ứng dụng gen pmi như là gen chọn lọc trong chuyển gen ở lúa taipei 309

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC -VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ðẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SỬ DỤNG GEN PMI NHƯ LÀ GEN CHỌN
LỌC TRONG CHUYỂN GEN Ở LÚA
TAIPEI 309

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

Ths. Trần Thị Xuân Mai
Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học
Trường ðại Học Cần Thơ

SINH VIÊN THỰC HIỆN
Nguyễn Công Khang
Lớp Công Nghệ Sinh Học
Khóa 31

Cần Thơ, Năm 2009


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ và biết ơn sâu sắc ñến cô Trần Thị Xuân Mai
ñã tận tình hướng dẫn, truyền thụ những tri thức khoa học bổ ích, tạo ñiều kiện
thuận lợi nhất giúp tôi làm tốt luận văn tốt nghiệp này.
Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên và cô Nguyễn Thị Pha phòng thí
nghiệm Sinh Học Phân Tử Thực Vật- Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công
Nghệ Sinh Học ñã nhiệt tình giúp ñở tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài.
Xin cảm ơn tất cả các Thầy, Cô ñã tận tình dạy và cung cấp những kiến
thức quý báu cho em trong 4 năm học ở trường.
Xin cảm ơn thầy cố vấn học tập Trần Thanh Mến và các bạn trong lớp
Công Nghệ Sinh Học K31 ñã ñộng viên và giúp ñỡ em trong suốt quá trình học
tập và thực hiện ñề tài.

Nguyễn Công Khang


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

MỤC LỤC

Nội Dung

Trang

PHẦN I: ðẶT VẤN ðỀ............................................................................................1
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .......................................................................4
I. Lịch sử và tình hình chuyển gen hiện nay .......................................................4
1. Trên thế giới.........................................................................................4
2. Trong nước...........................................................................................7

II. Lược khảo về phương pháp chuyển gen ..........................................................9
1. Khái niệm chuyển gen..........................................................................9
2. Mục ñích của chuyển gen.....................................................................10
3. Ưu ñiểm và những vấn ñề tồn tại.........................................................11
4. Các phương pháp chuyển gen ..............................................................13
a) Chuyển gen trực tiếp.................................................................13
* DEAE-dextran...................................................................13
* Kỹ thuật calcium phosphate..............................................14
* Chuyển gen qua liposome………………....………….. ..15
* Phương pháp vi tiêm .........................................................17
* Chuyển gen trực tiếp vào protoplast .................................18
* Chuyển gen bằng kỹ thuật xung ñiện…………................18
* Chuyển gen bằng sung bắng gen………….. ....................19
b) Chuyển gen gián tiếp bằng Agrobacterium .............................21


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

* Ti-plasmid của A. tumefaciens .........................................24
* Sự gây ra khối u do A. tumefaciens..................................24
* Cơ chế chuyển T-DNA ....................................................35
III. Phương pháp nuôi cấy mô ............................................................................27
IV. Phương pháp chọn lọc mô sau khi chuyển gen bằng gen pmi .....................29
1. Giới thiệu về PMI...............................................................................29
2.Ứng dụng của phương pháp chọn lọc bằng mannose .........................30
a) Trên lúa ..................................................................................30
b) Lúa Miến................................................................................31
c) Cam ........................................................................................32

d) Táo .........................................................................................32
3. Sự chuyển hóa mannose trong cơ thể ................................................33
V. Giống lúa Taipei 309.....................................................................................37
VI. Thử Nghiệm Chlorophenol-red (CPR) ........................................................37
PHẦN III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................38
I.Phương Tiện....................................................................................................38
1. Giống lúa ...........................................................................................38
2. Dòng Vi Khuấn ..................................................................................38
3. Plasmid...............................................................................................38
4. Môi trường .........................................................................................38
5. Thiết bị và dụng cụ.............................................................................40
II. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................41
1.Quy trình chuyển gen..........................................................................41


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

a) Phương pháp xử lý mô sẹo.......................................................42
b) Các bước chuyển gen...............................................................42
c) Chọn lọc mô ñã chuyển gen.....................................................43
d) Tạo chồi ...................................................................................43
2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................44
a) Chuyển gen pmi bằng A. tumefaciens......................................44
b) Ảnh hưởng của Mannose lên quá trình tạo chồi......................44
d) Thử nghiệm Chlorophenol ñỏ (CPR) ......................................45
PHẦN IV. KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN................................................................46
I. Phương pháp chọn lọc bằng Mannose ..........................................................46
II. Ảnh hưởng của Mannose lên quá trình tạo chồi..........................................49

1. Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tiền tạo chồi .................49
2. Ảnh hưởng của Mannose trong môi trường tạo chồi ........................51
IV. Phân Tích Chlorophenol-red (CPR) ..........................................................54
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................56
I. Kết Luận .......................................................................................................56
1. Hiệu quả chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens...................56
2. Ảnh hưởng của ñường mannose lên quá trình tạo chồi ....................56
3. Phân tích Chlorophenol-Red (CPR)..................................................56
II. Kiến nghị .....................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................59


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

PHỤ LỤC

1. Thành phần các môi trường sử dụng trong quá trình tạo mô sẹo và môi
trường chọn lọc.
2. Thành phần các môi trường sử dụng trong quá trình tái sinh cây.
3. Thành phần môi trường trong phương pháp thử nghiệm Chlorophenol
ñỏ (CPR).


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

DANH SÁCH HÌNH

Hình:

Trang

2.1. Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA…………………………….13
2.2. Phức hợp DNA-calcium phosphate………………………………….14
2.3. Sơ ñồ hoạt ñộng của vector liposome………………………………..16
2.4. Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh………………17
2.5. Sơ ñồ plasmid chứa DNA ngoại lai…………………………………..19
ñi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất
2.6. Sơ ñồ nguyên lý hoạt ñộng của súng bắn gen………………………..20
2.7. Tạo thực vật chuyển gen bằng………………………………………..23
phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium.
2.8. Sơ ñồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens………….24
2.9. Khối u ở cây do A.tumefaciens gây ra………………………………..25
2.10. Sự tương tác giữa Agrobacterium…………………………………..27
với tế bào thực vật và cơ chế chuyển T-DNA.
2.11. Cấu tạo hóa học ñường Mannose và Mannose-6-phosphate……….34
2.12. Chu trình chuyển hóa ñường mannose……………………………...36
3.1. Bảng ñồ plasmid pCAMBIA 1380…………………………………...39
3.2. Quy trình chuyển gen trên lúa bằng………………………………….41
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
4.1. Mô chuyển gen thành công và không thành công……………………46
trên môi trường chọn lọc 3 (RO5)
4.2. Mô không chuyển gen bị ức chế trên môi trường RO5………………48
4.3. Mô chuyển gen tăng sinh ñược trên môi trường RO5………………..48
4.4. Sự phát triển của mô chuyển gen…………………………………….50
trên môi trường tiền tạo chồi.

Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

4.5. Mô sẹo hình thành chồi sau trên môi trường RO7…………………...52
4.6. Mô sẹo hình thành chồi trên môi trường RO7-mannose…………......52
4.7. Kết quả thử nghiệm Chlorophenol-red (CPR)……………………….54

DANH SÁCH BẢNG
Bảng:

Trang

1. Hiệu quả chuyển gen trên giống lúa Taipei 309……………………..47
khi sử dụng protocol mới.
2. Khả năng tạo chồi trên hai môi trường RO6…………………………49
và RO6-mannose sau 1 tuần.
3. Khả năng tạo chồi trên hai môi trường RO8…………………………51
và RO8-mannose sau 1 tuần.


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

CHÚ THÍCH NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
A. rhizogenes

: Agrobacterium rhizogenes

A. tumefaciens

: Agrobacterium tumefaciens

AS

: Acetosyringone

ABA

: abscisic acid

Bar

: gen kháng thuốc diệt cỏ

Bt

: Bacillus thuringiensis

CPR

: Chlorophenol Red

Cry

: Gen kiểm soát sâu ñục thân, sâu cuốn lá

DEAE-dextran

: Diethylaminoethyl-dextran

DOPE

: L-dioleoyl phosphatidylethanolamine

EU

: European Union

GM

: Genetically modified

GMA

: Genetically modified animal

GMO

: Genetically modified organism

GMP

: Genetically modified plant

LB

: Left border

NAA

: α-napthalen acetic acid

PEG

: polyethylene glycol

PGE

: polyethylene glycol

PGI

: phosphogluco isomerase

PMI

: phosphomannose isomerase

RB

: Right border

Sgfp

: Gen phát huỳnh quang

T-DNA

: ðoạn DNA trên Ti-plasmid


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

Ti

: Tumor inducing

2,4-D

: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

TÓM LƯỢC

Một phương pháp mới ứng dụng gen chọn lọc phosphomannoseisomerase (pmi) như một gen chọn lọc thay cho việc sử dụng gen kháng kháng
sinh trong chọn lọc các cây lúa chuyển gen ñã ñược sử dụng trong chuyển gen ở
cây lúa Japonica dòng Taipei 309. Hiệu quả chuyển gen pmi vào mô lúa 5 ngày
tuổi là 0,75%. Mặc dù hiệu quả này vẫn còn thấp nhưng việc sử dụng mô 5 ngày
tuổi như nguồn vật liệu chuyển gen làm rút ngắn thời gian sản xuất cây lúa
chuyển gen lên rất nhiều so với việc sử dụng mô lúa 3 tuần tuổi như nhiều
nghiên cứu trước ñây vẫn thường sử dụng. Sự hòa nhập và biểu hiện của gen pmi
vào trong bộ gen của cây lúa ñã chuyển gen ñược nhận diện qua phương pháp
phân tích sinh hóa Chlorophenol-red. Hệ thống chọn lọc bằng mannose ñã mở ra
những hướng ñi mới trong việc phát triển cây chuyển gen sạch ñáp ứng ñược
yêu cầu cho người tiêu dùng ñồng thời góp phần giữ gìn môi trường phát triển
bền vững.

Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

PHẦN I: ðẶT VẤN ðỀ
*****+☺
☺+*****

Quá trình tạo ra cây chuyển gen ñòi hỏi cần phải có các gen marker chọn
lọc nhằm cho phép nhận diện sự tái sinh của các tế bào chuyển gen và tránh sự
biểu hiện của các mô không ñược chuyển gen nhưng vẫn có thể phát triển ñược
trong quá trình chọn lọc. Quá trình chọn lọc các mô chuyển gen trước ñây thường
ñược thực hiện bằng việc ñưa vào các gen kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc
diệt cỏ, cho phép các mô chuyển gen có thể sống ñược trên môi trường chứa hợp
chất gây ñộc (Potrykus và Spangenberg, 1995).
Các thế hệ lúa chuyển gen thường ñược tạo ra bằng phương pháp súng bắn
gen và gần ñây nhất là phương pháp chuyển gen liên quan ñến vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (Hiei và ctv, 1994). Ở cả hai trường hợp, sau khi gen
ñã ñược chuyển, mô sẹo của lúa ñã ñược chuyển gen sẽ ñược chọn lọc bằng một
loại kháng sinh là hygromycin, và sự kháng lại kháng sinh này sẽ ñược ñiều hòa
bởi gen hygromycin phosphotransferase (Ayres và Park, 1994). Mô ñã ñược
chuyển gen sẽ sống ñược và sau ñó có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy có
hygromycin, trong khi mô không ñược chuyển gen sẽ bị chết bởi ñộc chất trong
môi trường. Phương pháp chọn lọc này cho phép ta có thể phân biệt một cách rõ
ràng giữa mô ñược chuyển gen và mô không ñược chuyển gen (Ayres và Park,
1994). Còn ở sự chọn lọc dựa vào thuốc diệt cỏ, người ta thường sử dụng gen
bar, ñây là gen mã hóa cho enzyme phosphinotricin acetyltransferase, và gen này
ñược sử dụng một cách rộng rãi ở chuyển gen lúa (Ayres và Park, 1994). Hoạt
ñộng của gen bar có tác dụng kháng lại L-phosphinotricin, glyphosinate,

biolaphos và ñã thành công trong chọn lọc các mô thực vật ñã ñược chuyển gen
(Hiei và ctv, 1997).
Mặc dù chuyển gen trên lúa thông qua việc chọn lọc bằng gen kháng
kháng sinh và gen kháng thuốc diệt cỏ ñã ñạt nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn gây
nhiều tranh cãi, nhiều ý kiến cho rằng các gen marker có thể chuyển sang các vi
sinh vật và từ ñó gia tăng số lượng của các nguồn gây bệnh có khả năng kháng
1


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

thuốc hoặc gia tăng khả năng chuyển gen marker sang những dòng hoang dại và
có thể từ ñó sẽ truyền sang các loại dịch hại trên loài hoang dại ñó (Dale, 1992;
Nap và ctv, 1992). Vì thế, việc tạo ra cây trồng chuyển gen, tránh sử dụng ñộc
chất và gen tương ứng , ñược xem như một phương pháp ñược nhiều mong ñợi
(WHO, 1993; Daniell, 1999; Malik và Saroha, 1992). Một số kỹ thuật mới ñược
phát triển nhằm loại bỏ các gen marker ñể giải quyết vấn ñề nói trên (Yoder và
Golds-brough, 1994). Một loại vecter nhị hợp mới có chứa hai ñoạn T-DNA khác
nhau ñược sử dụng ñể chuyển gen trên lúa và ñiểm khác biệt của việc chuyển gen
trên các thế hệ cây chuyển gen sau cho phép sự phát sinh của các cây chuyển gen
mà không cần marker (Komari và ctv, 1996).
Một hệ thống chọn lọc mới ñược phát triển cho phép quá trình chọn lọc
các mô ñã ñược chuyển gen bằng sự trợ giúp của ñường, ñó là loại ñường nào mà
không thể ñược chuyển hóa và sử dụng bởi những tế bào thực vật không ñược
chuyển gen. Gen phosphomannose isomerase (PMI) có nguồn gốc từ Escherichia
coli (Miles và Guest, 1984) ñược sử dụng như một gen chọn lọc và ñường
mannose là một nhân tố chọn lọc vì tế bào thực vật không thể chuyển hóa ñược
ñường Mannose. Nhân tố chọn lọc mới này gần ñây ñã ñược báo cáo cho việc

chọn lọc thành công trên cây mía ñường (Joersbo và ctv, 1998) và trên bắp
(Negrotto và ctv, 2000) sau khi chuyển gen gián tiếp bằng Agrobacterium. Quá
trình chọn lọc dựa trên sự quan sát rằng mannose ñược chuyển hóa thành
mannose-6-phosphat bằng hexokinase nội bào, và sau ñó ñược tích lũy trong tế
bào ñi kèm với sự thất thoát lượng phosphate và ATP trong tế bào, kết quả là dẫn
ñến ức chế sự phát triển (Ferguson và ctv, 1958; Malca và ctv, 1967). Tế bào
chuyển gen có chứa gen PMI sẽ có khả năng chuyển hóa mannose-6-phosphat
thành hợp chất dễ chuyển hóa là fructose-6-phosphat, chất có thể ñược sử dụng
làm nguồn cacbon, tăng nguồn năng lượng nội bào của các mô chuyển gen và
tránh sự tích lũy dẫn xuất của nhân tố chọn lọc (Joersbo và ctv, 1999; Hoa và
Bong, 2002).
ðây là phương pháp nhằm tạo ra cây lúa chuyển gen sạch mà không cần
sử dụng các loại kháng sinh hay thuốc diệt cỏ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

2


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

áp dụng phương pháp chuyển gen pmi vào lúa japonica dòng Taipei 309 bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Mục ñích của việc nghiên cứu
− Ứng dụng gen PMI như là gen chọn lọc trong chuyển gen ở lúa. Từ ñó
phát triển rộng rãi phương pháp tạo ra các thực vật chuyển gen “sạch”
không chứa gen kháng kháng sinh nhằm ñáp ứng ñúng mối quan tâm của
xã hội.
− Sử dụng một qui trình mới trong chuyển gen ở giống lúa Japonica nhằm
rút ngắn thời gian chuyển gen.

− Khảo sát ảnh hưởng của ñường mannose lên quá trình tái sinh chồi của mô
lúa chuyển gen.

3


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

*****+☺
☺+*****

I.

Lịch sử và tình hình của công nghệ chuyển gen trên thế giới và trong

nước
1. Trên thế giới
Lịch sử phát triển công nghệ gen của thực vật có rất nhiều sự kiện quan
trọng. Ở ñây chỉ nêu lên những mốc có ý nghĩa ñặc biệt nhằm làm rõ sự phát
triển rất nhanh của lĩnh vực này:
Trước hết, vi khuẩn ñất Agrobacterium tumefaciens ñược sử dụng làm
phương tiện vận chuyển DNA. Bình thường vi khuẩn này tạo nên khối u ở thực
vật. Một phần nhỏ của Ti-plasmid có trong vi khuẩn này, ñược gọi là T-DNA,
ñược vận chuyển từ Agrobacterium vào cây hai lá mầm. Năm 1980, lần ñầu tiên
DNA ngoại lai (transposon Tn7) ñược chuyển vào thực vật nhờ A. tumefaciens,
tuy nhiên T-DNA vẫn chưa ñược thay ñổi. Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu ña

biến ñổi T-DNA và ñưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng
sinh. Ngoài ra, các gen tạo khối u ñược cắt ra. DNA ngoại lai cùng với phần còn
lại ñược chuyển vào thực vật và ñược biến nạp. Thành công này nhờ nghiên cứu
chính xác con ñường lây nhiễm của A. tumefaciens trước ñó và khả năng của hệ
thống chọn lọc ñối với thực vật.
Từ kết quả thành công ñầu tiên này số lượng các loài ñược biến nạp ngày
càng tăng. Lúc này có thêm nhiều phương pháp khác ñể biến ñổi gen:
- Năm 1984, biến nạp bằng tế bào trần (protoplast) ở ngô ñược thực hiện.
Ở ñây thành tế bào ñược phân giải bằng enzyme, xuất hiện tế bào trần. Nhờ
polyethylene glycol (PEG) hoặc xung ñiện (electroporation) mà DNA ñược ñưa
vào tế bào trần.
4


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

- Năm 1985, lần ñầu tiên cây biến ñổi gen ñược mô tả có tính kháng thuốc
diệt cỏ. Một năm sau, người ta ña thành công trong việc tạo ra thực vật kháng
virus. Năm 1996, các thí nghiệm về cây biến ñổi gen ña ñược phép ñưa ra ñồng
ruộng.
- Năm 1987, phương pháp biến nạp phi sinh học ñược sử dụng. Ở ñây tế
bào thực vật ñược bắn phá bằng các hạt vàng hoặc wolfram bọc DNA ngoại lai.
Nhờ phương pháp này mà sự biến nạp ña thành công ña ở các cây một lá mầm
quan trọng như lúa (1988), ngô (1990) và lúa mỳ (1992). Cũng trong năm 1987,
cà chua và thuốc lá kháng côn trùng ña làm cho công nghệ gen ñạt ñược một
bước phát triển quan trọng hơn. Một thành công quan trọng khác là ña ñiều khiển
ñược quá trình chín ở cà chua, sau này có tên là FlavrSaver. Năm 1994, lần ñầu
tiên cà chua biến ñổi gen ñược bán trên thị trường.

- Năm 1989, không những ña thành công trong việc chuyển các gen mã
hóa các kháng thể vào thực vật, mà người ta còn tạo nên các sản phẩm gen này
như mong muốn. Kết quả này ña mở ra một khả năng hoàn toàn mới mẽ cho việc
sản xuất vaccine và cả khả năng chống bệnh ở thực vật.
- Năm 1990, thành công trong việc tạo ra cây biến ñổi gen bất dục ñực,
không có khả năng tạo hạt phấn. Loại cây trồng này có ý nghĩa lớn trong việc sản
xuất hạt giống.
- Từ năm 1991, thành phần carbohydrate của thực vật ñược biến ñổi và
năm 1992 là các acid béo. Cùng năm ñó, lần ñầu tiên thành phần alkaloid ở một
loại cà ñược cải thiện, là một bước quan trọng ñối với thực vật trong việc tổng
hợp nhóm hợp chất này. Những thực vật này có ý nghĩa lớn ñối với việc thu nhận
dược liệu. Sau khi thực vật biến ñổi gen này xuất hiện, chất nhân tạo phân giải
sinh học ñược tổng hợp. ðiều này cho phép chúng ta hy vọng rằng, trong tương
lai sẽ có những thực vật có ñặc tính mới, ñược sử dụng như là các bioreactor thực
vật ñể sản xuất “nguyên liệu tái sinh”.
ðến ñầu năm 1999, trên thế giới ña có khoảng 9.000 thí nghiệm ñồng
ruộng cho phép, trong ñó khoảng 1.360 là ở EU. Cho ñến hết năm 1999, diện
tích gieo trồng trên thế giới ñạt hơn 40 triệu ha. Trong ñó 20% là ngô, 50% là
5


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

ñậu tương và 1/3 diện tích bông là ở Mỹ. Ngoài ra có hơn 70% diện tích cải dầu
ở Canada ñược trồng với giống biến ñổi gen. Khoảng 90% thực vật biến ñổi gen
chống chịu thuốc diệt cỏ hoặc sâu bệnh hại. Cần chú ý rằng, ở Mỹ sản phẩm ñậu
tương có trong hơn 20.000 loại thực phẩm khác nhau. ðiều này cho thấy rằng,
công nghệ gen ña ảnh hưởng ñến sản xuất thực phẩm của chúng ta.

Năm 2006, diện tích toàn cầu cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng cao vượt
ngưỡng 100 triệu ha , khi lần ñầu tiên hơn 10 triệu nông dân (10,3 triệu) tại 22
nước canh tác cây chuyển gen, cao hơn so với 90 triệu ha và 8,5 triệu nông dân
tại 21 nước năm 2005.
Năm 2006, 22 nước trồng cây chuyển gen, có 11 nước ñang phát triển và
15 nước công nghiệp, trong ñó nếu tính theo thứ tự về diện tích, thì Hoa kỳ dẫn
ñầu, tiếp ñến Achentina, Brazil, Canada, Ấn ñộ, Trung Quốc, Paraguay, Nam phi,
Uruguay, Philippin, Úc, Rumani, Mê hi cô, Tây Ban nha, Côlômbia, Pháp, Iran,
Honduras, Cộng hòa Czech, Bồ ñào nha, ðức và Sloavakia. Các giống ñậu nành,
bắp, cải dầu và cỏ alfalfa kháng thuốc trừ cỏ tiếp tục chiếm ưu thế với 68% hay
69,9 triệu ha, tiếp theo là giống kháng sâu BT với 19,0 triệu ha (19%) và các
giống cây chuyển gen xếp chồng (chịu ñược cả thuốc trừ cỏ và kháng sâu) chiếm
13,1 triệu ha (13%). Các giống chuyển gen xếp chồng là nhóm giống tăng trưởng
nhanh nhất tới 30% giữa năm 2005 và 2006, so với 17% ñối với nhóm kháng sâu
và 10% ñối với nhóm kháng thuốc trừ cỏ.
Nhưng thành tựu phải nói là nổi bật nhất của công nghệ chuyển gen ñó
chính là việc tạo ra ñược “gạo vàng”, hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong
chương trình nghiên cứu của ñội ngũ khoa học gia Thụy Sĩ và ðức quốc, ñược cơ
quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ 100 triệu Mỹ kim trong 10 năm.
ðội ngũ này ñược hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo Potrykus, Viện Kỹ Thuật Liên
Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, ðại học Freiburg ở ðức. Các nhà khoa
học ñã ñưa tất cả 7 gien lạ vào giống lúa TP 309 qua hai qui trình khác nhau, với
phương pháp chuyển gien bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

6


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

2. Trong nước
Hiện nay ở nước ta lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến ñổi gen, nghiên
cứu chuyển gen vào cây trồng (GM) ñang ñược tiếp cận, ñầu tư và triển khai
nghiên cứu, ứng dụng với sự chú trọng ñặc biệt. Nhiều gen quý có giá trị ứng
dụng như năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu ñã ñược phân lập và nghiên
cứu nhằm chuyển vào cây trồng ñể tạo nên những giống lý tưởng. Nhiều phương
pháp chuyển gen khác nhau như phương pháp bắn gen, phương pháp sử dụng vi
khuẩn. A.tumefaciens... ñã ñược áp dụng thành công trên hàng loạt cây trồng
quan trọng như lúa, cà chua, cà tím, ñậu xanh, cà-phê, thuốc lá, khoai lang.
Những vấn ñề thiết kế vector cũng như hoàn thiện các quy trình tái sinh cây khởi
ñầu cho nghiên cứu chuyển gen cũng nhận ñược sự quan tâm của nhiều nhà khoa
học.
Các nhà khoa học ñã tiến hành thu nhập và phân lập ñược nhiều nguồn
gen quý có giá trị nông nghiệp như gen chịu hạn, lạnh ở lúa; gen cry, gen mã hóa
protein bất hoạt hóa ở cây mướp ñắng và gen mã hóa của cây ñậu cô ve có hoạt
tính diệt côn trùng; gen kháng bọ, hà khoai lang của vi khuẩn Bt; gen mã hóa
protein vỏ của virus gây bệnh ñốm vòng ở cây ñu ñủ... Hiện các nhà sinh học
Việt Nam ñang tiếp tục nghiên cứu ñể chuyển gen vào cây hoa, cây bông và cây
lâm nghiệp, nhằm nâng cao sức chống chịu với sâu bệnh và ñiều kiện ngoại cảnh
bất lợi.
Những nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa bằng
công nghệ GM, chuyển gen kháng virus ñốm vòng vào cây ñu ñủ, chuyển gen
chịu hạn vào cây bông... cũng ñang ñược triển khai hiệu quả với một số loài cây
GM.
Nhà nước ta ñã xác ñịnh công nghệ sinh học là một ngành khoa học quan
trọng. Từ năm 1990, Chương trình công nghệ sinh học quốc gia ñã ñược cấp kinh
phí cho các dự án nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học, ñặc biệt trong cải
tiến giống cây trồng.
Từ năm 2001, Chính phủ ñã ñầu tư nhiều dự án, ñề tài nghiên cứu GM

liên quan ñến nhiều cây trồng quan trọng của Việt Nam. Một số phòng thí
7


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

nghiệm công nghệ sinh học ñã và ñang ñược Nhà nước ñầu tư trang thiết bị hiện
ñại và triển khai các kỹ thuật cơ bản của công nghệ gen như phân lập và xác ñịnh
trình tự gen, thiết kế và biến nạp gen vào tế bào vi sinh vật, ñộng vật, nghiên cứu
biểu hiện gen... Nhờ các biện pháp và chính sách khuyến khích, ñầu tư hiệu quả
ñó, công nghệ sinh học ở nước ta vài năm gần ñây ñã có những bước phát triển
mạnh mẽ.
Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết ñịnh. Một số cây
trồng quan trọng ñã ñược biến nạp gen; một vài vấn ñề kỹ thuật vẫn ñang còn tồn
tại, nhưng chúng ñang dần dần ñược giải quyết. ðể có kết quả cần phải thay ñổi
dần dần sang một phạm vi khác, như là phát hiện và tạo dòng các gen mang các
tính trạng ña gen (multigenic traits). Một ñiều không thể quên là vấn ñề nhận
thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác ñộng xấu ñến môi trường do các sản phẩm
có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại.
Cây biến nạp gen ñầu tiên thu ñược vào năm 1983. Và gần ñây là các
thành tựu liên tiếp như: tạo ra cá ngựa phát sáng bằng cách chuyển gen phát sáng
của sứa (Phan Kim Ngọc và ctv, 2007), thành công trong việc tạo ra giống lúa
giàu chất dinh dưỡng từ ba giống lúa IR64, MTL250 (indica) và Taipei 309
(japonica) ñược chuyển nạp với các vectơ pCaCar và pFun3 mang gen psy và
crtI ñiều khiển lộ trình tổng hợp isoprenoid ñể tạo ra một số vi chất dinh dưỡng,
bằng phương pháp sử dụng Agrobacterium và hệ thống chọn lọc mannose (Trần
Thị Cúc Hòa và ctv, 2006).
ðiều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ

của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào ñã giúp ích rất nhiều cho các
nhà tạo giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu
ñược từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới
cho công nghiệp và người tiêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả
các nước công nghiệp lẫn các nước ñang phát triển.
Và một khích lệ cho công nghệ chuyển gen ở Việt Nam và vào ngày
29.9.2008, ðại sứ quán Mỹ tại Việt Nam ñã phối hợp với Trung tâm Công nghệ
sinh học (CNSH) TP.HCM tổ chức hội thảo "Công nghệ sinh học trên cây trồng
8


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

tại Việt Nam". Theo tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình - Phó giám ñốc Trung tâm CNSH
TP.HCM, Việt Nam hiện ñang thí nghiệm một số cây trồng áp dụng GM trong
phòng thí nghiệm. Chính phủ cũng ñã phê duyệt chương trình ứng dụng công
nghệ sinh học trong nông nghiệp, ñến năm 2020 sẽ có khoảng 30 - 50% diện tích
cây trồng áp dụng GM ( www.thanhnien.com.vn).

II.

Lược khảo về phương pháp chuyển gen
1. Khái niệm về chuyển gen
Chuyển gen (transgenesis) là ñưa một ñoạn DNA ngoại lai vào genome

của một cơ thể ña bào, sau ñó ñoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế
bào và ñược truyền lại cho thế hệ sau(Trần Quốc Dung và ctv, 2006). Vì vậy khái
niệm chuyển gen chỉ ñược sử dụng cho thực vật và ñộng vật. Nấm men, vi khuẩn

và tế bào nuôi cấy mang một ñoạn DNA ngoại lai ñược gọi là các tế bào tái tổ
hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell).
Về mặt lịch sử, thuật ngữ GMO (genetically modified organism)-sinh vật
biến ñổi gen, ñược sử dụng chủ yếu ñể chỉ các thực vật chuyển gen ñược gieo
trồng ñể cung cấp lương thực, thực phẩm cho con người và ñộng vật. Logic hơn
và chính xác hơn, GMO ñề cập tới tất cả các cơ thể sống biến ñổi di truyền, bao
gồm cả vi sinh vật. Thuật ngữ GMP (genetically modified plant)-thực vật biến
ñổi gen và GMA (genetically modified animal)- ñộng vật biến ñổi gen cũng ñược
sử dụng.
Trong thực tế, các ñoạn DNA ngoại lai ñược sử dụng ñể tạo sinh vật
chuyển gen hầu hết là các gen luôn có sẵn một trình tự phù hợp với một promoter
làm cho nó biểu hiện thành RNA, nói tổng quát là protein. Sản phẩm phiên mã
của gen có thể là một RNA không ñược dịch mã thành protein. Ðây là trường
hợp ñối với RNA ngược hướng (antisense RNA), rybozyme và các gen ñược
phiên mã bởi RNA polymerase I và III.
Không nhất thiết là DNA ngoại lai luôn luôn ñược hợp nhất vào genome
của sinh vật chuyển gen. DNA ngoại lai không thể tồn tại trong cơ thể mà không
9


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

hợp nhất vào trong genome của nó. Một ñoạn DNA tự do nhanh chóng bị loại trừ
trong chu trình tế bào vì vậy nó sẽ không có khả năng tái bản và truyền lại cho
các tế bào con. Tuy nhiên về lý thuyết thì có thể duy trì một ñoạn DNA ngoại lai
như một nhiễm sắc thể nhỏ (minichromosome) có khả năng tự tái bản và có mặt
trong các tế bào con. Một số genome virus có ñặc tính này, ví dụ như virus
herpes. Một vài ñoạn nhiễm sắc thể thường ñược tìm thấy ở các tế bào khối u, là

các nhiễm sắc thể tồn tại trong một thời gian ngắn, mang các yếu tố tái bản và
truyền cho các tế bào con.
2. Mục ñích của chuyển gen
Mục ñích của chuyển gen là thêm một thông tin di truyền ngoại lai vào
genome, cũng như ñể ức chế một gen nội sinh. Trong một số trường hợp, sự thay
thế một gen hoạt ñộng chức năng bằng một gen hoạt ñộng chức năng khác là cần
thiết. Gen ngoại lai có thể là một thể ñột biến của gen nội sinh hoặc một gen hoàn
toàn khác.
Sự thêm gen có thể ñược thực hiện ñể cung cấp sinh vật mang protein
mới. Sự thêm gen cũng có thể ñược sử dụng ñể nghiên cứu cơ chế hoạt ñộng của
một promoter trong toàn cơ thể. Sự kết hợp của gen reporter với promoter là
nguyên tắc chung của phương pháp này.
Sự thay thế gen ñược sử dụng chủ yếu ñể làm bất hoạt một gen ñã biết.
Trên thực tế, nó bao gồm sự thay thế gen nội sinh bằng một thể ñột biến bất hoạt.
Phương pháp này ñược dùng ñể cho thông tin về chức năng sinh học của gen như
ở trường hợp thêm gen. Thực vậy cả thêm gen và bất hoạt gen có thể gây ra các
biến ñổi ở sinh vật chuyển gen, mà các biến ñổi này có thể ñược quan sát hoặc
ñánh giá. Các thể ñột biến của gen thay thế có thể cung cấp thông tin bằng một
cách thức tinh vi hơn.
Sự thay thế một gen bằng một gen có chức năng khác nhau hoàn toàn là
khó hơn nhưng có thể thực hiện ñể ñưa một marker hoặc một gen chọn lọc vào
genome. Vị trí hợp nhất vào genome có thể ñược chọn lọc ñối với khả năng chứa
của nó ñể biểu hiện gen ngoại lai bằng một cách chắc chắn.

10


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

Thực vật biến ñổi gen có thể là lò phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất
hiệu quả các protein và các chất cần thiết dùng trong dược phẩm và thực phẩm.
Mở ra khả năng nghiên cứu chức năng của gen trong quá trình phát triển của thực
vật và các quá trình sinh học khác. Vì vậy, thực vật biến ñổi gen có ý nghĩa trong
nghiên cứu cơ bản.
Trong lai tạo giống hiện ñại, công nghệ gen giúp làm giảm sự mâu

thuẫn

giữa kinh tế và môi trường sinh thái. Bằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc
diệt cỏ có thể giảm ñược lượng thuốc bảo vệ thực vật.
Mục ñích của nông nghiệp hiện ñại không chỉ là tăng năng suất mà còn
hướng ñến những lĩnh vực quan trọng sau:
+ Duy trì và mở rộng ña dạng sinh học (biodiversity).
+ Tăng khả năng kháng (sức khỏe cây trồng và chống chịu các
ñiều kiện bất lợi).
+ Nâng cao chất lượng sản phẩm.
+ Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng.
+ Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học.
+ Tạo ra sản phẩm không gây hại môi trường.

3. Ưu ñiểm và những vấn ñề tồn tại của chuyển gen

Ưu ñiểm
-

Tăng sản lượng.

-

Giảm chi phí sản xuất.

-

Tăng lợi nhuận nông nghiệp.

-

Cải thiện môi trường.

Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” ña giúp giảm chi phí sản xuất. Ngày
nay, các nhà khoa học ñang hướng ñến việc tạo ra những cây chuyển gen “thế hệ

11


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những ñặc ñiểm thích hợp cho
công nghiệp chế biến.
Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng.
Chẳng hạn như:
-

Lúa gạo giàu vitamin A và sắt.

-

Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột.

-

Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây.

-

Những giống ngô có thể trồng ñược trong ñiều kiện nghèo dinh dưỡng.

- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ ñậu nành và cải dầu.
Vấn ñề tồn tại cần phải giải quyết hiện nay
-

Mối nguy hiểm trong việc vô tình ñưa những chất gây dị ứng hoặc làm
giảm dinh dưỡng vào thực phẩm.

-

Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng
hoang dại.

-

Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất ñộc tiết ra từ cây
chuyển gen.

-

Nguy cơ những chất ñộc này tác ñộng tới các sinh vật không phải là loại
sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái.
Nhìn chung, mặc dù còn những ñiểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gen

nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công
nghệ này có vai trò không thể phủ nhận ñược. Tuy vậy, vẫn còn một số vấn ñề
ñáng lo ngại. ðể giải quyết những vấn ñề này thì những kết luận thu ñược phải
dựa trên những thông tin tin cậy và có cơ sở khoa học.
Cuối cùng, vì tầm quan trọng của lương thực thực phẩm cho con người,
nên các chính sách liên quan tới cây chuyển gen sẽ phải dựa trên những cuộc
tranh luận cởi mở và trung thực có sự tham gia của mọi thành phần trong xã hội.

12


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

4. Các phương pháp chuyển gen
a) Phương pháp chuyển gen trực tiếp
DEAE-dextran
DEAE-dextran là một polycation. Ðây là tác nhân hóa học ñầu tiên ñược
sử dụng ñể chuyển DNA vào tế bào ñộng vật nuôi cấy.
Trong phương pháp này, DNA ngoại lai ñược cho vào một trường nuôi
cấy với sự có mặt của DEAE-dextran. DEAE-dextran sẽ kết hợp với DNA tích
ñiện âm. Sự dư thừa ñiện tích dương trong phức hợp DNA-polycation do sự ñóng
góp của polycation, cho phép phức hợp này ñi ñến kết hợp chặt chẽ hơn với
màng tế bào tích ñiện âm. Sự xâm nhập của phức hợp có thể ñạt ñược nhờ sự
nhập bào (endocytosis).

Hình 2.1. Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA.

Phương pháp này ñược sử dụng thành công trong việc chuyển DNA vào
các tế bào biểu hiện nhất thời, có nghĩa là thời gian biểu hiện ngắn chỉ vài ngày
trong quá trình nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này nói chung là không hữu
13


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

ích ñối với các nghiên cứu cần sự chuyển nhiễm ổn ñịnh dựa vào sự hợp nhất của
DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể, hiệu quả biến nạp thấp, chỉ ñược sử dụng cho
một số loại tế bào và cho kết quả tốt ñối với tế bào ex vivo.
Các polycation khác cũng ña ñược sử dụng ñể chuyển DNA vào tế bào
như polybrene, polyethyleneimine và dendrimers.
Kỹ thuật calcium phosphate
Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) ñã ñược phát
triển ñầu tiên là ñể xác ñịnh sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện
nay ñược sử dụng rông rãi ñể thử nghiệm hoạt ñộng biến nạp của DNA virus
cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979;
Pellicer, 1980).
Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất ñồng kết tủa DNA và
calcium phosphat (Hình 2). Kết tủa này bám vào tế bào và sau ñó sẽ hấp thụ vào
tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter, 1982). Trong tế bào, các phân tử DNA
ngoại lai nằm trong không bào ñược tạo thành do ẩm bào và lysosome thứ hai
nhưng rất ít DNA ñi ñến nhân vả hợp nhất vào genome chủ.

Hình 2.2. Phức hợp DNA-calcium phosphate.
14


Luận Văn Tốt Nghiệp

Nguyễn Công Khang, MSSV: 3052831

Cho ñến nay, ñây là kỹ thuật vô cùng có giá trị ñối với các nghiên cứu
chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và ñang ñược sử dụng nhiều ñể chuyển
các dòng genome vào tế bào ñích. Tỉ lệ các tế bào ñược biến nạp ổn ñịnh của kỹ
thuật này là tương ñương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là
nhiều tế bào ñược biến nạp cùng một lần. Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ
các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư ña cho thấy ñây là phương
pháp duy nhất ñể nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư. Phương pháp
này ñược sử dụng phổ biến bởi vì ñơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số
tế bào chết sau biến nạp không ñáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc
ổn ñịnh và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu
quả biến nạp và mức ñộ biểu hiện của gen chuyển thấp.

Chuyển gen qua liposome
Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo ña ñược sử dụng ñể ñưa DNA vào
tế bào. Lipid với toàn bộ lưới tích ñiện dương ở pH sinh lý là thành phần lipid
tổng hợp phổ biến nhất của liposome ñược phát triển cho chuyển gen. Thường thì
lipid

cation

ñược

trộn

với

một

lipid

trung

tính

như

L-dioleoyl

phosphatidylethanolamine (DOPE). Phần cation của phân tử lipid kết hợp với
DNA tích ñiện âm và kết quả là chứa ñầy DNA trong phức hợp liposome-DNA.
ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích ñiện dương của phức hợp
liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho
phép phức hợp này kết hợp với màng tế bào tích ñiện âm bền hơn. Nhờ cơ chế
nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau ñó ñi vào nhân. Chưa
rõ DNA ñược phóng thích từ endosome và ñi qua màng nhân như thế nào. DOPE
ñược xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích
các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào
phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng.

15