Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon trong nước thải công nghiệp dược bằng LC MS trên MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG
NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC
BẰNG LC- MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG
NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC
BẰNG LC- MS/MS
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ : 60720410

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015


LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Kiều Anh, người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong
suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên
Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện
Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong thời gian
thực hiện đề tài. Em cũng xin cảm ơn quỹ Nafosted đã tài trợ một phần kinh
phí để em thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ,
động viên em hoàn thành luận văn.
Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhưng không
trách khỏi những thiếu sót, em kính mong ý kiến chỉ bảo, phê bình của quí
thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 8 năm 2015
Học viên
Nguyễn Thị Hạnh

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon.............................................. 3
1.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon................................................. 3
1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu............................................ 5
1.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ ............................ 6

1.2.1. Sắc ký lỏng ......................................................................................... 6
1.2.2. Khối phổ ............................................................................................. 7
1.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ.................................................................... 11

1.2.4. Ứng dụng của sắc ký lỏng 2 lần khối phổ......................................... 12
1.2.5. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký..................................... 12
1.3. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải..... 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 15
2.2. Phương tiện nghiên cứu......................................................................... 15
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn...................................................... 15
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ .............................................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử.................................. 16
2.3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký ........................................... 17
2.3.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu...................................................... 18

2.3.4. Thẩm định phương pháp ................................................................... 18
2.3.5. Ứng dụng phân tích mẫu thực ........................................................... 20
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................... 21
3.1. Xây dựng quy trình phân tích............................................................... 21
3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo khối phổ................................................... 21
3.1.2. Khảo sát các điều kiện của sắc ký ..................................................... 23
3.1.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .......................................................... 29
3.1.4. Quy trình phân tích............................................................................ 33
3.2. Đánh giá phương pháp .......................................................................... 35
3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống................................................................. 35
3.2.2. Tính đặc hiệu của phương pháp ........................................................ 36
3.2.3. Độ tuyến tính ..................................................................................... 39
3.2.4. Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp............................................ 40
3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn đ ịnh lượng....................................... 43
3.3. Ứng dụng quy trình, xác định dư lượng kháng sinh có trong nước
thải công nghiệp dược ................................................................................... 46
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 48
4.1. Về phương pháp xử lý mẫu .................................................................. 48
4.2. Về phương pháp phân tích.................................................................... 48
4.3. Về thẩm định phương pháp ................................................................. 50
4.4. Về ứng dụng phương pháp ................................................................... 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

MeOH
MOXI
OFLO
CIP
NOR
HPLC

tR

Methanol
Moxifloxacin
Ofloxacin
Ciprofloxacin
Norfloxacin
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
Sắc kí lỏng khối phổ (High performance liquid chromatography
–Mas Spectrometry)
Thời gian lưu

S

Diện tích pic

TB

Trung bình

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

IS

Chuẩn nội (Internal Standard)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

AOAC

Association of Official Agricultủal Chemists

PA

Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

API

Ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization)

ESI

Ion hóa tia điện (Electrospray Ionizaton)

APCI

Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Chemical Ionization)

APPI

Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric
Pressure Photoionization)
Dược điển Mỹ 38 (The United States Pharmacopoeia) (bản
online)

HPLC-MS

USP 38


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon ... 48
Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu ……5
Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu .. 15
Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và IS ...................... 23
Bảng 3.2 : Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích chiết ....................... 31
Bảng 3.3: Hiệu suất chiết các kháng sinh khi dùng các dung môi rửa giải
khác nhau ...................................................................................... 32

Bảng 3.4 : Kết quả xác định độ thích hợp hệ thống ................................... 36
Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp ...................... 39
Bảng 3.6.a : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức LQC) ........ 41
Bảng 3.6.b : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức MQC) ...... 42
Bảng 3.6.c : Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (mức HQC) ....... 43
Bảng 3.7 : Kết quả giá trị LOD, LOQ của phương pháp .............................. 45
Bảng 3.8 : Kết quả phân tích mẫu nước thải ở một số cơ sở sản xuất .......... 46


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống LC- MS .................................................................. 6
Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI ............................................. 9
Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba ........................ 10
Hình 3.1: Phổ đồ của các chất phân tích ....................................................... 22
Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột SB- C18 với
các thể tích tiêm mẫu 1, 5, 10 µl .................................................. 24
Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh quinolon bằng cột Eclipse- C18
với các thể tích tiêm mẫu 5, 10, 20 µl ......................................... 25
Hình 3.4: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khảo sát các tốc độ dòng 0,3;
0,5; 0,6 ml/phút ............................................................................ 27
Hình 3.5: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát pha động ........... 29
Hình 3.6: Sắc ký đồ các kháng sinh quinolon khi khảo sát thể tích chiết ..... 31
Hình 3.7: Biểu đồ hiệu suất chiết của các dung môi rửa giải ........................ 33
Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu ...................................................... 38
Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định giá trị LOD, LOQ của phương pháp .............. 44


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thực trạng kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu,
đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam với gánh nặng về các bệnh

nhiễm khuẩn và chi phí bắt buộc cho việc thay đổi kháng sinh cũ bằng kháng
sinh mới. Trong khi các kháng sinh mới ra đời ngày càng ít, thì việc kháng
các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế
hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người. Nguyên nhân do
trình độ dân trí còn hạn chế, lạm dụng kháng sinh liều cao, kháng sinh mạnh,
sử dụng kháng sinh mà không có chỉ định của bác sĩ làm gia tăng tỷ lệ kháng
kháng sinh. Ngoài ra, lượng kháng sinh tồn dư trong nước thải sinh hoạt, bệnh
viện hay từ các công ty sản xuất dược phẩm cũng là nguyên nhân quan trọng
dẫn tới sự đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn [7]. Theo kết quả nghiên cứu
ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng (2009- 2010)
về tình trạng kháng thuốc kháng sinh, tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm
cephalosporin thế hệ 3,4 là 66-83%, fluoroquinolon 60%, imipenem 35% [9].
Theo qui định của cục Quản lý Dược hiện nay, các công ty sản xuất
thuốc nói chung và các công ty sản xuất kháng sinh nói riêng muốn sản xuất
kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP với hệ thống xử lý nước thải. Tính từ
năm 2009 đến tháng 7/2014, theo số liệu của Cục quản lý Dược Việt Nam, số
kháng sinh sản xuất trong nước nhóm quinolon được cấp số đăng ký chiếm tỷ
lệ tương đối so với các kháng sinh nhóm khác. Nếu như kháng sinh
Ciprofloxacin có 49 lượt, Ofloxacin có 31 lượt cấp phép đăng kí sản xuất thì
Cefadroxil có 27 lượt, Metronidazol 37 lượt được cấp số đăng kí. Tuy vậy,
theo quy định hiện hành về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về môi trường của
Bộ Tài nguyên và Môi trường năm 2011, lại chưa có quy định giới hạn mức
hàm lượng cụ thể của kháng sinh trong nước thải [3]. Trong khi đó, chỉ một
lượng nhỏ tồn dư kháng sinh trong môi trường tích tụ lâu ngày sẽ làm biến

1


đổi gen của các vi sinh vật. Nguyên nhân này góp phần làm gia tăng tỷ lệ
kháng kháng sinh ở nước ta. Vì vậy, vấn đề cấp thiết đặt ra là phải có phương

pháp xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải của các công ty sản xuất
nhằm hạn chế sự phát tán của kháng sinh trong môi trường.
Ở Việt Nam, đã có một vài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định
dư lượng kháng sinh trong nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay công ty dược.
Các nghiên cứu này tập trung phân tích, định lượng hàm lượng của một kháng
sinh cụ thể hoặc hỗn hợp nhiều kháng sinh. Tuy nhiên, chưa có đề tài nào về
xác định hàm lượng nhóm kháng sinh quinolon trong nước thải từ các cơ sở
sản xuất dược phẩm trong khi đây là nhóm kháng sinh được sử dụng và sản
xuất khá rộng rãi ở nước ta. Vì vậy, cần thiết phải xây dựng được một phương
pháp xác định giúp phát hiện sự có mặt, với dư lượng kháng sinh ở hàm lượng
thấp trong nước thải công nghiệp dược góp phần giảm thiểu nguy cơ phát tán
kháng sinh ra ngoài môi trường, từ đó, làm giảm khả năng kháng kháng sinh.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
xác định dư lượng một số kháng sinh Quinolon trong nước thải công
nghiệp Dược bằng LC- MS/MS” với các mục tiêu chính như sau:
1. Xây dựng được phương pháp xác định dư lượng một số kháng sinh
nhóm quinolon (Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin và Norfloxacin) có
trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng LC- MS/MS ở nồng độ ppb.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để xác định dư lượng của
một số kháng sinh quinolon có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược trong
nước.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH NHÓM QUINOLON
1.1.1. Vài nét về kháng sinh nhóm quinolon [6], [11]
* Nguồn gốc
Không giống như một số thuốc kháng sinh đầu tiên được phát hiện

trong thế kỷ trước, các kháng sinh quinolon không phân lập từ các sinh vật
sống, mà được tổng hợp bởi các nhà hóa học.
* Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
Công thức cấu tạo chung

Phân loại và phổ tác dụng: có nhiều cách phân loại quinolon như phân loại
dựa trên phổ tác dụng và công dụng, dựa vào phân tử có hoặc không có fluor.
Ngày nay, các quinolon được phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:

3


Bảng 1.1: Phân loại và phổ tác dụng của các kháng sinh nhóm Quinolon
Quinolon

Phổ tác dụng

Công dụng

Thế hệ I

Enoxacin

Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), Nhiễm khuẩn tiết
đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu chưa biến chứng
niệu Enterobacter, Không tác dụng
trên P.aeruginosa

Flumequin

T1/2 ngắn, bài tiết qua nước tiểu

Acid nalidixic
Cinoxacin

Thế hệ II
Phổ rộng với Gram (-), cả
P.aeruginosa.
Tác dụng trên một số Gram (+), bao
gồm cả Staphylococcus pneumoniae,
trừ Streptococcus pneumonia.
T1/2 dài hơn.

Nhiễm khuẩn tiết
niệu, nhiễm khuẩn bể
thận, sinh dục, tiền
liệt tuyến, da và mô
mềm

Gemifloxacin

Phổ rộng với Gram (-), một số cả trên
P.aeruginosa; Phổ mở rộng trên
Gram (+), cả S. pneumoniae và các vi
khuẩn đã kháng penicillin.

Gatifloxacin

Một số có thời gian bán thải dài hơn.

Đợt cấp của viêm phế
quản mạn tính, viêm
phổi mắc phải ở cộng
đồng, nhiễm khuẩn
mô mềm, xương

Ciprofloxacin
Ofloxacin
Norfloxacin
Lomefloxacin
Thế hệ III
Levofloxacin
Moxifloxacin

Thế hệ IV
Grepafloxacin
Trovafloxacin
Alatrovafloxacin

Như thế hệ III. Phổ mở rộng với các
vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không
điển hình.
Một số có thời gian bán thải dài hơn.

Như thế hệ I, II, III
(trừ nhiễm khuẩn
niệu phức tạp), nhiễm
khuẩn đường hô hấp,
ổ bụng, vùng chậu

* Cơ chế tác dụng
Các quinolon đều ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN,
giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi
khuẩn. Ngoài ra còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi
khuẩn. Các quinolon đều là thuốc diệt khuẩn.
4


1.1.2. Đặc tính của các kháng sinh nghiên cứu [8], [21]
HIện nay, các kháng sinh quinolon thế hệ I ít sản xuất, kháng sinh thế
hệ IV ít hoặc hầu như chưa sản xuất ở Việt Nam. Các kháng sinh thế hệ II và
III được sản xuất khá phổ biến. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số
kháng sinh quinolon nhóm II và III, các chất này có công thức hóa học và tính
chất lý hóa như sau:
Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học và tính chất của các kháng sinh nghiên cứu
Quinolon

CTHH

Tính chất

Moxifloxacin

C21H24FN3O4, MW: 401.431
Ciprofloxacin

Bột hay tinh thể màu vàng
hoặc vàng nhạt. Tan trong
nước, ít tan trong EtOH.
pKa1 = 5,69; pKa2 = 9,42

Bột kết tinh màu hơi vàng.
Tan trong nước, khó tan
trong MeOH, EtOH.

C17H18FN3O3 , MW: 367.80
Norfloxacin

pKa1 = 5,76; pKa2 = 8,68
Bột kết tinh màu trắng ngà
đến ánh vàng.
pKa1 = 5,77 ; pKa2 = 8,68

C16H18FN3O3 ; 319.34
Ofloxacin

Tinh thể hình kim không
màu. Ít tan trong H2O hoặc
EtOH
pKa1 = 5,45; pKa2 = 6,2
C18H20FN3O4, 361.38

5


1.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ là phương
pháp phân tích được sử dụng rộng rãi hiện nay để nghiên cứu các chất với khả
năng xác định hàm lượng vết chất phân tích và ứng dụng trong quá trình nhận
biết, phân tích cấu trúc phân tử của các chất hữu cơ.

Về cơ bản, đây là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ.

Hình 1.1 : Sơ đồ hệ thống LC- MS
1.2.1. Sắc ký lỏng [1], [12]
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất
rắn được nhồi trên cột và pha động là chất lỏng. Mẫu phân tích được đưa lên
cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành sắc ký, các chất phân tích được
phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích,
do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau nên khả năng
tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy chúng di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
a. Pha tĩnh
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ lưu giữ chất
phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ từ 3-7 μm.
Trong phần tổng quan này, chúng tôi trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là
loại kỹ thuật phổ biến nhất và cũng là kỹ thuật được sử dụng trong nghiên
cứu. Tùy theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân bố
được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
* Sắc ký lỏng pha đảo: Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn
6


các nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol như cột C8, C18, cột
Phenyl...
* Sắc ký lỏng pha thuận: Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyd (silica) có gắn
các nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 bằng các gốc phân
cực như gốc Cyano, Amino... ví dụ như cột Silica, Cyano, Amino, ...
b. Pha động
Trong HPLC, pha động là các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ
hoặc dung dịch đệm được hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân

giải phù hợp.
Yêu cầu:
- Độ tinh khiết cao.
- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh.
- Không có bọt khí, không có tiểu phân (siêu âm, lọc).
Có 2 cách dùng pha động để rửa giải:
- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá
trình sắc ký.
- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc
ký. Chế độ gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần
với khả năng phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ
phân giải.
Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà
còn góp phần vào khả năng ion hóa của chất. Chúng có những yêu cầu cao
hơn về độ tinh khiết, hàm lượng các tạp chất. Có những dung môi được sản
xuất riêng cho LC-MS/MS.
1.2.2. Khối phổ (Mass Spectrometry) [1], [12], [22]
Đầu dò MS được nối với đầu ra của cột sắc ký. Việc phân tích khối phổ
(phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion”) dựa trên sự bắn phá

7


các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích
hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng
cao (như va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion...).
1.2.2.1 Nguyên tắc

Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi
qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong

buồng ion hóa áp suất khí quyển (API- Atmospheric Pressure Ionization) với
kiểu ion hóa tia điện (ESI- Electrospray Ionizaton), ion hoá hoá học ở áp suất
khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization- APCI), hoặc ion hóa
bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure PhotoionizationAPPI). Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa
vào bộ phân tích khối, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion. Từ
đó, xác định các chất.
1.2.2.2. Cấu tạo bộ phận phân tích khối phổ
a. Nguồn ion
Có 3 kỹ thuật ion hóa được sử dụng là ion hóa tia điện (ESI), ion hoá
hoá học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí
quyển (APPI).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng máy phân tích với bộ phận
ion hóa bằng kỹ thuật ESI để ion hoá các phân tử trung hoà thành các ion
phân tử, các mảnh ion hoặc các gốc mang điện tích. Đây là kỹ thuật ion hóa
được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng
phân tử lớn và được xem là kỹ thuật ion hóa “êm dịu” hơn APCI, thích hợp
cho phân tích các hợp chất sinh học như protein hoặc các polyme công nghiệp
như polyethylen glycol.
Với kỹ thuật ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện
thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương
nhỏ mang điện tích tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng
8


làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Đến một giới hạn, các hạt sương bị
phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề
mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ.
Sau đó, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau
rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối.
Trong ESI, các ion được hình thành như sau:

Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
b. Bộ phận phân tích khối (Mass analyzer)
Các ion hình thành ở nguồn ion hoá sẽ đi vào bộ phận phân tích khối.
Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau
thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi
đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.
Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích
tứ cực, bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight- TOF). Bộ phân tích
khối tứ cực chập ba được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây
cũng là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một
khoảng trống để các ion bay qua, được đóng vai trò như bộ lọc khối. Khi một
trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện
thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào

9


tỉ số m/z và trường RF. Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi
qua được bộ lọc này.
Bộ phân tích khối tứ cực chập ba gồm ba tứ cực được ghép nối với
nhau. Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion
mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực
thứ 2 (Q2) với áp suất cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ
có mặt như khí N2, Ar, He. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách
Q3 có nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận phát hiện.

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba
c. Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần
cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Có hai loại bộ phận phát
hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (electron multiplier) và bộ
phận phát hiện nhân quang (photomultiplier). Bộ phận phát hiện nhân electron
là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào
bề mặt dinod làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới
các dinod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành
dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị
nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinod tạo ra dòng các electron.
Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn
chắn phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi
một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương
10


pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được
các khả năng nhiễm bẩn.
1.2.3. Một số kỹ thuật ghi phổ

Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :
* Quét toàn phổ (Full Scan)
Khi thao tác với chế độ scan, detector sẽ nhận được tất cả các mảnh ion
để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.
Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ
lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn
để khảo sát ion mẹ.
* Chế độ chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring: SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion
đặc trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã
được lựa chọn trước đó. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM

thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
* SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction

Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường
được sử dụng là SRM và MRM.
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để
phát hiện.
MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi
phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ
cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va
chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ

11


cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.4. Ứng dụng của LC-MS/MS
- Nghiên cứu hợp chất mới, đặc biệt là nghiên cứu phát triển thuốc.
- Nghiên cứu, xác định hợp chất sinh học phức tạp, định dạng protein.
- Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng trưởng.
- Phân tích, định lượng thuốc trong dịch sinh học: theo dõi thông số dược
động học, sinh khả dụng, theo dõi điều trị.
- Phân tích, định lượng thuốc trong các mẫu nước thải bệnh viện, nước thải
của các nhà máy sản xuất dược phẩm, các mẫu nước tự nhiên.
1.2.5. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
Các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức
tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc

phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta
cần phải tách, làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều
phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng,
sắc ký cột, chiết Soxhlet, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction– SPE)....
nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.
- Cô đặc mẫu
- Lượng mẫu không cần nhiều.
- Lượng dung môi tiêu thụ ít.
- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu.
- Đơn giản, nhanh.
Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu mà
chúng tôi chọn phương pháp SPE để xử lý mẫu.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được

12


với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi
cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp
thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất
hấp phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm
tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của
mẫu thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương
đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi
có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua

cột khoảng 0,5 – 1 ml/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột
nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra
khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này
phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường
rửa với tốc độ khoảng 1ml/phút.
1.3. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon trong nước thải ở
Việt Nam và trên thế giới
Các kháng sinh quinolon có phổ tác dụng rộng, hoạt lực mạnh, được sử
dụng trong nhiều trường hợp, nên đây là những kháng sinh được quan tâm
nghiên cứu nhiều với nền mẫu phong phú như: trong chế phẩm, dịch sinh học,
các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh viện, công ty dược.
Phương pháp định tính, định lượng cũng đa dạng từ phương pháp vi sinh,
quang học, HPLC detector huỳnh quang với độ nhạy và tính chọn lọc cao,
nhưng lại khó có thể phân tích các nhóm kháng sinh có trong nước thải với
mức giới hạn cho phép thấp (ppb). Các nghiên cứu sử dụng trên thống HPLC13


MS/MS trên nền mẫu nước thải cũng được thế giới nghiên cứu, nhưng chưa
được áp dụng với nước thải công nghiệp dược ở Việt Nam. Một số nghiên
cứu xác định dư lượng một số kháng sinh quinolon như sau:
- Dương Hồng Anh và cộng sự (2007) đã phân tích lượng vết một số kháng
sinh họ Floquinolon trong nước thải bệnh viện dựa trên hai giai đoan chiết
tách và làm giàu bằng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết cation hỗn
hợp, định tính, định lượng bằng HPLC với detectơ huỳnh quang. Quy trình có
hiệu suất thu hồi cao (trung bình 84 - 101%), giới hạn định lượng 0,5 - 1 μg/L
[2].
- Jay E.Renew và Ching Hua Huang (2004) đã định lượng đồng thời các
kháng sinh fluoroquinolon trong nước thải bằng phương pháp LC- MS sử

dụng cột C18, tốc độ 0,25 ml/phút, chương trình gradient: pha động A (1mM
CH3COONH4; 0,007 % acid acetic băng; 10% ACN), pha động B (100%
ACN). Phương pháp có độ thu hồi trên 90% với 1 µg/L với các chất phân
tích, giới hạn phát hiện trong khoảng 20 – 50 ng/L [24].
- Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và đánh giá dư lượng của 7
kháng sinh, trong đó có ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin
trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ. Nghiên cứu đã sử dụng kỹ
thuật chiết pha rắn và phương pháp LC-MS/MS với LOD của phương pháp từ
0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh [31].
- N. Dorival – Garcia và cộng sự (2013) đã xây dựng phương pháp phát hiện
13 kháng sinh quinolon trong nước thải sử dụng chiết pha rắn và hệ thống
HPLC- MS/MS sử dụng cột UPLC. Giới hạn phát hiện của phương pháp
trong khoảng 0,02 – 0,04 ng/ml, giới hạn định lượng trong khoảng 0,07 – 0,15
ng/ml, độ thu hồi từ 98,5% - 103,9% tùy thuộc vào mỗi kháng sinh [29].

14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh
Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, kiểm tra bằng LCMS/MS không phát hiện có các kháng sinh này.
Mẫu tự tạo: pha loãng dung dịch chuẩn gốc với mẫu trắng, lắc đều thu
được dung dịch mẫu tự tạo.
Mẫu thử: nước thải của các công ty sản xuất dược phẩm.
Các

chất

nghiên

cứu:

Moxifloxacin,

Ofloxacin,

Norfloxacin,

Ciprofloxacin, Ciprofloxacin 13C3.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn
Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Tên chất
Hóa chất, Acetonitril
thuốc thử
Methanol
HCl
Acid formic
Na2EDTA
Triethanolamin
Nước cất
Chất chuẩn Moxifloxacin
Ofloxacin
Norfloxacin
Ciprofloxacin
hydroclorid
Ciprofloxacin
13C3 (IS)

Nguồn gốc
Merck (Đức)
Merck (Đức)
Trung Quốc
Merck (Đức)
Merck (Đức)

Tiêu chuẩn
Hàm lượng
Dùng cho HPLC
Dùng cho HPLC
PA
36,36%
Dùng cho HPLC
PA
Siêu tinh khiết

Chuẩn
nguyên liệu
Viện KNTW SKS 0310887.02
Viện KNTW SKS 0208148
Viện KNTW SKS 0212029.02
Aldrich
SCJI-017
Sigma (Mỹ)

15

96,38 %
99,99%

99,14%
93,47%
99,99%


2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ gồm có :
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LCMS/MS (Mỹ)
- Cột Agilent SB C18 (1,8 μm; 2,1 x 50mm) ; Cột Agilent Eclipse XDBC18 (3,5μm; 3,0 x 150mm).
- Cột chiết pha rắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, Oasis
(Mỹ)
- Máy lắc siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn quốc)
- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)
- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 (chính xác đến 0,1mg) (Thụy Sỹ)
- Cân Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg) (Thụy Sỹ)
- Máy lọc hút chân không
- Màng lọc 0,45 μm và 0,2 μm Cellulose acetat, Sartorius (Đức)
- Máy lọc nước siêu tinh khiết
- Tủ lạnh
- Dụng cụ thủy tinh các loại: bình định mức 10 ml, pipet chính xác, các
dụng cụ thủy tinh, micro pipet, vial...
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu thử
Thời gian lấy mẫu: 1/8 – 17/08.
Vị trí lấy mẫu: lấy mẫu tại bể nước thải trước khi đổ ra môi trường của
các công ty sản xuất dược phẩm.
Lọc, điều chỉnh đến pH = 2.
Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2- 80C nếu phân tích ngay trong 24 giờ hoặc
bảo quản ở tủ lạnh sâu – 300C trong vòng 1 tháng.

16


2.3.2. Khảo sát, lựa chọn các điều kiện sắc ký
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn của từng kháng sinh, IS và hỗn hợp

các kháng sinh với IS pha trong dung môi pha động.
* Khảo sát điều kiện khối phổ: Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa,
điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn mảnh ion con có cường độ
lớn nhất dùng để định lượng.
* Khảo sát các thông số sắc ký
- Cột: Để lựa chọn cột phân tích, sử dụng cột Agilent SB C18 (1,8µm;
2,1x50mm) và cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5µm; 3,0 x 150mm) phân
tích dung dịch chuẩn của các kháng sinh ở nồng độ 100ppb và tiến hành kiểm
tra khả năng tách và thời gian lưu. Lựa chọn cột có khả năng tách, pic chất
phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách
rõ ràng, pic cân đối, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
- Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài, đáp
ứng của chuẩn nội tốt. Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là
Ciprofloxacin 13C3. Đây là đồng vị carbon C13 của Ciprofloxacin, không có
sẵn trong tự nhiên.
- Chương trình pha động: Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát
pha động ACN (0,1% HCOOH) : H2O (0,1% HCOOH) với tỷ lệ thể tích / thể
tích khác nhau và chạy chế độ gradient khác nhau. Pha động được chọn phải
đảm bảo pic cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu
khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài.
- Tốc độ dòng: Khảo sát lần lượt các tốc độ 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút để xác định
tốc độ phù hợp. Chọn tốc độ cho pic cân đối, ít doãng và thời gian lưu ngắn.
- Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi thể tích tiêm 1, 5, 10, 20μl để xác định thể tích
tiêm phù hợp cho sắc ký đồ đẹp, diện tích pic và độ đáp ứng cao.

17