Lonicera caerulea L., sử dụng phương pháp khuếch đại
ngẫu nhiên đa hình (RAPD) ADN. Tổng cộng có 105 đoạn ADN được ghi lại sau khi
khuếch đại của tất cả các mẫu ADN với 11 mồi ngẫu nhiên được lựa chọn [39].
 ADN được lấy từ lá cây non tươi, được phân lập bằng cách sử dụng theo
phương pháp MBI Fermentas.
 PCR được thực hiện 25 ml bao gồm 50 ng ADN, 2,5 ml 10 × Taq phản ứng
đệm, 3.0 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 1 mM mồi, 1 Taq ADN polymerase (MBI
Fermentas).
 Các chu trình nhiệt đã được lập trình cho một chu kỳ 4 phút ở 94 0C, tiếp theo
35 chu kỳ 1 phút ở 94 0C, 1 phút ở 36 0C và 2 phút ở 72 0C, và cuối cùng của một chu
kỳ 5 phút ở 72 0C. Sản phẩm khuếch đại được phân cách bằng điện di 1,5% gel
agarose với một Trisborate- Hệ thống đệm EDTA. Gel được nhuộm với ethidium
bromide.
Bảng 1.1
Mồi RAPD

Các mồi dùng trong kỹ thuật RAPD

Trình tự
5 '→ 3'

Tổng số Băng đa Kích thước các
băng

hình

đoạn ADN

Số mô
hình

RAPD

170-03

ACG GTG CCT G

11

11

480–1350

18

170-05

GAG ATC CGC G

11

6

450–1500

13

170-08

CTG TAC CCC C

8

6

480–2300

16

170-10

CAG ACA CGG C

10

10

550–1500

24

380-01

ACG CGC CAG G

11

9

590–2000

22

4


380-02

ACT CGG CCC C

12

11

700–2550

14

380-03

GGC CCC ATC G

9

6

650–2500

8

380-06

CCC GAC TGC C

10

7

700–2000

18

380-07

GGC AAG CGG G

6

6

890–2400

11

380-08

CGC ACC GCA C

9

9

680–2100

29

380-09

ACG GCG GCT C

8

7

870–1950

6

105

88

450–2550

177

Tổng

Kết quả là 39 mẫu Kim ngân đã được chia thành 3 nhóm và được tóm tắt trong
bảng 1.2.
Bảng 1.2

STT

Chia nhóm Lonicera nghiên cứu [39].

Tên mẫu

Đặc điểm

Nơi tìm ra

Nhóm 1: Nhóm Coeloxylosteum Rehd, phân nhóm Ochranthae Zab.

1

Lonicera xylosteum L.
Châu Âu, Nga, tây
Siberia

Cây bụi khoảng 3 m,
hoa quả màu đỏ không
thể ăn được nở vào cuối

LTU, thực vật tự
phát

mùa hè

Nhóm 2: Cây bụi khoảng 2 m, nở hoa rất sớm thời gian sinh sản ngắn.
Bắc khu vực Âu Á và Bắc Mỹ

2

Lonicera caerulea L.
Lá nhỏ

3

Lonicera caerulea L.
subsp. altaica Pall.
Đông Âu, Nga, Tây
Siberia, Mông Cổ,
Trung Quốc

4

Lonicera caerulea L.
subsp.
Lonicera

Cây bụi khoảng 1,5 m,

RUS,

hoa hình quả trục
22 x 9 mm

Meshcherskoe St
Exper,
năm
1997, Pom3342

Cây bụi khoảng 1,5 m,
quả hình trứng
16 × 10 mm, 0,8 g

RUS,
St
Petersburg, VIR
,Năm
1997,
Pom3326

Cây bụi khoảng 1,1 m,
quả hình bầu dục 15 x 9

RUS,
St
Petersburg, VIR,

5


Tên mẫu

STT

Đặc điểm

caerulea L.
subsp. Ledeb pallasii.

Đông Bắc Châu Âu,
Nga:
Siberia,

trong

Nơi tìm ra

mm, 0,7 g

Năm
1997,
Pom3320

Cây bụi khoảng 2,0 m,

RUS,

quả hình bầu dục 20 ×
10 mm,
0,9 g, chín sớm

Petersburg, VIR,
Năm
1997,
Pom3319

rừng

taiga

Lonicera caerulea L.
subsp.
5

Pojark.
Nga: Tây

stenantha
Siberia;

Trung Á, Iran, Ấn Độ

6

Lonicera
caerulea
'Baktcharskaja'

Cây bụi khoảng 1,5 m,
hoa khoảng

Nga

20 × 12 mm

Lonicera
7

RUS,
St

Petersburg, VIR,
Năm
1996,
Pom3161

Cây bụi khoảng 1,5 m

RUS,
St
Petersburg, VIR,
Năm
1997,
Pom3249

Cây bụi khoảng 1,5
m,quả hình trụ
23 × 10 mm, 1,7 g, chín
sớm

RUS,
St
Petersburg, VIR,
Năm
1997,
Pom3258

Cây bụi khoảng 1,5 m,
quả hình bầu dục
23 × 11 mm, chín sớm

RUS,
St
Petersburg, VIR,
Năm
1996,
Pom3159

caerulea

'Morena'
Nga

St

caerulea

8

Lonicera
"Viola"
Nga

caerulea

9

Lonicera
"Viola"
Nga

10

Lonicera caerulea '96
-3 '
Lithuania

Cây bụi khoảng 1,0 m,
quả 27 × 11 mm, 1,1 g

LTU, Vilnius,
HBU, năm 1996,
Pom3421

11

Lonicera caerulea '96
-4 '
Lithuania, HBU

Cây bụi khoảng 1,0 m,
quả 22 × 12 mm, 1,0 g

LTU, Vilnius,
HBU, năm 1996,
Pom3422

6


STT

Tên mẫu

Đặc điểm

Nơi tìm ra

12

Lonicera caerulea '2R'
Lithuania, HBU

Cây bụi khoảng 1,5 m,
quả 17 × 11 mm, 1,2 g

LTU, Vilnius,
HBU, năm 1996,
Pom3028

13

Lonicera caerulea '3U'
Lithuania, HBU

Cây bụi khoảng 1,5 m,
quả 30 × 11 mm, 1,6 g

LTU, Vilnius,
HBU, năm 1996,
Pom3031

Nhóm 3: Cây bụi ngắn (khoảng 0,8 m), lá lớn, cuối năm nở hoa và quả chín

14

15

16

Lonicera caerulea L.
subsp.
kamtschatika

Cây bụi khoảng 0,9 m,

LVA, Salaspils,

quả hình trứng
23 × 12 mm

HBA, năm 1991,
Pom2635

Lonicera caerulea L.

Cây bụi khoảng 0,6 m,

CZE, Pruhonice,

subsp.

kamtschatika
(Sevast.) Pojark.

quả hình bầu dục 17 ×
12 mm

HBA,
Năm
1997, Pom3189

Cây bụi khoảng 1,2 m,
quả hình bầu dục
16 × 10 mm

LVA, Kalsnava,
ARB, năm 1997,
Pom3192

(Sevast.)
Pojark.

Lonicera caerulea L.
subsp.
kamtschatika
(Sevast.)
Pojark.

17

18

Lonicera

caerulea

'L69-3' Nga

Lonicera
'639-8' Nga

caerulea

Cây bụi khoảng 0,6 m,
quả hình trứng

RUS,
St
Petersburg, VIR,

18 × 13 mm

Năm
1997,
Pom3251

Cây bụi khoảng 0,5 m,
quả tròn 15 × 12 mm

RUS,
St

Petersburg, VIR,
199, Pom3259

Các kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh rằng phương pháp RAPD có
thể được sử dụng một cách hiệu quả để phân biệt kiểu gen của các loài Lonicera.
1.1.3. Thành phần hóa học
1.1.3.1. Nhóm flavonoid phân lập được từ Lonicera L.
Theo một số nghiên cứu, Lonicera L. có chứa một glucozit gọi là lonixerin có
cấu tạo luteolin-7-rhamnoza [3]

7


Trong hoa có chứa acid chlorogenic 6%. Chất này cũng có trong rễ, thân và lá
với hàm lượng theo thứ tự 1,4%, 0,9% và 2,6%. Hoa và thân có acid isochlorogenic,
gồm 3 đồng phân là các acid isochlorogenic a,b,c. Acid isochlorogenic a là acid 3,5dicacfeoyl quinic, còn acid isochlorogenic b và c là đồng phân của acid 3,4dicafeoylquinic. Lá chứa nhiều acid chlorogenic và acid isochlorogenic hơn hoa [2]
Các Flavon: Lonicerin (luteolin-7-O-rhamnoglucosid), loniceraflavon [47],
rutin, quercetin, luteolin-7-O-β-D-galactosid, tetratriacontan [18], ochnaflavon [46],
luteolin (3', 4', 5, 7-tetrahydroxyflavon) [49].

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất chính trong Kim Ngân
1.1.3.2. Nhóm saponin triterpenoid được phân lập từ Lonicera L.
Theo các nghiên cứu được công bố trên thế giới trong Lonicera L. có chứa các
Hederagenin-mono-, di-, tri-, tetraglycosid có các mạch đường như
glucose,
rhamnose và arabinose, acid oleanolic mono-, di-, tri-, tetraglycosid có các mạch

8

đường như glucose, rhamnose và arabinose (ví dụ như macranthoidin A, B,
dipsacosid B, macranthosid A, B, lonicerosid A, B, C) [19], [30], [32], [37].
Năm 2012 nhóm Yu Chen và các công sự đã tìm ra thêm hai saponin triterpenoid
mới từ Lonicera macranthoides [21].
1.1.3.3. Các iridoid glycosid được phân lập từ Lonicera L.
Một số các chất đã được phân lập là các Loganin, secoxyloganin dimethylacetat;
vogeloside [47], 7-epi-loganin [35], loniceracetalides A, B, L-phenyl alanino
secologanin [29], (Z)- aldosecologanin, (E)-aldosecologanin [38].
Năm 2013, nhóm của Zhong Zhang đã phát hiện ra a-Glucosidase có trong nụ
hoa của Lonicera japonica [50]
1.1.3.4. Các tinh dầu được phân lập từ Lonicera L.
Một số tinh dầu được phân lập từ hoa của Lonicera L bao gồm: 2,6,6-trimethyl-2vinyl-5-hydroxytetrahydropyran, pinen, hex-1-en, hex-3-en-1-ol, cis- trans-2-methyl-2vinyl-5-(α-hydroxyisopropyl)-tetrahydrofuran, geraniol, α-terpineol, benzylalcohol, βphenylethyl alcohol, carvacrol, eugenol [47], aromadendren [48], ethylpalmitate
[27], acid palmitic, acid linoleic [34].
1.1.4. Công dụng và tác dụng sinh học
1.1.4.1. Tác dụng kháng vi sinh vật.
Người ta nhận thấy nước hoa Kim ngân có tác dụng mạnh đối với tụ cầu khuẩn,
vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga. Nước sắc có tác dụng mạnh hơn các dạng bào
chế khác. Năm 1950, Lưu Quốc Thanh [3] đã báo cáo dùng nước sắc cô đặc 100%
của hoa Kim ngân thấy có tác dụng khánh sinh rất mạnh đối với vi trùng thương hàn,
tả, liên cầu khuẩn tiêu máu, vi trùng lỵ, trực khuẩn coli, tụ cầu khuẩn, phế cầu khuẩn.
Đối với bạch hầu cũng có tác dụng nhưng kém hơn.
1.1.4.2. Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ.
Năm 1966, Đỗ Tất Lợi, Nguyễn Năng An và Bùi Chí Hiếu đã báo cáo nước sắc
Kim ngân có khả năng ngăn choáng phản vệ trên chuột lang [3].
Ngoài ra Kim Ngân còn có các tác dụng như chữa viêm nhiễm đường hô hấp,
cảm cúm truyền nhiễm, viêm két mạc cấp tính, loét cổ tử cung [10].
1.1.4.3. Tác dụng trên chuyển hóa chất béo.
Kim ngân có tác dụng tăng cường chuyển hóa các chất béo [2]
1.1.4.4. Tác dụng trên đường huyết.
Nước sắc hoa kim ngân cho uống làm tăng lượng đường huyết trên thỏ, tác dụng

kéo dài 5-6h [2].

9


1.1.4.5. Tác dụng theo y học cổ truyền.
Kim ngân có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, giải trừ các khí ôn dịch. Trị ôn bệnh
phát sốt, nhiệt lỵ, rôm sẩy, mụn nhọt, hắc lào, giang mai.
1.1.4.6. Độc tính.
Chuột nhắt trắng, sau khi được cho uống nước sắc kim ngân liên tục 7 ngày với
liều gấp 150 lần liều điều trị cho người, vẫn sống bình thường, giải phẫu các bộ phận
không thấy có thay đổi gì đặc biệt [2].
1.2. Đại cương về phương pháp phân loại thực vật dựa vào chỉ thị phân tử
Phân tử ADN chứa thông tin di truyền tự sao chép một cách chính xác thông tin
di truyền cho thế hệ sau và có khả năng biến đổi được. Tính đa dạng của sinh giới có
thể nói là hệ quả của sự đa dạng trong trình tự ADN. Như vậy muốn nghiên cứu và
phân loại các sinh vật khác nhau bên cạnh con đường truyền thống là dựa vào các đặc
tính về hình thái, người ta còn dựa trên các chỉ thị phân tử.
1.2.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain
Reaction) cho phép nhân một trình tự ADN bất kỳ lên một số lượng bản sao gần như
vô hạn tạo nguồn vật liệu ADN cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo.
PCR là quá trình khuếch đại của một trình tự ADN đặc hiệu in vitro do sự xúc tác
của enzyme ADN polymerase. Sự khuếch đại này nói chung được thực hiện như các
quy trình lặp lại gồm 3 giai đoạn: Biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi.
Các thành phần cơ bản của phản ứng [4], [5], [8]:
 ADN khuôn dùng trong PCR: thường không đòi hỏi có độ tinh khiết cao, lượng
ADN khuôn thay đổi trong khoảng rộng tùy theo phản ứng; ADN có thể biết trước
hoặc không biết trước trình tự hai đầu.
 Enzyme ADN polymerase bền nhiệt hoạt động tối ưu ở 720C có tác dụng tháo

xoắn phân tách phá bỏ liên kết hydro giữa hai sợi đơn tổng hợp sợi mới theo quy tắc
bổ sung.
 Mồi: có chiều dài khoảng 4-10 nucleotide đựợc thiết kế để có thể gắn vào một
số chỗ trên ADN nhằm cung cấp đầu 3’-OH cho hoạt động của enzyme polymerase.
Nồng độ mồi có giới hạn bởi nếu nồng độ mồi quá cao sẽ làm tăng gắn mồi nhầm,
nếu thấp quá sẽ gây thiếu mồi cho phản ứng.
 Đệm PCR: có chức năng cân bằng pH của môi trường phản ứng trong suốt chu
kỳ nhiệt.

10


 dNTP: là tiền chất tổng hợp ADN gồm: dGTP dATP dCTP dTTP. Nồng độ
dNTP tốt nhất vào khoảng 200-250μMol.
 Nồng độ MgCl2: Cần thiết cho hoạt động của ADN polymerase.
 Một số thành phần khác như: Gelatin Albumin huyết thanh bò có tác dụng làm
tăng độ ổn định của enzyme.
Các bước tiến hành: Mỗi chu kỳ tiến hành theo 3 bước cơ bản:
Bước 1: Biến tính ADN khuôn.
Là giai đoạn làm tách hai mạch của ADN tạo điều kiện cho mồi gắn vào vị trí bổ
sung. Nhiệt độ biến tính từ 920C đến 950C thời gian biến tính phụ thuộc ADN khuôn
thường từ 30 giây đến vài phút.
Bước 2: Lai hay bắt gặp mồi.
Trong giai đoạn này nhiệt độ thường hạ xuống khoảng 360C (đối với các mồi
dùng trong RAPD-ADN) trong 30s để cho mồi bắt cặp với các sợi đơn tại trình tự bổ
sung. Nhiệt độ và thời gian cần thiết cho gắn mồi phụ thuộc vào thành phần base
chiều dài và nồng độ mồi. Nếu nhiệt độ gắn mồi cao làm giảm gắn mồi nhầm và kéo
dài nhầm ở đầu 3’ do đó làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng
Bước 3: Kéo dài chuỗi.
Đến giai đoạn 3 tăng nhiệt độ lên 720C trong 30s là nhiệt độ thích hợp nhất cho

hoạt động của enzyme ADN polymerase bền nhiệt để tổng hợp sợi mới theo nguyên
tắc bổ xung. Tốc độ tổng hợp vào khoảng 35-100 nucleotide một giây. Thời gian
tổng hợp tùy thuộc kích thước ADN sản phẩm.
Dựa vào phương pháp PCR người ta đã tạo ra nhiều phương pháp phân tích ADN
mới nhờ: RAPD, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)…
1.2.2. Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN) trong nghiên
cứu đa dạng sinh học
Nguyên lý: Dựa trên phản ứng PCR sử dụng một hay nhiều đoạn mồi có trình tự
tùy ý gồm 6-10 nucleotide để nhân một đoạn ADN giãn xoắn nào đó và đoạn ADN
được nhân lên này có thể phân tách và điện di trên gel đựợc.
Đặc điểm: Kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một mồi đơn – mồi này đóng vai trò vừa
là mồi xuôi vừa là mồi ngược. Mồi ngẫu nhiên thường là những đoạn
Oligonucleotide có kích thước nhỏ (5-12 nucleotide) với ADN thực vật thì đoạn mồi
gồm khoảng 10 nucleotide với yêu cầu tỷ lệ số nucleotide loại G C từ 70-80%.
1.2.3. Phương pháp mã hóa ADN (“ADN barcoding”) trong phân loại học

11


Phân loại học ngày nay gây ra nhiều trở ngại cho các nhà khoa học khi cần đưa ra
phương pháp nhận dạng nhanh, chính xác, có độ lặp lại cao và được chấp nhận rộng
rãi. Những vấn đề về phân loại học đã dẫn tới sự phát triển của phương pháp mới có
thể nhận dạng nhanh bất kì một loài nào dựa trên trình tự ADN thu được của loài đó.
Theo giả thuyết, các nhà khoa học đưa ra khái niệm “đoạn ADN được mã hóa”
(“ADN barcoding”) là một trình tự ADN có chiều dài từ 400 bp đến 800 bp có thể
được phân lập từ tất cả các loài thực vật hoặc động vật trên Trái Đất [23],[42]. Cùng
với sự phát triển của sinh học phân tử, công nghệ giải trình tự và phân tích dữ liệu
sinh học, đoạn ADN được mã hóa cho phép nhận biết hoặc khôi phục các thông tin từ
các loài đã biết và khám phá ra hàng nghìn loài mới. Đoạn ADN đã được mã hóa trở
thành công cụ thiết yếu cho các nhà phân loại học giúp nhận biết và quản lý được

toàn bộ hệ sinh thái rộng lớn và nhiều biến đổi [33].
Một đoạn ADN đã được mã hóa, theo định nghĩa đơn giản nhất, là một hoặc
nhiều đoạn trình tự gen ngắn được tách ra từ hệ gen của một loài được sử dụng để
nhận diện loài đó [33]. Đoạn trình tự gen này phải thỏa mãn ba tiêu chuẩn: (1) tính
đặc hiệu chứa những thông tin di truyền quan trọng của loài, (2) chứa những vị trí
thích hợp giúp việc gắn các cặp mồi PCR dễ dàng và (3) độ dài thích hợp để thuận
tiện cho việc tách chiết và giải trình tự ADN. Tiêu chuẩn thứ tư được một số nhà
khoa học đưa ra thêm đó là đoạn trình tự phải có chất lượng tốt [23],[25]. Paul Hebert
và đồng nghiệp (2003) là những người đầu tiên đề nghị ứng dụng những đoạn trình tự
ADN ngắn đã được mã hóa để nhận diện di truyền với mục đích có thể nhận diện
nhanh, tin cậy ở mức độ loài trong hệ sinh vật. Ứng dụng này được thực hiện đầu tiên
trên động vật [22], [23]. Sau đó, qua hàng loạt các nghiên cứu sàng lọc trên hệ gen
thực vật, ba vùng gen trong plastid (rbcL, matK và trnH-psbA) và một vùng gen trong
nhân (ITS) là những đoạn ADN tiêu chuẩn để lựa chọn trong hầu hết các nhận diện
các loài thực vật và nấm [20], [31], [40], [43].
Phương pháp nhận diện các loài dựa trên đoạn trình tự ADN đã được mã hóa
gồm hai bước cơ bản: (1) xây dựng thư viện gồm các đoạn ADN đã được mã hóa của
các loài đã biết và (2) nhận diện các loài chưa biết thông qua đối chiếu, so sánh đoạn
ADN được mã hóa của các loài chưa biết với các đoạn trình tự đã biết trong thư viện.
Thuật toán đồng bộ trình tự được sử dụng để đồng bộ một đoạn trình tự ADN chưa
biết với một đoạn trình tự ADN đã được mã hóa của loài đã biết thông qua tìm kiếm
dữ liệu trình tự giống nhất với trình tự chưa biết [24]. Ngân hàng gen (Genbank)

12


cung cấp công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) để tìm kiếm sự đồng
bộ giữa một trình tự chưa biết và một trình tự đã biết trong thư viện [33].
1.2.4. Vùng phiên mã nội của ADN Ribosom (ITS – rADN)
Nghiên cứu về ADN thực vật, có 3 loại ADN thường được chọn làm tượng

nghiên cứu, đó là: ADN nhân, ADN lạp thể và ADN ty thể. Trong số đó, ADN nhân
tỏ ra có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phân loại thực vật bởi ADN nhân có mức độ
tiến hóa nhanh hơn, cho phép phân tích được sự khác biệt về di truyền ngay cả giữa
các loài trong cùng 1 chi hay giữa các cá thể của cùng một loài. Trong cả chuỗi ADN
nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom
18S-26S và vùng phiên mã nội (internal transcribed spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp
về trình tự nucleotid [12]. Riêng vùng phiên mã nội (ITS), năm 1998, ngân hàng gen
thế giới (Genbank) đã công nhận 2900 trình tự này của các loài thực vật hạt kín [26].
Một khảo sát của Álvarez và Wendel (2003) thấy rằng khoảng 1/3 (34%) các nghiên
cứu công bố về phát sinh loài (phylogenetic analyses) trong vòng 5 năm chỉ dựa trên
duy nhất trình tự ITS [16].
Cấu trúc của ITS – rADN được xác định nằm trong vùng 18S – 26S ADN
ribosome nhân, gồm 3 phần: tiểu đơn vị 5.8S – trình tự có tính bảo tồn cao trong tiến
hóa và 2 vùng phiên mã nội ITS 1 và ITS 2[17]. Độ dài trình tự phần tiểu đơn vị 5.8S
gần như không khác nhau (163 hoặc 164 bp), trong khi đó độ dài vùng phiên mã nội
ITS có sự khác nhau ITS 1 (187 bp đến 298 bp) và ITS 2 (187 bp đến 252 bp). Toàn
bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới 700 bp [17].

Hình 1.2 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [26].
1.3. Phương pháp vân tay sắc ký
1.3.1. Vài nét về phương pháp vân tay sắc ký trong nghiên cứu
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học. Tất cả các
loại hình sắc ký đều có nguyên tắc tách giống nhau: mẫu phân tích được hòa tan

13


trong một pha động. Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới
hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được
cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di

chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha
tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu
sẽ tách riêng biệt thành dải, nhờ đó kỹ thuật này rất có giá trị trong việc tách, phân
lập, tinh chế và nhận dạng các thành phần trong hỗn hợp [28].
Theo Liang Y.Z và cộng sự (2004), dấu vân tay sắc ký của sản phẩm từ dược liệu
là một hệ sắc ký của hoạt chất và các thành phần hóa học khác có trong dược liệu, có
thể là từ dược liệu thô, bán thành phẩm hay thành phẩm bằng kỹ thuật phân tích thích
hợp. Các kỹ thuật thường được sử dụng để phân tích trong phương pháp dấu vân tay
sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC)[36], [45], [44].
Phương pháp vân tay ngày nay được chấp nhận trên toàn cầu để đánh giá chất
lượng của dược liệu làm thuốc. Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA)
chấp nhận vì phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng của các
sản phẩm và nguyên liệu có nguồn gốc dược liệu trong ứng dụng về hóa học, sản
xuất và kiểm soát (CMC) của trung tâm nghiên cứu thuốc mới (IND). Bên cạnh đó,
Pháp, Đức, Anh, Ấn Độ và Tổ chức Y Tế thế giới (WHO) cũng chấp thuận phương
pháp vân tay để đánh giá chất lượng của thuốc từ dược liệu. Cục quản lý thực phẩm
và dược phẩm Trung Quốc (SFDA) đã yêu cầu các nhà sản xuất tiêu chuẩn hóa thuốc
tiêm và nguồn nguyên liệu thô nguồn gốc dược liệu sử dụng phương pháp vân tay sắc
ký [44].
1.3.2. Phương pháp vân tay sắc ký dựa vào kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao (HPTLC).
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp phân tích vân tay thường được sử dụng
để phân tích dược liệu vì đơn giản, nhanh gọn và kinh tế. Ưu điểm chính của TLC là
kết quả cung cấp các hình ảnh ở ánh sáng thường và khi phát huỳnh quang, điều này
trực quan hơn so với sắc ký đồ, và với quá trình sử dụng máy quét sắc ký có thể quan
sát được mức độ khác nhau giữa các vết và toàn bộ dữ liệu liên quan. Tuy nhiên,
phương pháp phân tích dựa vào TLC cũng có một số hạn chế: độ phân giải thấp, độ
nhạy thấp và khó phát hiện được một hỗn hợp chất [44].
Halpaap (1973) là người đầu tiên nhận thấy rằng tiện ích của các hạt silicagel có

kích thước nhỏ (5-6 µm) về thời gian khai triển, giá trị hệ số lưu giữ Rf và chiều cao

14


bản mỏng khi chuẩn bị các bản TLC. Đến năm 1977, Zlatkis và Kaiser lần đầu tiên
công bố chính thức về HPTLC. Cùng với sự hỗ trợ của hệ thống máy móc, phương
pháp HPTLC cho khả năng tách tốt hơn và độ lặp lại của phương pháp cao hơn. Cho
đến ngày nay, phương pháp HPTLC đã được sử dụng rộng rãi như một hình thức tân
tiến nhất của công cụ TLC [28], [45] .
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) mà cụ thể là HPTLC thường được lựa
chọn để phân tích dấu vân tay sắc ký vì tính linh hoạt, nhanh và kinh tế. HPTLC có
thể nhận diện được nhiều mẫu khác nhau tại cùng thời điểm và có thể tách từ dịch
chiết thô của dược liệu với hệ dung môi thích hợp mà không cần quá trình tinh chế
trước đó. Nhìn chung phương pháp này có thể được sử dụng đầu tay để sơ bộ xác
định vân tay sắc ký của dược liệu.

15


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
- Mẫu nghiên cứu hình thái: Các mẫu thuộc một loài hoặc các loài khác nhau
trong chi Lonicera L. được thu tại các địa điểm khác nhau ở miền Bắc Việt Nam. Các
mẫu được làm tiêu bản và lưu trữ tại Phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội
(HNIP) với mã số tiêu bản lần lượt là HNIP/18137/15, HNIP/18126/15,
HNIP/18138/15, HNIP/18139/15, HNIP/18140/15, HNIP/18127/15, HNIP/18128/15
(Bảng 2.1).
- Mẫu nghiên cứu hóa học: Sau khi phân loại và giám định tên khoa học, các mẫu
hoa và cành mang lá đại diện cho loài và thứ/dạng được thu để phân tích thành phần

hóa học. Các mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 500C và bảo quản trong túi nylon, để nơi
khô, mát.
- Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền: Mỗi mẫu thu 5 mẫu lá, bảo quản trong
silicagel hoặc được bảo quản ngay trong tủ lạnh sâu -220C.
Bảng 2.1 Danh mục các mẫu nghiên cứu
STT

Kí Hiệu
Mẫu

1

Mã tiêu bản

Nơi Thu Mẫu

KN1

Xã Thống Nhất - Hoành Bồ - Quảng Ninh

HNIP/18137/15

KN2

Vườn Thực Vật – Trường Đại Học Dược
Hà Nội

HNIP/18126/15

3

KN3

Chợ Kim Ngưu - Hà Nội

HNIP/18138/15

4

KN4

Xã Quân Bình, Bạch Thông - Bắc Kạn

HNIP/18139/15

5

KN5*

Xã Yên Ninh - Phú Lương - Thái Nguyên

HNIP/18140/15

6

KN6

Xã Tả Phìn - Sa Pa - Lào Cai

HNIP/18127/15

7

KN7

Xã Quản Bạ - Quản Bạ - Hà Giang

HNIP/18128/15

2

Ghi chú: (*): Mẫu nhập nội
2.2. Địa điểm nghiên cứu
 Bộ môn Thực vật – Trường đại học Dược Hà Nội.
2.3. Phương tiện nghiên cứu
2.3.1. Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn
2.3.1.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền
 Nitơ lỏng.
 Bộ kít chiết tách ADN thực vật GeneJET – số lô 00209197 (Thermo Scientific).

16


 Dung dịch đệm TAE 1X: Lấy từ dung dịch gốc TAE 50X có thành phần như
sau: tris base (Sigma): 121g, acid acetic glacial (Sigma): 28,6 ml, EDTA (Sigma) 0,5
M pH 8,0: 50 ml, nước khử ion vừa đủ: 500 ml.
 Ethidium bromid (EtBr): 10 mg/ml (Sigma).
 Gel agarose 1%: Lấy 0,5 g agarose, bổ sung 50 ml đệm TAE 1X, đun cho tan
dung dịch agarose trong lò vi sóng khoảng 90 giây. Để nhiệt độ hạ xuống khoảng
60oC, thêm 10 µl EtBr rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu.

 Thang ADN 100 bp chuẩn (Thermo Scientific).
 Các cặp mồi ITS1 (5’–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3’) và ITS4 (5’–
TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3’) (Integrated ADN Technologies); ITS5 (5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) và ITS4 (5’–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3’) (Integrated ADN Technologies).
2.3.1.2. Nghiên cứu hóa học
 Chất chuẩn: Acid chlorogenic (VKNTU), luteolin-7-O-glucoside.(VKNHCM)
 Dung môi: Methanol, ethyl acetate, nước cất, acid acetic, acid formic
 Thuốc thử: Vanilin/dung dịch acid sulfuric. Acid boric/ acid oxalic
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển
Việt Nam IV.
2.3.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.3.2.3. Mô tả đặc điểm thực vật.
Dụng cụ sử dụng trong phân tích bao gồm: Kính lúp soi nổi Nikon SMZ 745T,
máy ảnh kỹ thuật số chụp trực tiếp hoặc máy ảnh chụp qua kính lúp soi nổi.
2.3.2.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền
 Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu -220C (Biomedical Freezer – Sanyo).
 Dụng cụ tách chiết bao gồm: Chày, cối sứ, máy ly tâm để bàn tốc độ cao
Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu -220C, ống eppendorf (0,2 ml; 1,5 ml), bể ổn nhiệt
Memmert WNB10, máy lắc vortex IKA.
 Dụng cụ nhân gen: Eppendorf Mastercycler Pro S, máy soi chụp ảnh gen UVP
Gel-docIt , máy điện di Consort EV 222.
2.3.2.3. Nghiên cứu hóa học
 Cân kỹ thuật sartorius, độ chính xác 0,01 g.
 Máy xác định hàm ẩm ADN MF-50.
 Máy chiết siêu âm.

17