khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh ở lúa ir64 và mtl250 (oryza sativa l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
KHẢ NĂNG TÁI SINH Ở LÚA IR64 VÀ
MTL250 (Oryza sativa L.)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Năm 2009

SINH VIÊN THỰC HIỆN
ĐỖ HOÀNG ĐĂNG KHOA
MSSV: 3052836
LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC
K31


LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ
Nhiệm Khoa Khoa Học, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này.

Xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo, truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Xuân Mai đã tận tình hướng dẫn, bổ sung
nhiều kiến thức bổ ích và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn đến Cô Nguyễn Thị Liên, Cô Nguyễn Thị Pha đã giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình làm luận văn.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ sinh học K.31 đã nhiệt tình động viên,
giúp đỡ, trao đổi và đóng góp ý kiến cho tôi.
Xin chân thành cảm ơn Cha Mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, giúp
đỡ, động viên, chia sẻ những khó khăn cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp
tôi học tập và thực hiện đề tài này.
Tháng 6 năm 2009
Đỗ Hoàng Đăng Khoa


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

MỤC LỤC
Tiêu đề

Trang

PHẦN I GIỚI THIỆU ................................................................................................. 1
PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU............................................................................ 3
I. SƠ LƯỢC VỀ HAI GIỐNG LÚA IR64 VÀ MTL250 ..................................... 3
1. Giống IR64 .................................................................................................... 3
a) Đặc tính nông học .................................................................................. 3
b) Phẩm chất và phản ứng đối với sâu bệnh ............................................. 4

2. Giống MTL250 .............................................................................................. 4
a) Đặc điểm nông học và năng suất ........................................................... 5
b) Phẩm chất và phản ứng đối với sâu bệnh ............................................. 5
II. NUÔI CẤY MÔ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH NUÔI CẤY MÔ....................................................................................... 5
1. Nuôi cấy mô .................................................................................................. 5
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô....................................... 6
a) Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy mô................................................... 6
b) Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 9
c) Điều kiện ủ và chiếu sáng..................................................................... 16
III. NUÔI CẤY MÔ LÚA................................................................................... 17
1. Vật liệu nuôi cấy.......................................................................................... 17
2. Sự phát triển của phôi lúa .......................................................................... 18
3. Các loại môi trường nuôi cấy mô lúa ......................................................... 18
a) Môi trường tạo mô sẹo ......................................................................... 18
b) Môi trường tái sinh chồi ...................................................................... 19
4. Điều kiện ủ và chiếu sáng trong nuôi cấy mô ............................................ 19
PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 21
I. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .................................................................... 21
1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................................. 21
a) Nguyên liệu ........................................................................................... 21


b) Hóa chất ............................................................................................... 21
2. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................... 21
a) Thiết bị ................................................................................................. 21
b) Dụng cụ ................................................................................................ 21
II. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ................................................... 21
1.Thời gian ...................................................................................................... 21
2.Địa điểm ....................................................................................................... 21

III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 22
1. Vô trùng mẫu cấy ....................................................................................... 22
2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của mô
sẹo ................................................................................................................ 23
a) Tiến hành thí nghiệm ........................................................................... 23
b) Ghi nhận kết quả ................................................................................. 23
3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng lên sự phát
triển của mô sẹo .......................................................................................... 23
a) Tiến hành thí nghiệm ........................................................................... 23
b) Ghi nhận kết quả ................................................................................. 23
4. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đường maltose lên sự phát triển của
mô sẹo .......................................................................................................... 23
a) Tiến hành thí nghiệm ........................................................................... 23
b) Ghi nhận kết quả ................................................................................. 23
5. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các môi trường cấy chuyền đến khả
năng tái sinh của mô sẹo ............................................................................. 23
a) Tiến hành thí nghiệm ........................................................................... 23
b) Ghi nhận kết quả ................................................................................. 24
6. Tạo chồi và tạo rễ ........................................................................................ 24
7. Xử lý số liệu ................................................................................................. 24
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 25
I. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của mô sẹo ............ 25
II. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng lên sự phát
triển của mô sẹo .................................................................................................... 27


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

III. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đường maltose lên sự phát triển của
mô sẹo ................................................................................................................... 29
IV. Thí Nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường cấy chuyền đến khả năng
tái sinh của mô sẹo ............................................................................................... 30
V. Tạo chồi và tạo rễ ............................................................................................ 32
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 33
I. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 33
II.ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 34
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 37


DANH SÁCH HÌNH
Tiêu đề

Trang

Hình 1: Cấu trúc hình cầu ........................................................................................ 25
Hình 2: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống IR64.................. 26
Hình 3: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250 ........... 26
Hình 4: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng ở giống IR64 ....................... 27
Hình 5: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250 ........... 28
Hình 6: Hiện tượng tiết phenol ở môi trường CIM-J3 trong điều kiện có
ánh sáng ..................................................................................................................... 31
Hình 7: Mô có chất lượng tốt ở giai đoạn cấy chuyền.............................................. 32
Hình 8: Mô sẹo tạo chồi ............................................................................................. 32
Hình 9: Tạo rễ............................................................................................................ 32

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Tỷ lệ mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở hai giống IR64 và MTL250

ở các điều kiện môi trường và ánh sáng ................................................................... 29
Bảng 2: Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường cấy chuyền...................... 31

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BAP

Benzylaminopurine

CEH

Casein enzyme hydrolase

CIM

Callus induction medium

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

MS

Murashige and Skoog

NAA

α-napthaleneacetic acid


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

TÓM LƯỢC
Hai giống lúa MTL250 và IR64 đã được sử dụng trong nghiên cứu này để theo
dõi các điều kiện nuôi cấy và sự kết hợp các thành phần trong môi trường nuôi
cấy ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của dòng lúa indica. Giống MTL250 có tỷ
lệ hình thành mô sẹo tốt ở cả hai điều kiện sáng liên tục và tối hoàn toàn, giống
IR64 có sự đáp ứng tốt trong điều kiện tối hoàn toàn. Nhiệt độ 320C thích hợp
cho quá trình hình thành mô sẹo và chất lượng mô cho cả hai giống lúa. Sự kết
hợp đường maltose ở nồng độ 3% vào môi trường kích thích mô sẹo có ảnh
hưởng tốt lên khả năng tạo mô sẹo và tỷ lệ mô có cấu trúc hình cầu, chặt và khô.
Trong giai đoạn cấy chuyền, mô sẹo 3 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường
CIM-J3 trong điều kiện tối cho kết quả tốt nhất cho quá trình nhân sinh khối và
biệt hóa của mô sẹo.


PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một quốc gia có nền nông nghiệp lâu đời và cây lúa là một
cây lương thực quan trọng có diện tích canh tác 4,13 triệu ha. Không chỉ ở Việt
Nam, lúa còn là nguồn thực phẩm chính của gần một nửa dân số thế giới
(Shimamoto, 1995). Cây lúa thuộc hai loài: Oryza sativa lúa trồng ở Châu Á và
Oryza glaberima lúa trồng ở Châu Phi. Hai dòng chính của Oryza sativa là
O.japonica và O.indica. Ở Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long được mệnh
danh là vựa lúa của Việt Nam có diện tích canh tác lúa chiếm 40% và sản lượng
lúa chiếm 50% so với cả nước (Nguyễn Thị Lang, 2000).

Những năm vừa qua, trong làn sóng công nghiệp hoá- hiện đại hoá đất
nước, nhiều diện tích đất nông nghiệp đã được chuyển đổi thành những khu
công nghiệp, các nhà máy, chung cư... vì lẽ đó mà diện tích đất phục vụ cho
nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn, năm 2006, tổng diện tích đất trồng lúa của cả nước là 4,13 triệu ha, giảm
316.000 ha so với năm 2000. Các vùng giảm mạnh là đồng bằng sông Cửu Long
với 175.000 ha, Đông Nam Bộ giảm 51.000 ha, đồng bằng sông Hồng giảm
36.000 ha. Bên cạnh đó, tình hình bất lợi do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu đã
gia tăng các thiên tai như hạn hán, lũ lụt, xâm nhập mặn…gây ảnh hưởng đến
năng suất trồng lúa của người dân. Nhu cầu về các giống lúa có năng suất cao,
khả năng chống chịu tốt với thời tiết và sâu bệnh là rất cần thiết để đảm bảo an
ninh lương thực của quốc gia và đáp ứng nhu cầu xuất khẩu gạo. Để thực hiện
được nhu cầu đó, chúng ta phải phát triển công nghệ sinh học phân tử thực vật
để tạo ra các giống tốt và sản xuất nhanh nguồn giống. Nuôi cấy mô là giai đoạn
đầu tiên và quan trọng quyết định sự thành công của công nghệ sinh học thực
vật.
Không phải tất cả các loài thực vật đều đáp ứng như nhau đối với các môi
trường nuôi cấy. Các giống lúa cũng có môi trường nuôi cấy riêng cho từng
giống khác nhau. So với O.japonica thì O.indica có khả năng tái sinh trong nuôi
cấy in vitro thấp hơn (Kyozuca và ctv.,1988). Ở đồng bằng sông Cửu Long,
phần lớn các giống lúa thuộc dòng Oryza indica, do đó để nghiên cứu sâu hơn về
1


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

các giống lúa chúng ta cần tìm ra các môi trường nuôi cấy thích hợp cho dòng
Oryza indica. Mục tiêu của đề tài tập trung vào khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng tái sinh ở hai giống lúa IR64 và MTL250 làm tiền đề cho các thí
nghiệm khác trên hai giống lúa trên.

2


PHẦN II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I. SƠ LƯỢC VỀ HAI GIỐNG LÚA IR64 VÀ MTL250
1. Giống IR64
Giống lúa IR 64 có nguồn gốc từ Viện Lúa Quốc tế (IR18348-36-3-3) được
khảo nghiệm tại đồng bằng sông Cửu Long từ năm 1983 với tên gọi OM89,
được công nhận giống vào ngày 29 tháng 5 năm 1985 tại Hội Đồng Giống
quốc gia Philippines, với tên gọi IR64, được công nhận giống quốc gia tại
Việt Nam năm 1987. Giống IR 64 là một trong ba giống có tính thích nghi
rộng theo kết qủa chương trình INGER năm 1996 (trong đó có giống OM576
của Việt Nam). Đây là giống được lai tạo tại IRRI theo chiến lược đa dạng
nguồn gen kháng với các loại sâu bệnh hại và các stress không phải sinh học.
Trong quá trình phát triển tại ĐBSCL, nó còn có tên IR64B hoặc IR64NC
(nguyên chủng).
Có thể nói sau IR42, giống lúa IR64 có mức độ ổn định trong sản
xuất lâu dài nhất từ trước đến nay, với những ưu điểm năng suất cao, chống
chịu ổn định với sâu bệnh hại chính, nhất là giống cao sản có phẩm chất gạo
hàng đầu, giống hội đủ cả hai tiêu chuẩn hàm lượng amylose trung bình, và
độ trở hồ trung bình. IR64 hiện được chọn là một trong 5 giống phát triển
trong vùng lúa xuất khẩu 1 triệu ha của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn.
a) Đặc tính nông học
Giống lúa IR64 có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm A2 (105-110 ngày).
Chiều cao cây 90-95 cm và độ dài bông 24-25cm. So với giống khác, IR64 có
số bông trên bụi trung bình (10.9 bông). Số hạt chắc trên bông 78.3 hạt. Tuy

nhiên trên một số vùng đất phì nhiêu thì số hạt chắc trên bông cũng đạt tới
92.5 hạt. Tỷ lệ hạt lép trong vụ Đông Xuân khoảng 14.2% và trong vụ Hè
thu rất cao (IR64 không thích hợp lắm cho vụ Hè thu). Khả năng thụ phấn
trong mùa mưa kém so với OMCS94 và OM1723. Trọng lượng 1000 hạt đạt
25,0-27,2 gr, vì vậy IR64 được xếp trong nhóm hạt to. Xét về chỉ số thu
hoạch (HI), IR64 có giá trị HI tương đối cao, đạt 0.56. Năng suất của IR64 có
tiềm năng lớn trong vụ đông xuân, nhưng thường cho năng suất thấp trong

3


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

vụ hè thu, cụ thể năm 1998-1999, năng suất đạt 6.77 tấn/ha vụ Đông xuân
trên 15 điểm, và năng suất 4,29 tấn/ha vụ hè thu, trên 10 điểm. Đây là giống
có tính thích nghi rộng, năng suất ổn định, nên nó được duy trì khá lâu trong
sản xuất ở ĐBSCL, các tỉnh Đông Nam Bộ, duyên hải Trung Bộ.
b) Phẩm chất và phản ứng đối với sâu bệnh
Giống lúa IR64 là một giống có phẩm chất tốt. Tỷ lệ gạo lức 78,96%. Tỷ lệ
gạo trắng 68,34% và tỷ lệ gạo nguyên 50,92%. Chiều dài hạt của giống
IR64 là 7.10mm. Dài/rộng 3.40. Độ bạc bụng 39,90% ( so với cấp 1) . Độ trở
hồ biên động từ cấp 3 đến cấp 5. Độ bền gel 58-60 mm và hàm lượng
amylose đạt 21-23%. Hàm lượng protein tương đối cao so với các giống so
sánh (8.2%). Nhìn chung giống IR64 hoàn toàn có thể đạt được tiêu chuẩn chất
lượng gạo xuất khẩu.
Về phản ứng sâu bệnh cho thấy giống lúa IR64 có khả năng kháng được
bệnh đạo ôn (cấp 1-3) và kháng trung bình đối với rầy nâu (cấp 5). Qua nhiều
vụ sản xuất tại một số điểm ở đồng bằng Sông Cửu Long, giống IR64 tỏ ra

thích hợp với điều kiện thâm canh. Với dạng hình rất đẹp, đẻ khỏe và gọn,
chịu được thâm canh cao và chúng có bộ lá thẳng đứng, đó là tiêu chuẩn một
giống cho năng suất cao. Giống này cũng được làm vật liệu lai trên các nước
trồng lúa. Mới đây người ta ly trích nhân của IR64 làm vật liệu trong
nghiên cứu di truyền phân tử.
Có thể nói giống này tương đối hoàn hảo so với các giống khác .Trên
đất phèn , mặn nhẹ chúng cũng chịu đựng khá tốt và cho năng suất rất ổn định.
2. Giống MTL250
MTL250 là giống lúa được nhập nội từ IRRI, do Đại Học Cần Thơ khảo
nghiệm. MTL250 được chọn là một trong 5 giống phát triển theo chương trình
1 triệu ha lúa xuất khẩu của Bộ NN và PTNT. Đây là giống lúa cao sản ngắn
ngày, có mùi thơm nhẹ, được đăng ký khảo nghiệm trong mạng lưới quốc gia
mấy năm gần đây.

4


a) Đặc điểm nông học và năng suất:
Thời gian sinh trưởng: 105-110 ngày
Chiều cao: 95-105cm.
Dài hạt gạo: 6,9 mm.
Dạng hạt thon dài. Năng suất trung bình 5-7 tấn / ha.
b) Phẩm chất hạt và phản ứng với sâu bệnh:
MTL250 chống chịu rầy nâu cấp 5 và bệnh đạo ôn cấp 4.
MTL250 có dạng hạt thon dài, tỉ lệ bạc bụng cấp 9 là 13,7%, amylose 25,8%,
hàm lượng protein 9,1%, tỉ lệ gạo nguyên 42,7%, tỉ lệ gạo xát trắng 60%, dài
hạt gạo 6,9 mm. Đặc biệt MTL250 có mùi thơm nhẹ sau khi nấu chín, nhưng
thuộc nhóm hơi cứng cơm.
II. NUÔI CẤY MÔ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY MÔ

1. Nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào
thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc nuôi cấy được duy trì
dưới các điều kiện được kiểm soát (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)
Quá trình nuôi cấy mô dựa trên tính toàn năng của tế bào. Theo Haberlandt
(1902),
năng

,m

năng

.

(redifferentiation). Phôi nuôi cấy in vitro hoàn toàn có
thể nảy mầm không qua giai đoạn nghỉ vì thế đòi hỏi môi trường dinh dưỡng
cho sự tạo cây ở phôi trưởng thành và phôi non là khác nhau. Đối với phôi non
cần môi trường giàu dinh dưỡng hơn. Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị
dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa
sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi
không cần các chất điều hòa sinh trưởng. Các chất kích thích như GA3, auxin,

5


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

cytokinin thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường được

dung ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng nhiều đến sự
phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh
sáng thấp hơn so với phôi phát triển ngoài tự nhiên. Nuôi cấy phôi thường
được sử dụng để phá ngủ ở hạt, thử sức sống của hạt và để duy trì những phôi
yếu và cứu phôi lai xa (Nguyễn Đức Thành, 2000)
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
a) Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy mô
*Vô trùng mẫu cấy
Mẫu dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan
hay bộ phận của cây: chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá…các cấu trúc
của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…); các cơ quan dự trữ (củ, căn hành…). Tùy
theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có chứa ít hay nhiều
mầm bệnh (vi khuẩn, nấm). Các cấu trúc thực vật được bao kín (lá mầm,
phôi, mô thịt trong quả…) thường không chứa hoặc có ít vi sinh vật. Ngược
lại, các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc với nước, đất như rễ, củ, thân ngầm
thường có lượng vi sinh vật rất cao và rất khó loại bỏ hoàn toàn chúng ra
khỏi nguồn mẫu.
Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất
có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hiệu quả của các chất này phụ thuộc vào
thời gian, nồng độ xử lý và khả năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách
trên bề mặt mẫu cấy.
-

Dung dịch Hypocloride

Ion hypocloride có trong sodium hypocloride (NaOCl) hoặc Calcium
hypocloride [Ca(OCl)2]. Sodium hypocloride hòa tan trong nước ở dạng
lỏng. Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox.
Nồng độ cuối cùng có thể thay đổi từ 0,25 – 2% trọng lượng / thể tích tùy

thuộc vào vật liệu thí nghiệm và thời gian ngâm mẫu.

6


Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch hypocloride là cả hypoclorous acid
(HOCl) và ion OCl-. Người ta cho rằng HOCl hiệu quả hơn OCl- do hiệu quả
diệt khuẩn chlorine tốt nhất ở dung dịch hypocloride acid nhẹ. NaOCl và
Ca(OCl)2 thường được sử dụng vì chúng có mức độ độc tính thấp với mẫu,
không có biểu hiện ức chế sinh trưởng.
-

Cồn

Trong số các loại cồn được sử dụng để khử trùng, cồn ethanol được sử dụng
rộng rãi nhất. Cồn không những giết khuẩn mà còn lấy đi các chất sáp từ mô
mẫu cấy. Cồn khử trùng thường sử dụng nồng độ từ 70-95%. Cồn methanol
ít hiệu quả hơn cồn ethanol. Một số trường hợp cồn isopropanol rất có hiệu
quả nhưng thời gian khử trùng tương đối ngắn, từ 0,5-1 phút ở nồng độ
100%.
-

Ion kim loại nặng

Trong các kim loại nặng thì mercuric chloride (HgCl2) là chất khử trùng
được sử dụng thông dụng nhất. Sử dụng hóa chất này phải hết sưc cẩn thận vì
độc cho thực vật lẫn động vật, cũng như chất thải sau khi khử trùng có ảnh
hưởng đến môi trường. Ở các nước phát triển, các chất thải sau khi khử trùng
bằng HgCl2 sẽ được thu hồi và tái sử dụng. Các ion Ag+ và Cu2+ đôi khi cũng
được sử dụng như các chất diệt khuẩn.

-

Chất khử nấm

Nhiều chất khử nấm có nguồn gốc là thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng
trong khử trùng. Ví dụ Benomyl, Carbendazim, Fenbendazol là các chất khử
nấm của thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng như chất khử trùng bề mặt.
Nồng độ và liều lượng thay đổi theo loại mẫu thực vật.
-

Chất kháng sinh

Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực
tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy. Các chất kháng sinh thường được sử dụng
là: Streptomycin, Merthiolate, Penicilin, Alcide, Rifampicin.

7


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

*Vô trùng dụng cụ và môi trường
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát
triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần
môi trường nuôi cấy. Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa
đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn
phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các
tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi

khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ
chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Để vô trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng một trong các
biện pháp sau:
-

Khử trùng khô

Phương pháp này chỉ dung cho các dụng cụ bằng kim loại, thủy tinh và
những dụng cụ khác có tính chịu nhiệt (không bị cháy, nóng chảy…). Các
dụng cụ trước khi đem sấy phải được gói kín bằng giấy nhôm và chỉ được
mở trong tủ cấy vô trùng. Thiết bị dùng để khử trùng khô là lò sấy.
Thời gian khử trùng khô với hầu hết các dụng cụ như sau (Willett, 1988):
+Thời gian khởi động khoảng 60 phút để cho các dụng cụ
đều đạt được nhiệt độ 1800C (3560F).
+Thời gian duy trì ít nhất là 120 phút mới có thể loại bỏ hết
các loại bào tử.
+Thời gian giảm dần nhiệt độ, đặc biệt với các dụng cụ thủy
tinh, tránh làm giảm nhiệt độ quá đột ngột gây vỡ bình.
-

Khử trùng ướt

Là phương pháp hiệu quả và phổ biến trong vô trùng môi trường và các dụng
cụ nuôi cấy. Thiết bị được sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường sử
dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường dùng ở 1210C (2500F, ~ 103,4kPa).
Khử trùng ướt cần chú ý:
+Không khử trùng môi trường nuôi cấy với thời gian quá
dài, một số thành phần môi trường sẽ bị phân hủy. Theo Hagel và

8


cộng sự (1991), có khoảng 5% đường saccarose của môi trường bị
phá hủy khi khử trùng.
+Sau khi khử trùng phải giảm áp suất từ từ, giảm nhanh sẽ
làm cho chất lỏng trong bình trào lên miệng bình.
-

Màng lọc

Dùng để loại bỏ tác nhân gây nhiễm có kích thước 0,025-10µm khỏi môi
trường nuôi cấy (môi trường lỏng), nước cất…Đây là phương pháp phù hợp
đối với những môi trường mà thành phần của chúng bị phân hủy bởi nhiệt độ
cao. Những môi trường đó được lọc vô trùng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
qua các màng có lỗ siêu nhỏ.
Các loại màng lọc phổ biến:
+Màng lọc bằng thép không gỉ: màng Swinney.
+Màng lọc bằng polypropylene: màng Swinex, đây là loại
màng chỉ dùng 1 lần rồi bỏ.
Với các dung môi kỵ nước như dung dịch có chứa dimetyl sulfoxit thì phải
dùng màng lọc bằng cellulose acetate (có kích thước 0,1-0,2 µm). kích thước
lỗ của màng lọc ≤ 0,22 µm, có thể loại bỏ hoàn toàn các vi sinh vật gây
nhiễm: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…(Torres, 1989).
b) Môi trường nuôi cấy
Thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật,
loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan
nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác
nhau. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển
của mẫu cấy.

Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các môi
trường nuôi cấy đều gồm có các thành phần sau: các chất vô cơ, các vitamin, các
acid amin, nguồn carbonhydrate, các chất điều hòa sinh trưởng và các chất tạo
môi trường đặc.

9


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

*Các chất vô cơ
Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng được đưa vào môi trường nuôi cấy.
Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực vật tách rời không khác nhiều so
với yêu cầu của cây trong điều kiện tự nhiên. Có nhiều nguyên tố khoáng được
sử dụng trong môi trường nuôi cấy, mỗi nguyên tố có vai trò riêng. Các nguyên
tố khoáng được chia thành hai nhóm: nguyên tố khoáng đa lượng và nguyên tố
khoáng vi lượng.
- Các nguyên tố khoáng đa lượng
-Nitrogen (N): là thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất hữu cơ như
ptotein, amino acid, chlorophyll…Dạng nitrogen thường được cung cấp dưới
dạng KNO3, NaNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4,…Nồng độ trong môi trường nuôi
cấy từ 3 =>6mM
-Lân (P): Lân là thành phần cấu tạo của các thành phần quan trọng của
thực vật như acid nhân (DNA, RNA), màng tế bào (phospholipid), ATP,
NADPH…Mô cấy hấp thu lân ở các hình thức khác nhau như H2PO4- , HPO42-,
PO43-. Nồng độ trong môi trường từ 0.15 =>4mM.
- Potassium(K): Potassium là thành phần xúc tác của nhiều enzyme. Vai
trò của potassium liên quan nhiều đến quá trình tổng hợp carbonhydrate. Mô cây

hấp thu potassium ở dạng K+. Các dạng muối potassium thường dùng là KNO3,
KCl, KH2PO4. Nồng độ trong môi trường từ 2 =>25mM.
-Calcium (Ca): Calcium là thành phần của vách tế bào, màng tế bào và
hoạt tính của một số enzyme. Mô cây hấp thu dưới dạng Ca2+. Các dạng Calcium
thường dùng là Ca(NO3)2.6H2O, CaCl2.6H2O. Nồng độ trong môi trường từ
1=>3,5mM.
-Magnesium (Mg) : Magnesium được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O
với nồng độ từ 0,5=>3mM.
-Lưu huỳnh (S): là thành phần của một số amino acid như cystein,
methionin và vài vitamin. Mô cây hấp thu lưu huỳnh ở dạng SO42-.

10


-Sodium (Na): Ion Na+ được hấp thu vào trong cây tuy nhiên chức năng
của Na đối với cây trồng thực sự chưa rõ. Người ta cho rằng Na có chức năng
ổn định thẩm thấu của các cây sống trong vùng mặn.
-Chloride (Cl): Chloride có vai trò trong quang hợp chủ yếu ở hệ thống
quang II trong quá trình quang phân ly nước. Ngoài ra, ion Cl- còn điều hòa sự
đóng mở của khí khẩu. Mô cây hấp thu Chloride ở dạng Cl-.
-

Các nguyên tố khoáng vi lượng

Các nguyên tố thường được sử dụng như Iodine (I), Bo(B),
Mangan(Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Nhôm (Al), Sắt (Fe)…Có rất ít các
nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển
của mô và tế bào. Tuy nhiên để an toàn các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với
cây đều được cung cấp trong môi trường nuôi cấy.
-Bo (B): Vai trò của Bo trong cây cũng chưa thực sự rõ. Người ta thấy Bo

có liên quan đến sự điều hòa hoạt động của enzyme phenolase, biến dưỡng acid
phenolic và sự tổng hợp lignin.
-Mangan (Mn): Mangan là một nguyên tó vi lượng quan trọng trong môi
trường nuôi cấy, là thành phần quan trọng trong quang phân ly nước và cũng là
thành phần hoạt hóa cho nhiều enzyme. Mô cây hấp thu mangan ở dạng Mn2+.
-Kẽm (Zn): Vai trò của kẽm liên quan đến các phản ứng tổng hợp Indol
acetic acid (IAA). Kẽm cũng là thành phần hoạt hóa của một số enzyme. Mô
hấp thu kẽm ở dạng Zn2+.
-Đồng (Cu): Đồng là nguyên tố vi lượng tham gia vào sự hoạt hóa của các
enzyme cytocrome oxydase trong hô hấp, trong các chất vận chuyển điện tử
như plastocyanin. Đồng cũng là thành phần của ascorbic acid oxydase.
-Cobalt (Co): Co là thành phần kim loại của vitamine B13 liên quan đến
sự tổng hợp acid nhân. Mô hấp thụ ở dạng Co2+.
-Sắt (Fe): Sắt là nguyên tố cần thiết bởi vì nó hình thành bộ phận của vài
enzyme hay nhiều protein vận chuyển điện tử trong quá trình quang hợp và hô
hấp. Nó trải qua sự oxy hóa luân phiên giữa trạng thái Fe2+ và Fe3+ khi nó đóng
vai trò như chìa khóa của hệ thống enzyme. Các enzyme này bao gồm catalase,
peroxidase và một số cytocrome. Cytocrome hoạt động trong cơ chế hô hấp của

11


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

các tế bào sống. Sắt không phải là thành phần của diệp lục tố nhưng rất cần cho
sự sinh tổng hợp của diệp lục tố.
-Aluminium, Nickel (Al, Ni): Nhôm và Nickel là các nguyên tố vi lượng
được cho vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, vai trò sinh lý của các nguyên tố

này thì chưa thật sự hiểu rõ. Người ta thấy Nickel là thành phần của enzyme
urease biến đổi ure sang ammonium.
*Các vitamin
Các vitamin có chức năng làm chất xúc tác trong quá trình biến dưỡng.
Lượng vitamin được tổng hợp trong mô rất ít nên cần cung cấp vitamin trong
môi trường nuôi cấy. Các vitamin thường được sử dụng là: Thiamin (B1) cần
cho sự trao đổi hydratcarbon và sinh tổng hợp một số amino acid, Nicotinic
acid (B3) tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp, pyridoxine (B6) là một
coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng tra đổi chất. Ngoài ra còn sử dụng
các loại vitamin khác như Biotin (vitamin H), Acid Folic (Vitamin M),
Riboflavin (vitamin B2), acid ascorbic (vitamin C), acid pantothenic (vitamin
B5), Toccopherol (vitamin E). Các vitamin thường được dùng ở nồng độ từ 0,1
=>10mg/l.
* Acid amin
Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường cần phải được bổ sung các
amino acid vì chúng giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái.
Tất cả các dạng tự nhiên của amino acid (dạng L) dễ dàng được mô nuôi
cấy hấp thụ (Skoog and Miles, 1957). L-arginin dung cho nuôi cấy rễ, L-tyrosin
dung cho nuôi cấy chồi, L-serin dung cho nuôi cấy hạt phấn. Nồng độ sử dụng
của mỗi loại là 10-100mg/l (Narayanaswamy, 1994).
Các L-glutamin, L-asparagin cũng được dùng trong nuôi cấy vì chúng
tham gia vào cảm ứng và duy trì quá trình phát sinh phôi vô tính. Các amino
acid còn là nguồn cung cấp nitơ hữu cơ cho mô cấy.

12


*Nguồn carbonhydrate
in vitro

). Nồng
độ đường thường sử dụng từ 20 =>30g/l (Bùi Bá Bổng, 1995).

. Sucrose là một đường đôi cấu
tạo từ một phân tử glucose và một phân tử fructose, trong khi kh

.
Maltose là một đường đôi được hình thành từ hai phân tử đường glucose
liên kết với nhau bằng nối α 1-4 glycosidic. Maltose có thể bị phân giải thành
hai phân tử glucose trong quá trình thủy phân. Trong cơ thể sống, enzyme
maltase sẽ xúc tác phản ứng xảy ra nhanh hơn.
, như: lactose, galactose, rafinose,

.
*Các chất điều hòa sinh trưởng
-

Auxin

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA). Có
nhiều loại auxin đã được tổng hợp nhân tạo như indole-3-butyric acid (IBA),
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), alpha-naphthaleneacetic acid (NAA).
Trong lính vực nuôi cấy mô, các auxin có tác dụng lên sự phân chia tế bào và
quá trình gián phân. Một trong những áp dụng chính của auxin là kích thích quá
trình tạo rễ. Các auxin tổng hợp thì ổn định với nhiệt độ và ánh sáng hơn IAA.
Do đó chúng có thể được hấp khử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

13

Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

Các auxin thường được sử dụng ở nồng độ 0,1=>5,0mg/l. Auxin thường
được dùng kết hợp với cytokinin trong sự nhân chồi (Bùi Bá Bổng, 1995).
Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động
sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay
thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus).
- Cytokinin
Cytokinin là adenine được thay thế N-6 liên kết với auxin gây ra sự phân
chia tế bào ở thực vật. Zeatin là cytokinin tự nhiên ở thực vật. Kinetin và
benzyladenin được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây được chứng minh là được
tạo ra tự nhiên ở vài loài cây. Cytokinin đóng vai trò chính trong sự thành lập
chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô. Nhiều cytokinin được tổng hợp như
diphenylurea (DPU), thidiazuron (TDZ). TDZ được sử dụng rộng rãi trong nuôi
cấy mô ngày nay. TDZ ngăn cản cytokinin oxidase và giảm sự biến dưỡng dẫn
đến mức độ cao hơn của cytokinin trong nuôi cấy mô. Benzyladenin được sử
dụng để kích thích sự tăng trưởng chồi, các cytokinin thường được dùng ở nồng
độ từ 1=>10mg/l (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
-

Các chất điều hòa sinh trưởng khác

Ngoài các chất trên, một số chất khác cũng được sử dụng trong nuôi cấy
mô như:
-Gibberelin: GA3 thường được sử dụng để kích thích sự kéo dài ở
phân sinh mô chồi.
-Abscisic acid (ABA): được sử dụng trong sự tạo phôi vô tính
trong thao tác phôi và đổi phôi thành cây con.

* Các chất tạo môi trường đông đặc
Trong nuôi cấy mô, ngoài môi trường lỏng còn có môi trường đặc vì mỗi loại có
môi trường nuôi cấy riêng. Để tạo môi trường rắn, các chất tạo gel thường được
cho thêm vào như Agar, Agarose, Gelrite, Phytagel.

14


-

Agar

Agar được sản xuất từ các loài tảo đỏ ở biển. Khi hòa với chất lỏng ở
1000C sẽ chuyển sang dạng gel, nhiêt độ hạ xuống 450C thì chuyển sang dạng
rắn. Agar không phản ứng với các thành phần trong môi trường và không bị
phân hủy bởi các enzyme từ thực vật. Nồng độ agar thường được dùng trong môi
trường nuôi cấy từ 0,5=>1%. Ở nồng độ này để tạo được gel tốt còn tùy thuộc
vào độ pH. Có than hoạt tính trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự tạo gel
của agar. Nồng độ agar có thể gây nguy hại cho vật liệu nuôi cấy. Môi trường
quá mềm có thể gây thừa nước cho mô, trong khi môi trường quá cứng có thể
gây cản trở sự sinh trưởng.
-

Agarose

Agarose được tạo thành từ β-D galactopyranose và 3,6-anhydro α-Lgalactospyranose lien kết thành các chuỗi polymer chứa từ 20 đến 160 đơn vị
monosaccharide. Agarose được chiết xuất từ Agar sau khi đã loại bỏ agaropectin
và nhóm sulfate. Agarose có cường độ tạo gel cao hơn agar.
-

Gelrite

Gelrite TM (Kelco Division of Merck and Co.) là polysaccharide được
sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas elodea. Gelrite tạo được môi trường trong
suốt nên có thể nhận biết sự tạp nhiễm từ rất sớm. Tuy nhiên, gelrite không thể
tạo gel khi đun nóng lại như agar. Một đặc tính giới hạn nữa của Gelrite là nồng
độ của cation hóa trị hai như ion calcium và ion magnesium phải ở trong khoảng
4=>8mM/l. Nồng độ của hai ion trên thấp hoặc cao hơn khoảng này đều làm cho
môi trường không tạo gel được. Gelrite TM cũng có khả năng gây dư lượng
nước trong mô khi dùng ở lượng thấp.
-

Phytagel

PhytgelTM được xem là dạng thay thế agar đươc sản xuất từ một chất có
nguồn gốc từ vi khuẩn, bao gồm acid glucuronic, rhamnose và glucose.Tạo môi
trường trong suốt và có tính tạo gel cao vì vậy giúp nhận biết sự tạp nhiễm rất
tốt. Phytagel được dùng với nồng độ từ 1,5=>2,4g/l. Sự dư thừa nước trong mô
cũng xảy ra với chất tạo gel này.

15


Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

Tùy loại vật liệu mà chất tạo gel nào sẽ được sử dụng. Mô của một vài
loài có thể sinh trưởng tốt trong môi trường có chất tạo gel này nhưng lại không
tốt ở môi trường có chất tạo gel khác. Các chất tạo gel khác nhau sẽ gây ra hiên

tượng dư thừa nước ở mô khác nhau. Do đó nên kết hợp sử dụng các chất tạo gel
với nhau.
* Độ pH của môi trường nuôi cấy

5,0-6,0 t

.
Độ pH quyết định sự hòa tan của khoáng, ảnh hưởng sự hấp thụ khoáng
trong môi trường và hiệu quả tạo gel của agar. Môi trường có pH thấp (thấp hơn
4,5) hoặc cao (cao hơn 7,5) ức chế sự phát triển của mô. Môi trường trước và sau
khi khử trùng có thay đổi giá trị pH một ít, nếu pH bắt đầu ở khoảng 5,0-7,0 sau
khi khử trùng sẽ giảm pH từ 0,3-0,5 đơn vị. Khi chuẩn bị môi trường có thể điều
chỉnh pH bằng NaOH hoặc HCl nồng độ 0,1-1,0N (Bùi Bá Bổng, 1995).
c) Điều kiện ủ và điều kiện chiếu sáng
Trong nuôi cấy mô cường độ sáng có thể trong khoảng 1000-5000lux. Thời
gian chiếu sang thường là 16 giờ sáng / 8 giờ tối. Nhiệt độ chung cho phòng nuôi
cấy ở 22± 20C. Trong sự tạo rễ ở môi trường, cây có thể được chiếu sáng ở
cường độ cao (3000-10000 lux), kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng
sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và
hơi mất màu xanh nhưng khi chuyển sang môi trường đất đạt tỷ lệ sống sót cao.
Ở cường độ ánh sáng thấp, cây cao và xanh nhưng tỷ lệ sống sót thấp hơn (Bùi
Bá Bổng, 1995).

16


III.

NUÔI CẤY MÔ LÚA
1. Vật liệu nuôi cấy

Tùy theo mục đích nghiên cứu mà vật liệu nuôi cấy sẽ được chọn từ những
phần khác nhau của cây lúa ban đầu. Một phương pháp sản xuất trực tiếp các
giống lúa là nuôi cấy mô phân sinh chồi từ hạt gạo nảy mầm hai tuần tuổi.
Dương Tấn Nhật và ctv (2000) đã tiến hành thí nghiệm trên mẫu cắt mỏng của
mô phân sinh chồi của hạt gạo nảy mầm hai tuần tuổi. Kết quả có hơn 95% cây
con tái sinh sống sót khi chuyển ra nhà kín. Phương pháp này giúp rút ngắn thời
gian tái sinh cây so với phương pháp tái sinh từ mô sẹo vì không phải qua giai
đoạn cấy chuyển.
Bên cạnh mô phân sinh chồi thì mô phân sinh rễ cũng được sử dụng để tái
sinh cây. Theo báo cáo của Shin-ichiro Kawata và Aiya Ishihara (1968), mô sẹo
đã được tạo từ chóp rễ và được tái sinh trên môi trường MS có bổ sung thêm
2,4-D, IAA, thiamine, pyridoxine, nicotinic acid, casein hydrolysate. Năm 2003
Mandal và ctv. đã báo cáo về nghiên cứu tạo mô sẹo từ rễ non của hai dòng lúa
Quing Livan 1 và IET 13856. Rễ từ hạt lúa mới nảy mầm được 8 ngày tuổi có
khả năng tạo sẹo với phẩm chất tốt và tỷ lệ tái sinh cao.
Ngoài ra, phương pháp tạo mô sẹo từ hạt gạo là một trong những phương
pháp phổ biến trong nuôi cấy mô lúa. Lúa dưới 3 tháng tuổi sau khi thu hoạch sẽ
cho kết quả tạo sẹo tốt hơn lúa đã thu hoạch sau 3 tháng (Huỳnh Thị Hồng Mai,
2005). Theo báo cáo của Nguyễn Minh Thế (2001) tỷ lệ tạo mô sẹo từ hạt gạo
của các giống KDML 105, Jasmine 85, Tài nguyên, Một bụi cũng đạt kết quả
tốt.
Cây lúa được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy túi phấn đã được báo cáo
lần đầu bởi Niiezki và Oono (1968). Chen Y và ctv. (1981, 1982) đã báo cáo về
sự phát triển của mô sẹo và cây được tạo ra từ hạt phấn lấy từ bao phấn 3-4 ngày
tuổi. Kỹ thuật này được ứng dụng nhằm tạo các dòng thuần đơn bội kép.

17

Luận văn tốt nghiệp

Công nghệ Sinh học K31

2. Sự phát triển của phôi lúa
Phôi lúa phát triển theo các giai đoạn sau:
+Giai đoạn tiền phôi (proembryo stage): Phôi có cấu trúc hạt có màu đục
với bề mặt nhẵn. Trong quá trình chuyển tiếp sang giai đoạn tiếp theo thì hình
thành những cấu trúc sợi nhỏ trên bề mặt của các hạt.
+Giai đoạn hình cầu (Globular stage): Phôi có cấu trúc hình cầu, trên bề
mặt có cấu trúc mạng lưới.
+Giai đoạn hình vảy (Scutellar stage): Phôi có màu trắng đục và cấu trúc
chặt chẽ hơn. Cấu trúc hình cầu chuyển sang hình vảy và hình thành bao lá mầm.
Trên bề mặt xuất hiện các rãnh nhỏ và cấu trúc mạng lưới mất dần.
+Giai đoạn phát triển bao lá mầm (Coleoptilar stage): Bao lá mầm được
hình thành ở giai đoạn trên phát triển và rễ bắt đầu hình thành. Bề mặt của bao lá
mầm phát triển giống như biểu mô của lá. (Totik Sri Mariani và ctv., 1998).
3. Các loại môi trường nuôi cấy mô lúa
a) Môi trường tạo mô sẹo
Fujiwara và Yatazama (1964) là những nguời thành công đầu tiên trong
nuôi cấy mô sẹo của lúa trên môi trường Hellers có bổ sung vitamin và 2,4-D
(2ppm).
Trong báo cáo năm 2004 của Haifeng Qian cho thấy môi trường MBA
(môi trường cơ bản MS có bổ sung 6-benzyladenine) cho tỷ lệ tạo mô sẹo 80,3%
trên giống Pei’ai64s so với môi trường muối cơ bản N6 và MS.
Năm 2005, Monirul Islam và ctv. đã báo cáo nghiên cứu cho thấy môi
trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/L và Calcium Silicate 60mg/L cho tỷ lệ tạo
mô sẹo 100% trên các giống Pajam, Lucky và Kalizira. Tuy nhiên khi chuyển
qua môi trường tái sinh cây thì các mô sẹo này chỉ tạo rễ.
Năm 2005, Huỳnh Thị Hồng Mai đã báo cáo kết quả thí nghiệm cho thấy

môi trường MS cơ bản có bổ sung 500mg/l proline, 500mg/l glutamine, 300mg/l
CEH, 30g/l sucrose, 2,5mg/l 2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất ở hai giống
lúa MTL250 và IR64 với tỷ lệ lần lượt là 46% và 44,7%.

18