Thực hành công nghệ protein - enzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

TH CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYME
GVHD: ThS. Lê Thanh Hải
CHUYÊN NGÀNH: Công Nghệ Sinh Học Ứng Dụng
NIÊN KHÓA: 2012 – 2015
SVTH: Nhóm 3 (C8UD1)

Thành Phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2014


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

MỤC LỤC
MỤC LỤC HÌNH

MỤC LỤC BẢNG

GV: ThS. Lê Thanh Hải

2


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ

FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)
1/ Nguyên tắc
Các aldehyde dễ kết hợp với nhóm amin. Khi cho formaldehyde tác dụng với acid
amin, nhóm amin bị methylen hóa tạo thành dẫn xuất methylen amino acid. Hợp
chất tạo thành có tính acid mạnh hơn acid amin tự do, các nhóm carboxyl của
chúng dễ dàng định phân bằng kiềm, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin
của các acid amin có trong dung dịch.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất

•
•

- Nước mắm

: 1ml

- Dung dịch NaOH 0,05N

: 100ml

- Dung dịch HCl 0,05N

: 30ml

- Formol trung tính

: 10ml

- Bromthymol blue 0,04%

: 20ml

- Phenolphtalein 0,5%

: 20ml

- Dung dịch đệm phosphate pH = 7

: 50ml

Dung dich A: 27,8 g Na2HPO4 hoà tan trong 1000ml
Dung dịch B: 53.05g Na2HPO4 .7H2O hoặc 71.1g Na2HPO4.12H2O pha trong

1000ml
• Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ
sau: Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nước vừa đủ 200ml.
Dung dịch đệm phosphate pH = 9,2

: 50ml

(Hòa tan 456g kali hydro phosphate ngậm 3 phân tử nước (K2HPO4.3H2O) trong
1000ml nước cất).

GV: ThS. Lê Thanh Hải

3


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Bình định mức 100ml

: 1 bình

- Pipette 1ml

:2

- Pipette 10ml

:2

- Erlen 100ml

: 6 bình

- Burette 25ml

:1

- Becher 100ml

: 4 cái

2.3. Tiến hành
Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9,2
Lấy 2 erlen 100ml:
- Cho vào bình thứ nhất: 20ml dung dịch có pH 7,0 và 5 giọt bromthymol blue

0,04%
có màu xanh lục nhạt
- Cho vào bình thứ hai: 20ml dung dịch có pH 9,2; 5 giọt bromthymol blue 0,04%
và 3 giọt phenolphtalein 0,5%
có màu tím xanh (màu xanh ánh tím)
Màu của các dung dịch trên giữ trong bình kín có thể bền trong nửa tháng.

Hình 1.1 Dung dịch Ph 9,2 (bên trái), pH 7,0 (phải)
GV: ThS. Lê Thanh Hải

4


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm:
Nước mắm là một dung dịch thủy phân protein có thể định lượng nitơ bằng phương
pháp chuẩn độ formol. Do nước mắm có màu tối cần phải pha thật loãng mới có thể so
màu của chất chỉ thị.
Lấy 1ml nước mắm cho vào bình định mức 100ml, dùng nước cất định mức thành
100ml, lắc đều.
Lấy vào bình erlen có cùng dung tích với 2 bình màu chuẩn 20ml dịch mẫu pha loãng
từ bình định mức, thêm 5 giọt bromthymol blue. Nếu dung dịch có màu xanh dương thì
thêm từng giọt HCl hay H2SO4 0,05N; nếu dung dịch có màu vàng thì thêm từng giọt
NaOH 0,05N cho đến khi dung dịch có màu ứng với màu của bình 1 có pH 7,0.
Thêm 3 giọt phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính rồi chuẩn độ bằng NaOH
0,05N cho đến khi hỗn hợp có màu ứng với màu của dung dịch trong bình 2 có pH 9,2.
Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nước
cất.

Hình 1.2: Bình mẫu, bình pH 9,2 và bình kiểm chứng (từ trái sang phải) sau quá
trình chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05N
GV: ThS. Lê Thanh Hải

5


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

2.4. Kết quả
Số gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm:
7,231(g)
Trong đó:
x: lượng gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm
a: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm
b: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng
T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn
V: số ml nước mắm cho vào bình định mức
0,0007: số gram nitơ với 1ml NaOH 0,05N

GV: ThS. Lê Thanh Hải

6


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE
1/ Nguyên tắc
Đây là phản ứng thường dùng để phát hiện liên kết peptide (-CO-NH-). Phản ứng

xảy ra đối với các chất chứa từ hai liên kết peptide trở lên. Phản ứng này dùng để
định lượng protein bằng cách lập đồ thị chuẩn với các dung dịch protein chuẩn có
nồng độ xác định nhờ kỹ thuật so màu. Nồng độ protein tối thiểu để định lượng
chính xác là 10mg/ml.
Tùy thuộc vào gốc R mà màu phản ứng có thể là màu xanh tím, tím hoặc hồng.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Dung dịch CuSO4 1%

: 20ml

- Dung dịch NaOH 10%

: 20ml

- Ure

: 2 – 3g

- Dung dịch lòng trắng trứng 1%

: 40ml

2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Ống nghiệm

: 04 ống

- Pipette 1ml

: 02 pipette

- Pipette 5ml

: 01 pipette

- Becher 50ml

: 03 cốc

2.3. Tiến hành
Lấy ống nghiệm khô, sạch cho vài tinh thể ure, đun nhẹ tới nóng chảy, khô cứng tạo
thành biure khi có NH3 bay hơi, nhận biết bằng mùi hoặc thử bằng giấy quỳ đo pH.
Để nguội thêm vào 2 ml dung dịch NaOH 10%, lắc đều cho tan hết và thêm 2 – 3
GV: ThS. Lê Thanh Hải

7


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

giọt dung dịch CuSO4 1%. Lấy ống nghiệm thứ hai cho 1ml dung dịch lòng trắng
trứng, 1ml dung dịch NaOH 10%, thêm 2 – 3 giọt CuSO 4 1%, lắc đều.

có

màu tím
2.4. Kết quả
Chụp hình, ghi màu và viết phương trình phản ứng của 2 phản ứng trên.

Hình 2.1: Ống 1 (phải, Biure), Ống 2 (trái, albumin)
Ở ống 1 (BIURE): Khi đun ure trên ngọn lửa đèn cồn thì ta thấy tinh thể ure tan,
bay hơi một ít rồi kết tinh lại (khí NH3 bay hơi). Nhưng sau đó khi cho 1-2ml dung
dịch NaOH 10% vào thì ta thấy tinh thể ure tan ra tạo thành dung dịch lỏng không
màu. Khi lắc rồi cho thêm dung dich CuSO4 1% vào thì dung dịch hóa màu hồng
nhạt.
Acide cianuric

nhỏ NaOH 10%

NH3 (bay hơi)

cianuric được trung hòa)

Urea đun

Biure (2 phân tử Ure kết hợp tạo thành)

làm xuất hiện liên kết

peptide (-CO-NH-). Trong môi trường kiềm Biure +CuSO4 cho phức muối Cu có
màu tím hồng

GV: ThS. Lê Thanh Hải

8


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Ống 2: Trong dung dich lòng trắng trứng (Albumin) cũng có liên lết peptide nên
cũng có phản ứng Biure tạo phức hợp muối Cu với polypeptide có màu tím xanh.
Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide trong phân tử protein phản ứng với
CuSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc mà tím đỏ. Tùy theo độ dài của mạch
peptide mà màu của phức sẽ biến thiên từ xanh tím đến tím đỏ.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

9


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN
1/ Nguyên tắc
Các phân tử protein là các polymer có tính điện ly lưỡng cực. Trong dung dịch, khi
pH thay đổi nó phân ly tạo thành các nhóm tích điện dương và các nhóm tích điện
âm khác nhau. Đối với mỗi protein sẽ có một giá trị pH xác định mà tại đó tổng số
điện tích âm bằng tổng số điện tích dương, khi đó phân tử protein trung hòa về
điện, pH đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Tại điểm đẳng điện, dung dịch
protein không bền, dễ bị kết tủa.
2/ Thực hành
1.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Dung dịch acid acetic (CH3COONa) 0,1N

: 200ml

- Dung dịch natri acetate (CH3COONa) 0,1N

: 50ml

- Dung dịch casein 0,4%: Cân 0,4g casein cho vào becher 100ml và thêm 20ml
dung dịch CH3COONa 0,1N. Đặt lên nồi cách thủy đun nóng để hòa tan hoàn toàn.
Chuyển sang bình định mức 100ml và định mức tới 100ml bằng dung dịch
CH3COONa 0,1N.
- Nước cất

: 50ml

1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Ống nghiệm

: 10 ống

- Pipette 1ml

: 02 pipette

- Bình định mức 100ml

: 01 bình

- Becher 100ml

: 03 cốc

- Nồi cách thủy

: 01 cái

GV: ThS. Lê Thanh Hải

10


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

1.3. Tiến hành
Lấy dung dịch CH3COOH 0,1N và nước vào 5 ống nghiệm theo thứ tự như bảng
sau:
Lắc đều, sau đó thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch casein và theo dõi sự biến đổi của
chúng trong mỗi ống nghiệm.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện của casein

1.4. Kết quả
Ở ống nghiệm có nhiều kết tủa nhất là điểm đẳng điện của Casein
Chụp hình và ghi lại kết quả xác định pH đẳng điện của Casein

GV: ThS. Lê Thanh Hải

11


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Hình 3.1 Thí nghiệm điểm đẳng điện của casein từ trái sang phải (1,2,3,4, và 5).

•
•
•

•
•


Mức độ kết tủa
Ống 1: Kết tủa nhất
Ống 2: Kết tủa hết
Ống 3: Kết tủa nhiều
Ống 4: Kết tủa nhiều nhất
Ống 5: Kết tủa trung bình
Kết luận: Vậy điểm đẳng điện của protein Casein là ở pH = 4,1.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

12


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC VÔ
CƠ
1/ Nguyên tắc
Chất xúc tác là chất làm cho phản ứng xảy ra nhanh hơn nhưng không bị tiêu hao
trong quá trình phản ứng. Enzyme là các chất xúc tác của các hệ thống sinh học.
Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác
tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, làm
tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước ở điều kiện
nhiệt độ và pH ôn hòa.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất

- Enzyme amylase

: 50ml

- Dung dịch HCl 1%

: 50ml

- Nước cất

: 10ml

- Dung dịch hồ tinh bột 10%
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Ống nghiệm

: 50ml

: 04 ống

- Pipette 1ml

: 02 pipette

- Nồi đun cách thủy

: 01 cái

- Tủ ấm
- Becher 50ml

GV: ThS. Lê Thanh Hải

: 01 cái
: 03 cốc

13


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

2.3. Tiến hành
Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 10%. Sau đó thêm
vào:
- Ống thứ nhất

: 10ml nước cất

- Ống thứ hai

: 10ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ ba

: 10ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư

: 10ml dung dịch HCl 1%

Sau đó đặt các ống nghiệp thứ nhất và thứ hai ở nhiệt độ phòng, ống thứ ba vào tủ
ấm 600C. Đặt ống thứ tư vào nồi cách thủy đang sôi. Sau 10 phút lấy các ống
nghiệm ra, cho vào mỗi ống 5ml thuốc thử Lugol. Đặt cả 4 ống vào nồi cách thủy
trong 2 phút. Lấy ra làm nguội vàquan sát hiện tượng trong các ống nghiệm.
2.4. Kết quả
Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:
Bảng 4.1 Bảng
nghiệm so sánh
của enzyme với

GV: ThS. Lê Thanh Hải

kết quả thí
tác dụng xúc tác
xúc tác vô cơ

14


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Hình 4.1: Ống 1,2,3,4 (từ trái sang phải) sau quá trình làm nguội 30 phút
Nhận xét phản ứng Lugol:
Ống 1: Cho ra phức xanh có màu đậm nhất.
Ống 2: Cho ra phức có màu xám nhạt có sự phân cách rõ ràng (lớp dưới màu trắng
đục).
Ống 3: Cho ra phức có màu xám.
Ống 4: Cho ra phức xám trong có sự phân cách (lớp dưới màu trắng trong).
 Giải thích

Ở ống 1: Màu xanh lam xuất hiện khi thuốc thử lugol tiếp xúc tinh bột, bởi vì thành
phần chính của thuốc thử lugol là iôt và kali-iôt (KI). Do cấu tạo dạng mạch xoắn
có lỗ rỗng tinh bột hấp thu iod cho màu xanh đặc trưng ở điều kiện thường, khi có
tác dụng nhiệt độ thì mất màu do iod tách ra khỏi tinh bột ở trạng thái tự do dẫn đến
I2 thăng hoa làm mất màu xanh, làm lạnh có màu xanh trở lại là do còn một số iod
bàm trên thành ống nghiệm hấp thu trên phân tử tinh bột làm màu xanh xuất hiện
trở lại.
Ở ống 2,3:
Thủy phân
Tinh bột
Amylase

Tinh bột + Lugol (iod, KI) cho màu xanh
(Glucose, Maltose, Maltodextrin, Acrodextrin) + Lugol
Amylodextrin + Lugol cho màu tím
Erythrodextrin + Lugol cho màu tím đỏ
Ở ống 4: Ở 100oC Tinh bột sẽ bị thủy phân bởi HCl. Sau đó lượng tinh bột còn dư
tiếp tục phản ứng với Lugol cho ra phức có màu xanh.
 Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được thực hiện trong điều
kiện ôn hòa, không đòi hỏi nhiệt độ cao (Enzyme xúc tác vô cơ Amylase) nhưng
tốc độ phản ứng vẫn mạnh hơn so với Enzyme xúc tác hữu cơ (HCl) phải cần ở
nhiệt độ thích hợp thì phản ứng mới xảy ra.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

15


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME
1/ Nguyên tắc
Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất
định. Enzyme có tính đặc hiệu rất cao. Tính chất đặc hiệu của enzyme cho thấy sự
khác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác. Mỗi loại enzyme chỉ có
khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiều chất nhất định theo một kiểu
phản ứng nhất định. Tính chất đặc hiệu của enzyme biểu hiện ở một số kiểu đặc
hiệu sau:
Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển
hóa nhất định trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng
chuyển bị, phản ứng thủy phân…
Đặc hiệu kiểu cơ chất: có 3 kiểu đặc hiệu cơ chất
- Đặc hiệu tuyệt đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một cơ chất nhất định
- Đặc hiệu tương đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một kiểu liên kết hóa học
nhất định
- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một dạng
đồng phân quang học của cơ chất (cis hoặc trans)
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Enzyme amylase

: 5ml

- Nước cất

: 5ml

- Dung dịch hồ tinh bột 5%

: 10ml

GV: ThS. Lê Thanh Hải

16


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

- Casin 2%

: 20ml

2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Ống nghiệm

: 04 ống

- Pipette 1ml

: 02 pipette

- Nồi đun cách thủy

: 01 cái

- Tủ ấm

: 01 cái

- Becher 50ml

: 03 cốc

2.3. Tiến hành
Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, sau đó thêm vào:
- Ống thứ nhất: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme amylase
- Ống thứ hai: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme bromelin
- Ống thứ ba: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme amylase
- Ống thứ tư: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme bromelin
Lắc đều và để vào tủ ấm ở 600C trong 15 phút. Lấy ra, cho vào ống nghiệm thứ nhất
và thứ hai mỗi ống 02 giọt thuốc thử Lugol.Cho ống thứ ba và thứ tư mỗi ống 02
giọt thuốc thử Folin.
2.4. Kết quả
Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

Bảng 5.1 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của enzyme

GV: ThS. Lê Thanh Hải

17


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Nhận xét về tính đặc hiệu của Enzyme.

Hình 5.1: Ống 1,2,3 và 4 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm.
 Giải thích:

Ống 1: : Màu xanh lam xuất hiện khi thuốc thử lugol tiếp xúc tinh bột, bởi vì thành

phần chính của thuốc thử lugol là iôt và kali-iôt (KI). Do cấu tạo dạng mạch xoắn
có lỗ rỗng tinh bột hấp thu iod cho màu xanh đặc trưng ở điều kiện thường.
Enzyme amylase

Glucose

Tinh bột
GV: ThS. Lê Thanh Hải

Maltose
18


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Thủy phân

Maltotetrose
Dextrin phân tử thấp

Enzyme amylase thủy phân liên kết α-1,4-glycoside của tinh bột thành các dextrin
lớn đến nhỏ, cuối cùng là glucose.
•

Ống 2: Enzyme bromelin không tác dụng với tinh bột. Sở dĩ thí nghiệm có màu

xanh là do (tinh bột + Lugol (iod, KI)) cho màu xanh đặc trưng.
• Ống 3: Enzyme amylase không thủy phân Casein.
• Ống 4: Enzyme bromelin thủy phân cơ chất casein. Quá trình thủy phân sơ bộ sẽ
cho ra Polypeptide và acid amin.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

19


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM
1/ Nguyên tắc
Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa
enzyme. Các chất hoạt hóa có thể là những anion, các ion kim loại (từ ô thứ 11 đến
ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn), các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các
chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc những chất có khả
năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng
phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme.
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong phản ứng
enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme những không bị enzyme làm thay đổi tính chất
hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm hãm hoạt
động của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả
protein.
- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ
chất. Chúng thường là chất kiềm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với
trung tâm hoạt động của enzyme và chiếm lấy vị trí của cơ chất trong trung tâm
hoạt động.
- Chất kìm hãm không cạnh tranh: những chất này không chiếm trung tâm hoạt
động của enzyme mà liên kết với vị trí ngoài trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu
trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc
tác.
2/ Thực hành

2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Enzyme amylase
GV: ThS. Lê Thanh Hải

: 50ml
20


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

- Dung dịch NaBr 0,5%

: 50ml

- Dung dịch CuSO4 0,5%

: 50ml

- Nước cất

: 50ml

- Dung dịch hồ tinh bột 1%

: 50ml

- Thuốc thử Lugol

: 50ml

- Thuốc thử Fehling

: 50ml

2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Ống nghiệm

: 03 ống

- Pipette 5ml

: 01 pipette

- Pipette 1ml

: 01 pipette

- Bể điều nhiệt

: 01 thiết bị

- Becher 50ml

: 03 cốc

2.3. Tiến hành
Cho vào 03 ống nghiệm mỗi ống 5ml dung dịch hồ tinh bột 1%, sau đó cho vào:
- Ống thứ nhất: 10ml nước cất
- Ống thứ hai: 10ml dung dịch NaBr 0,5%
- Ống thứ ba: 10ml dung dịch CuSO4 0,5%

Sau đó cho vào cả ba ống mỗi ống 10ml dung dịch enzyme amylase. Lắc đều và để
vào tủ ấm ở 370C trong 15 phút. Lấy ra, cho vào mỗi ống 2 giọt thuốc thử Lugol,
lắc đều.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

21


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Tiếp tục cho vào mỗi ống 2ml dung dịch Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi
trong 2 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng.
2.4. Kết quả
Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:
Bảng 6.1 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tác dụng của chất hoạt hóa và kiềm hãm hoạt tính
của enzym amylase

Nhận xét về tác dụng của chất hoạt hóa và chất kiềm hãm đến hoạt tính của enzyme
amylase.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

22


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Hình 6.1: Ống 1,2 và 3 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm.

•

 Nhận xét:

Ống 1: Xuất hiện màu xanh nhạt nhất => tốc độ hoạt hóa của chất hoạt hóa yếu vì
nước cất không phải là chất kìm hãm hay kích thích cho quá trình thủy phân tinh

bột.
• Ống 2: Xuất hiện màu xanh trung bình =>dung dịch NaBr có tác dụng kích thích
cho phản ứng thủy phân ở mức độ trung bình.
• Ống 3: Xuất hiện màu xanh đậm nhất =>dung dịch CuSO 4 có tác dụng kìm hãm
làm phản ứng thủy phân chậm lại.

GV: ThS. Lê Thanh Hải

23


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE
1/ Nguyên tắc
Lipase là enzym thuộc nhóm thủy phân, phân nhóm esterase – xúc tác phản ứng
thủy giải các nối ester giữa glycerine và các acid béo trong glyceride.
Nhờ hoạt động của lipase, các acid béo được giải phóng làm tăng độ chua của môi
trường phản ứng. Lượng acid đó sẽ được chuẩn độ bằng kiềm và chỉ số hoạt độ của
enzym sẽ là lượng kiềm cần để trung hòa các acid béo mới được hình thành.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Tuỵ tạng động vật

: 4g

- Sữa tươi

: 100ml

- KOH 0,1N

: 100ml

- Cồn 96%

: 50ml

- Phenolphtalein 1%

: 15ml

- Hỗn hợp nước h glycerin

: 40ml (tỷ lệ 3 nước : 1glycerin)

- H2SO4 0,1N chuẩn

: 100ml

- Vải màn

:1

- Giấy lọc

:4

- Phễu lọc
2.2. Dụng cụ
- Erlen 100ml
GV: ThS. Lê Thanh Hải

:7
24


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

- Bể điều nhiệt

:1

- Buret 25ml

:1

- Bercher 100ml

:4

- Pipet 5ml

:2

- Pipet 10ml

:2

- Cối sứ

:1

- Bếp điện

:1

2.3. Tiến hành
Chuẩn bị chế phẩm lipase từ tuỵ tạng động vật: Cân 1g tụy tạng động vật, cho vào
cối nghiền 5ml hỗn hợp nước – glycerin (tỷ lệ 3:1), nghiền kỹ từ 3 – 5 phút. Sau đó,
lại cho thêm 5ml hỗn hợp nước – glycerin và nghiền tiếp 1 h2 phút. Lọc vắt hỗn
hợp qua vải màn, sau đó lọc lại qua giấy lọc, thu dịch lipase để làm thí nghiệm
Xác định hoạt tính của enzyme lipase:
Lấy 02 erlen 100ml, cho vào mỗi bình 10ml sữa tươi
- Erlen 1 (erlen thí nghiệm): cho vào 2 ml lipase, lắc đều, đặt vào bể điều nhiệt ở
370C – 400C trong 1 giờ
- Erlen 2 (erlen đối chứng): đun sôi sữa trong bình, sau đó cho ngay 2ml lipase vào
và đun sôi tiếp 5 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đặt vào bể điều nhiệt ở
370C – 400C trong 1 giờ. Sau 1 giờ lấy erlen ra, thêm vào mỗi bình 8ml cồn 96%,
vài giọt phenolphtalein, chuẩn độ cả hai erlen bằng KOH 0,1N.
Tiến hành thí nghiệm 2 lần. Lấy kết quả là giá trị trung bình của 2 lần thí nghiệm

GV: ThS. Lê Thanh Hải

25