NGHIÊN cứu một số CHỦNG VI KHUẨN lên MEN KOMBUCHA từ TRÀ THÁI NGUYÊN

Bộ GIÁOLời
DỤC
cảmVÀ
ơn!ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC su PHẠM HẢ NỘI 2
———* Ỷ- *———
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới
PGS.

TS.

Đinh Thị Kim Nhung - người đã hưóưg dẫn tận tình chỉ bảo, người đã cung cấp
LÊ THỊ HUỆ
cho
tôi
nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành nghiên cứu.
Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn Vi
sinh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

khoa Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, giúp
LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ THÁI NGUYÊN
đỡ
tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám hiệu
CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòngHỌC
biết ơn chân thành tới nhũng người thân
MÃ SỐ: 60 42 01 20

trong
gia
đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này
LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC
Hà Nội, 12 tháng 7 năm 2013
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM
NHUNG
Tác giả luận
văn
Lê Thị Huệ

HÀ NỘI, 2013


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết
quả
của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống
kê,
không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả bất kỳ của tác giả
nào

đã

công bố. Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi
Tác giả luận
văn
Lê Thị Huệ

NHỮNG TÙ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
1. AD

P
2. ATP

:
3. cs

:
diphotphat
Adenozin

Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn
lạc)
:

U:

:

D
6. Glc

triphotphat

: cộng sự

4. CF

5. FA

Adenozin

Flavin

adenine

dinucleotide

Glucuronic

acid

:

Môi

trường

:

Nicotiamide

adenine

:
:

para

-

amino

Pyrroloquinoline

benzoic

acid

Quinone

: Hydroquinone
UA
15. vsv
: Symbiotic Colony of Bacteria and Yeast


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................1

1. Lý do chọn đề tài............................................................................................1
2. Mục đích của đề tài........................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................2
5.1. Phương pháp vi sinh........................................................................................2
5.2. Phương pháp hóa sinh.....................................................................................2

5.3. Phương pháp cảm quan...................................................................................3
5.4. Phương pháp toán học......................................................................................3
6. Đóng góp của đề tài..........................................................................................3

NỘI DUNG...................................................................................................4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................4

1.1........................................................................... Tổng quan về kombucha
..........................................................................................................................4

1.1.1. Sơ lược về kombucha.................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo........................................................................................8
1.1.3.

Hệ sinh vật trong kombucha.......................................................................9

1.1.3.1. Vi khuân acetic........................................................................................9
1.1.3.2. Nấm men................................................................................................11
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic....................................................................................... 12
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men.........................................................12
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha......................................16
1.1.5.1............................................................................................................................ T


1.3............................................................................................................. Tì
nh hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới...............20

1.3.1. Trên thế giói..............................................................................................20
1.3.2. Ở Việt Nam................................................................................................22
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.............25

2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu.................................................................25
2.1.1. Đối tuợng.....................................................................................................25

2.1.2. Hóa chất và thiết bị.................................................................................25
2.1.3.1. Hóa chất..............................................................................................25
2.1.3.2. Thiết bị................................................................................................25
2.1.3. Môi trường................................................................................................26
2.2..................................................................... Phương pháp nghiên cứu
..................................................................................................................26

2.2.1. Phương pháp vi sinh................................................................................26
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuấn và quan sát hình thái tế bào
trên tiêu bản nhuộm Gram..................................................................................26
2.2.1.2.

Phuơng pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp

đếm .... 28
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống...........................................................................29
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống................................................................29

2.2.2. Phương pháp hoá sinh.............................................................................29
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính cataỉase..............................................................29
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu êtylic thành acid acetic.... 29


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THẢO LUẬN............................34

3.1.

Phân lập các chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái
Nguyên34

3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuân có khả năng lên men kombucha.................39

Xác định hàm lượng của acid tông số được tạo ra của mỗi chủng vi

3.2.1.

khuấn
Acetobacter.....................................................................................................39
3.2.2.............................................................................................................................. Đánh

giá cảm quan sản phấm kombucha................................................................40
3.2.3.............................................................................................................................. Phâ

n loại các chủng vi khuân đă tuyên chọn đê lên men kombucha...................42
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học.............................................................................42

3.2.3.2. Sinh truửng trên môi trường thạch đĩa..........................................42
3.2.3.3. Đặc tính sinh hóa...............................................................................43
3.2.4.

Nghiên

cứu

động

thái

sinh

trưởng

của

chủng

vi

khuấn

Acetobacter A2 và A15........................................................................................46

3.3.

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tói quá trình lên men

kombucha ..............................................................................................................48

3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình
lên men kombucha................................................................................................48

3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2S04...............................................48
3.3.1.2.

Khảo sát ảnh hưởng của MgS04.7H20...............................................49

3.3.1.3. Khảo sát ảnh hưỏng của KH2PƠ4 .................................................50

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tói quá trình lên
men kombucha......................................................................................................51


3.4.3.1. Đánh giá sản phâm kombucha băng phương pháp cảm quan.................64
3.4.3.2............................................................................................................................. Ki

ểm tra chất lượng sản phẩm..................................................................................64
KẾT LUẬN VÀ........................................................................KIẾN NGHỊ
66
1. Ket luận..........................................................................................................66


DANH MỤC HÌNH, BẢNG
HÌNH

1.1................................................................................................................ Đ
ộ pH của kombucha...............................................................................................6

1.2. Kombucha bị nhiễm nấm mốc......................................................................6
1.3. Cấu trúc hóa học của một số họp chất trong trà kombucha......................6
1.4. “ Con nấm” (SCOBY).................................................................................. 8
1.5. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và
hình dạng khác nhau.............................................................................................9

1.6. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men........................................13
1.7. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic..................................................15

1.8. Trà Thái Nguyên......................................................................................20
3.1. Anh mẫu vi khuân Ai5 nhuộm Gram.....................................................35

3.2. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic.......................................................35
3.3. Khả năng oxy hoá acetate...........................................................................37
3.4. Hoạt tính catalase của Acetobacter.............................................................37
3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2.39
3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên kính hiển vi quang

học (x 1000 lần)..............................................................................................42
3.7. Khuân lạc của vi khuân Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch

đĩa 43
3.8. Mầu vi khuấn Acetobacter A2 và A]5 trên môi trường thạch nghiêng. .43
3.9. Đồ thị biếu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2

và
A,5..................................................................................................................47


KH2PC>4 1,0 và 1,5 (g/1)............................................................................. 50
3.14. Anh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 với thời gian lên men

5,
7 và 9 ngày......................................................................................................53
3.15. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A]5 với giá trị pH ban

đầu
là 4 và 5...........................................................................................................55
3.16. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 ở nhiệt độ 20°c và

30°c.................................................................................................................57

3.17. Lên men kombucha trong cốc inox thường 150ml, sau quá trình lên

men
phần đáy cốc chứa môi trường bị ăn mòn bởi acid acetic..............................58
3.18.......................................................................................................................... L

ên men kombucha trong cốc thủy tinh 250ml................................................58
BẢNG
1.1. Thành phần hóa học trà kombucha............................................................17
2.1................................................................................................................................ C

ác chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha.......................................32
2.2................................................................................................................................ H

ệ số quan trọng của từng chỉ tiêu.......................................................................33
2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất hiợng sản phấm...................................33
3.1. Hàm lượng acid tông sô sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 9

chủng vi khuẩn Acetocbacter..........................................................................40
3.2. Khả năng tạo độ trong, hưong thơm và mùi vị đặc trung của kombucha từ

9
chủng vi khuân Acetobacter............................................................................41
3.3. Đặc điểm sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter........43
3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter A]5 và A2 (xl06tế bào)....46
3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tông số

sinh
ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A)5...........................................................52
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid tông số sinh

3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2

chủng Acetobacter A2 và Ai5.........................................................................56
3.9. Một số đặc điểm so sánh khi lên men kombucha ở các dụng cụ làm bằng

các
vật liệu inox, thủy tinh, nhựa..........................................................................59
3.10. Đánh giá chất lượng sản phấm kombucha bằng phương pháp cảm


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang trở thành một ngành kĩ thuật chủ
đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh với
những thành tựu lớn, có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp,
trong y học... Khó có thế tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học mà
lại không liên quan tới vi sinh vật.
Công nghệ vi sinh được ứng dụng rộng rãi trong đời sống, đặc biệt là
trong công nghệ thực phấm như muối dưa, làm sữa chua, nem chua... và sản
xuất đồ uống như bia, rượu... Một trong những sản phấm được tạo ra từ công
nghệ vi sinh là trà " thủy sâm" đã xuất hiện từ rất lâu nhưng lại rất ít người
biết đến. Trà " thủy sâm", người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie
(nấm trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là
thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà. Đây là một loại nước uống được nhiều
người sử dụng và có lợi cho sức khỏe đối với tất cả mọi người đặc biệt với
người già và trẻ em. Kombucha là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám,
thật ra là một hỗn họp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và vi khuấn.

Khi các vi sinh vật được nuôi trong một môi trường trà dược, cung cấp
đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng nhũng chất dinh dưỡng căn bản
khác, chúng phát triển và biến đối đường thành acid lactic, acid gluconic đồng
thời sản xuất ra một lượng nhở alcohol, alcohol này sau đó biến đối thành
acid acetic (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà một vị ngọt và có mùi chua của
mọn táo lên men. Thành phấm ‘trà” sau cùng chứa trung bình từ 0.5 đến 1%
alcohol, một lượng nhỏ lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và
oxalic acid. Lượng các vitamin B trong thành phấm khá cao, ngoài ra còn có
một lượng nhở vitamin c.


2

Trên thế giới kombucha đã được sản xuất trên quy mô công nshiệp và
đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu liên quan. Ở Việt Nam, kombucha
mới chỉ được lên men tại các hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệu khác nhau
như trà xanh, trà lipton... Trên thị trường có rất nhiều sản phấm kombucha
nhập khấu được bán tại các cửa hàng nhưng chưa có công trình nghiên cứu
hoàn chỉnh và đầy đủ về sản phấm này, đặc biệt chưa có nghiên cún nào về
các chủng vi khuấn lên men kombucha. Chính vì vậy tôi quyết lựa chọn đề tài
" Nghiên cứa một sô chủng vi khuân lên men kombucha từ trà Thải Nguyên

2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cún đánh giá sự đa dạng của một số chủng vi khuấn lên men
kombucha. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men và
xây dựng quy trình lên men kombucha.

3. Nội dung nghiên cứu
3.1.

Phân lập, tuyến chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men

kombucha

3.2.

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha

3.3.

Xây dựng quy trình lên men kombucha

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cửu
Chủng vi khuấn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

5. Phương pháp nghiên cún
5.1.

Phương pháp vỉ sình

Phương pháp phân lập vi khuấn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu
bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp
bảo quản chủng giống.

5.2.

Phương pháp hóa sinh

Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic;
phát hiện khả năng chuyến hóa glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trưởng

trên môi trường Hoyer; phương pháp xác định khả năng tổng họp acid bằng


3

chuấn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị; phát hiện khả
năng tổng hợp cellulose.

5.3.

Phương pháp cảm quan

Đánh giá sản phẩm theo TCVN 3217-79

5.4.

Phương pháp toán học

6. Đóng góp của đề tài
Nghiên cứu sự đa dạng của một số chủng vi khuấn có khả năng lên men
kombucha từ trà Thái Nguyên; xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô
phòng thí nghiệm.


4

NỘI DƯNG
CHƯƠNG 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Tổng quan về kombucha

1.1.1.

Sư lược về kombucha

Cùng với xu hướng tiêu dùng mới, khi vấn đề sức khỏe người tiêu dùng
được đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phấm gần gũi vói thiên nhiên ngày
càng được ưa chuộng. Thị trường đồ uống không ngừng gia tăng sản lượng và
được đa dạng hóa sản phấm, trong đó dòng sản phấm lên men đang dần chiếm
ưu thế. Đối với người Việt Nam, trà đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi.
Uống trà không những là thói quen trong đời sống, mà đã trở thành một nhã
thú hưởng thụ tinh thần, uống trà không chỉ đế giải khát mà còn có khả năng
phòng trị bệnh tật, nâng cao sức khoẻ, kéo dài tuôi thọ cho con người. Trên
thị trường đã có nhiều loại thức uống được chế biến từ trà nhưng sản phấm trà
lên men thì hầu như còn rất mới mẻ đối với thị trường tiêu dùng Việt Nam.
Trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng và phố biến ở các nước
Đông Âu và các nước khác, nó được biết đến như một loại thực phẩm có lợi
cho sức khỏe. Ở nước ta, loại trà lên men này đã được sản xuất nhỏ lẻ trong
một số hộ gia đình. Sản phấm trà lên men kombucha được sử dụng ngay sau
khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trước khi dùng. Điều này gây hạn chế thời
gian, điều kiện bảo quản và khả năng tiêu thụ sản phấm.
Hiểu biết hóa sinh đầy đủ của các thành phần chất chuyển hóa
kombucha vẫn còn bí ấn và chưa được làm sáng tỏ[39]. Các nghiên cứu về vi
sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha thực sự là một tập
họp cộng sinh của nấm men và vi khuấn acid acetic [27], [33], [44]. Các vi

5

oxydans [24], [35]. Nhiều họp chất quan trọng đối với việc bảo vệ sức khỏe
con người, được sản xuất trong quá trình lên men của kombucha cộng sinh:
một loạt các axit hữu cơ như glucuronic, gluconic, lactic, acetic, axit sưccinic,
butyric, axit malic và usnic; vitamin, đặc biệt là nhóm B và vitamin c, axit
amin tự do và các enzyme hoạt động khác nhau. GlcUA được coi là một trong
nhũng họp chất quan trọng được tìm thấy trong kombucha giải khát do tác
động giải độc của nó và ảnh hưởng tới sức khỏe [29], [37], nó ngăn ngừa
bệnh tim mạch, các bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính thoái hóa và ung thư
[22], [44].
Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự
lên men cộng sinh của vi khuấn và nấm men, “con nấm” này được các nhà
khoa học phân loại như là biofilm (màng sinh học - là một tố họp vi sinh vật
trong đó các tế bào kết dính lại với nhau thành một cấu trúc trên bề mặt và
sinh ra các ngoại cao phân tử EPS - Extracellular Polymeric substance). Con
nấm có hình dạng giống bình chứa nó, bề dày thì phụ thuộc vào thời gian nuôi
cấy và độ pH của môi trường.
Nồng độ acid và rưọu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc
trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Ket quả là kombucha có thể tương
đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường. Các vi khuấn và nấm men trong
kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [26].
Trong quá trình làm cấn thận đế tránh cho trà không bị nhiễm các loại
nấm mốc gây độc cho cơ thể. Các yếu tố đế đảm bảo an toàn cho việc lên
men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích họp, pH thấp.


6

A
A
A
A
A
Increas
ing
acidity
A
A
A
A
A
A
A
A
Neutra
l
V
V
V
V
V
V
V
V
Increas
ing
alkalini
ty

V
V
V
V

pH
■
3
4
5
6
7
3

9
10

Sulíuric Acid (Battery
Acid)
(H2S04)
stomach Acid
Carbonated
kombucha! 15 - 2.5 Beverages
Orange Juice
Beer
Coffee
Pure Rain Egg yblks
Milk
Freshly Distilled Water, Salivá
Blood, Tears

Seawater
Baking Soda (NaHC03)
Milk of Magnesia
(Mg(OH)2)
Household
Ammonia (NH3)
Household Bleach

Hình 1.1. Độ pH của kombucha
Neu quá trình lên men bị nhiễm, có thê nhận thấy bằng mắt thường như
trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dương hoặc màu
đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thế là các loài nấm mốc Aspergillus
parasiticus, Aspergiỉỉus flavus, Penicillium citricum... Các loại nấm mốc trên
sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aílatoxin... đều là các độc tố có khả năng
gây ung thư, khi xuất hiện sẽ làm sản phấm mất giá trị dinh dưỡng và gây mùi
khó chịu.

Hình 1.2. Kombucha bị nhiễm nấm mốc


7

Trà kombucha là một loại thức uống bố dưỡng xa xưa của người dân
Trung Quốc được là trà nấm. Quá trình lên men sản sinh ra nhiều chất có lợi
cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid glucuronic, acid lactic, acid
acetic và vitamin B ( Bl, B2, B3, B5, B6, BI5...), các hợp chất hữu cơ khác
như PABA, acetamidophenol, caíein...
OHCH,
..
HO'»<

D-glucuronic
acid
o
OH

COOH
'°v_
>=0

HO
ỒH
gluoorvol
C-OH
C-0

I1
H-Ộ-OH
I
HO-Ộ-H
o-glucarlc
ac»rJ

H-C-OH
HO-CỊĨ-H
H-C-OH
H-Ọ-OH
ChqOH
ỹiucomc
aciổ
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số họp chất trong trà kombucha

Trà kombucha được sử dụng rộng rãi ở một số nước trên thế giới từ
cách đây khá lâu. Ớ các nước như Nhật, Nga và Pháp trà kombucha được xem
như một bí quyết để có một cuộc sống khỏe mạnh và được sử dụng trong
nhũng bữa ăn hàng ngày. Riêng ở Việt Nam, việc sử dụng trà kombucha vẫn
còn khá mới mẻ nhưng số lượng người dùng ngày càng gia tăng. Đối với lợi
ích của trà kombucha đã có nhiều báo cáo dựa trên quan sát cá nhân sử dụng
sản phấm, tuy nhiên những nghiên cứu về đặc tính của trà kombucha vẫn còn
rất ít và khá mói mẻ với các nhà khoa học. Từ năm 1852, trà kombucha đã
được chú trọng nghiên cứu, chủ yếu là ở Châu Âu. Khoảng thời gian từ năm
1925 đến 1950, một số nghiên cứu y khoa đã xác nhận nhừng tuyên bố truyền
thông về kombucha và báo cáo một số lợi ích của trà kombucha [22].


Trên thế giới đã có một số ít công trình nghiên cứu về trà kombucha,
phần lớn tập trung nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hệ vi
sinh vật, thành phần hóa học và phương pháp lên men... nhưng việc nghiên
cứu tác dụng, dược tính của trà kombucha đối với sức khoe con người vẫn
còn rất hạn chế. Bên cạnh đó, ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nghiên
cứu cụ thế đầy đủ về thành phần và tác dụng của trà kombucha.
1.1.2 Đặc điểm cấu tạo
Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng
Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum...
men:

và nấm

Saccharomycodes ỉudxvỉgỉỉ, Saccharomycodes apiculatus,

Saccharomyces cerevỉsỉae, Schiiosaccharomyces pombe... Ngoài ra còn có
thê có các chủng : Lactobacỉllus, Brettanomyces, Pedỉococcus, Bacterỉum

gluconicum...
Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter
xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter xylinum có
khả năng tạo màng hemicelluĩose khá dày và chắc, tạo màu xanh với thuốc
nhuộm Iod và H2SO4. Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thường
được gọi là “con nấm” hay SCOBY.

Hình 1.4. “ Con nấm” (SCOBY)
Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đưòng, thường
được sử dụng đê lên men dung dịch trà đường. Trong quá trình lên men,


9

kombucha sẽ tạo ra một lóp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng
bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là “nấm con”), tách
biệt với lớp màng ban đầu ( “nấm mẹ”).
Hình dạng và kích thước của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.

Hình 1.5. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và
hình dạng khác nhau
Người ta có thế dùng trà xanh, trà đen, trà ô long, trà kukicha hoặc trà
lipton đế làm môi trường lên men kombucha. Cả trà xanh và trà đen đều có
thế được sử dụng đế lên men, tạo ra mùi vị khác nhau, tuy nhiên, trong môi
trường nước trà xanh, kombucha tạo thành mỏng hơn, nhưng tốc độ tăng
trưởng nhanh hơn trong dịch trà đen.

1.1.3.

Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.3.1.

Vi khuân acetic

Vi khuấn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc). Chúng
phát triển tốt trên bề mặt môi trường, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong phú
trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại thực
phẩm, hoa trái, nước trái cây và các sản phấm lên men tự’ nhiên chứa ethanol
như rượu, bia, giấm tự nhiên... Bên cạnh những mặt có lợi trong lên men như
giấm, vi khuẩn acetic được xem là một trong những nguyên nhân quan trọng
gây hư hởng thực phấm tươi và thực phâm lên men giàu cồn.
Họ vi khuẩn Acetobacteraceae ( Gillis và de ley, 1980) bao gồm:
Chi Acetobacter ( Beijerinck, 1898)


10

Chi Gỉuconobacter ( Asai, 1935)
Chi Acidơmơnas ( Urakami et al., 1989)
Chi Gỉuconacetobacter ( Yamada et al., 1998)
Chi Asaia ( Yamada et ai., 2000)
Chi Koiakỉa ( Lisdiyanti et al., 2002)
Chi Svvacharibacter ( Jojima et al., 2004)
Chi Neoasaỉa ( Yukphan et al.,2006)
Chi Granuỉỉbacter ( Greenberg et al., 2006)
* Các phương pháp truyền thống trong phân loại và định danh họ
Acetobacteriaceae:
Việc phân loại và định danh vi khuấn theo phương pháp truyền thống

chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc điểm hình thái, sinh
lý, dinh dưỡng và đặc điếm sinh thái.

a. Đặc điểm hình thái
Các đặc điếm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuấn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế
bào. Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong
định danh vi khuấn acetic.

b. Đặc điếm sinh thái
Đặc điếm phân bố của vi khuấn acetic thường gắn liền với các nguồn
dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các
nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái
được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể như
Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol;
Granulỉbacter được tìm thấy trong cơ thế người bị u hạch; một số loài có khả
năng cố định đạm thuộc hai giống Acetobacter và Gỉuconacetobacter sống
cộng sinh trong rễ cây họ đậu.


11

c. Đặc điếm sinh lý, sinh hóa
Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid đuợc phân
biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa sau: Oxy hóa acetate tạo C02 và H2Ơ;
phát triến ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thấm thấu và pH khác nhau; phát
triển sinh khối trong các môi truờng chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35%;
KNƠ3 1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid tù’ ethanol; tạo
sắc tố hòa tan trong nước; đồng hóa ammonia trong môi trường chứa Dglucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton từ glcerol; phát triển
trong môi trường không có nicotinic acid; phát triển sinh khối và tạo acid

trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là: D- glucose, D- mamnose,
D-galactose, D- ữuctose, L- sorbose, D- xylose, arabinose, L- arabinose, Dmalnitol, D- sorbitol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose
và ethanol [31], [49].

1.1.3.2.

Nấm men

Te bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ...,
thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 - 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước
trung bình: chiều dài: 9 - 10//m, chiều rộng: 2 - 1 /um. Hình dạng và kích
thước tế bào thay đối, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào
nhân chuấn, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo
chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: thành tế bào, màng sinh chất, chất
nguyên sinh, nhân tế bào và những thành phần khác: không bào, ty thề,
riboxom,...[4]
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy
chồi, phân đôi, sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử.
Phân loại: nấm men chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và
nấm men giả (Fungi ỉmperỷectỉ). Lớp nấm men thật phần lớn dùng trong công


12

nghiệp thuộc lóp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces. Lóp nấm
men giả bao gồm giống Crytococus, Mycoderma, Eandida, Geotrichum,
Rhodotorula.
1.1.33. Vi khuân lactic
Vi khuấn lên men lactic thuộc họ Lactobacterỉum. Đây là những trực

khuấn, cầu khuấn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triến của nó
cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu
đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Quá
trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 -ĩ- 6. Nhiệt độ
thích hợp cho quá trình lên men từ 15 -ỉ- 50°c. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng
nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80°c vi khuẩn lactic bị
tiêu diệt hoàn toàn.

1.1.4.

Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:
* Lên men ethanol


13

ị

Glucose

Glucose — 6 — phosphat
ị Photphoglucoza
isomeraza
Fructose — 6 — phosphat
I izomeraza

Triophosphat
Dihvdro aceton phosphat
Glvceraldehvd — 3 — phosphat
M__________________________
ị Glvceraldehvd
phosphatdehvdrogenaza
Acid — 1,3 — diphosphoglvceric
ị
Acid phosphoenolpyruvic
Acid

ị

I Pyruvat
kinaza
pvruvic
Acid pyruvic

ị Pvruvate —
Aid o d eshvdro g enaza
Ethanol
Hình 1.6. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men
Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí vói sự có mặt của nấm
men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và co2. Quá trình
lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự
có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triến sinh khối), thời kỳ lên men chuyến
đường thành rượu và C02 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh
dường và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học
trong quá trình trao đối chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và C02). Sau

Ethanol
C2H5
OH

CH3COOH ị

„ CH3COOH
14
15

o2 -

môi

Tế bào
Mòi trường
CH3CH0
+ vào
H20trong->tế bào
CH3CH(OH)2
(Hydratđượcacetaldehyde)
khi được
vận chuyển
chất, đường hexose
chuyển hóa
CH3CH(OH)2
02 CH3COOH
+ H20acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
theo chu

trình đường+ phân
để tạo thành
sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone
HjO trong
?H acetaldeide-DH
phosphat
là một aloool-DH
sản'V phấmCH3-CHO
trung gian
chu trình đường
phân, họp chất
CHJ.CHJOH
—►CHa-CH
CHj-COOH
này cóetanolo
thê chuyên
thành glyxerol. TrongOH
môi
trường
pHacetico
acid, glycerol chỉ
PQQ 1hoá
acetaldeide
PQQ
’ acido
được tạo ra với hàm lượng nhở. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng
glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong nhừng
sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.

acid:

Phưong trình tống quát của quá trình lên men trong môi trường pH
7
^
02
2HjO
C6H1206 + 2ADP +2Pi 2C2H5OH + 2C02 + 2ATP
Sự chuyến hóa đưòng hexose thành ethanol và khí C02 diễn ra trong tế

bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đồi năng lượng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và C02 trong tế bào chất sẽ được nấm men
thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phấm phụ và sản phấm lên men khác, những
họp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4
nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este. Trong quá
trình lên men ethanol, nhiều acid hũư cơ được tạo thành (The Moll, 1990).
Một số acid hữu cơ được sinh tống hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình
lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ
chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic,
lactic...
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới
tác dụng của vi khuẩn.
C2H5OH + o2

CH3CHO (Acetaldehyde) + H20


Thành phần

Giá trị

Đon vị

Acetic Acid

2,36

g/1

Glyconic Acid

0,129

Formic Acid

0,109

g/1
17
16
g/1

Oxalic Acid

0,01

g/1

Caffeine

0,065
g/1
Bảng
Thành
kombucha
biến đối
hóa1.1.lý
khác. phần
Bản hóa
chấthọc
là trà
quá
trình chuyến hóa đường thành acid
Vitamin BI
0,74
g/1
lactic nhờ vi sinh vật.
Vitamin B6
0,52
g/1
Phương trình phản ứng:
Vitamin B12
0,84
g/1
C6H1206
CH3CHOHCOOH
+
94kcal
Vitamin c

1,51
g/1
Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phấm acid lactic (lên men
pH
3,2
đồng hình), acid acetic, ethanol, CO? (lên men dị hình) trong dịch lên men còn
xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phấm trung gian
hoặc sản phấm phụ của quá trình lên men. Một số họp chất trong nhóm trên
rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành
nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic.
Phương trình tống quát:
1.1.5.2.CH3CHOHCOOH
Công dụng của kombucha
C6H12O6
+ CH3COOH+ C2H5OH + COOH(CH2)2COOH +
CƠ2 Kombucha đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ
(FDA)
nhận là anacỉd
toànacetỉc
đối với
con acỉd
người
[56], [57]. Việc sử dụng rộng
Glucosechứng
acỉd ỉactic(40%)
ethanol
succỉnỉc
rãi thứcLượng
uống sản
từ kombucha

cứu qua
trong
suốt
phấm phụ đã
tạođược
thànhnghiên
hoàn toàn
phụ nhiều
thuộc tài
vàoliệu
giống
vi sinh
thế
trà dinh
kombucha
(trà kiện
kvass)ngoại
và dạng
vật, kỷ
vàoqua.
môiDạng
trường
dưỡng lỏng
và điều
cảnh,đặc
nói (zoogloea)
chung thì cũng
acid
được
và kết

ban đường
đầu chođãthấy
này succinic
có chứa 20%,
chất
lactic nghiên
thường cún
chiếm
40%quả
lượng
đượctrong
phândịch
hủy,tràacid
trường
kháng
(diệt
khuấn
và kìm10%
hãmvàvi
tác20%.
dụng chống lại một số vi
ethanolsinh
chiếm
10%,
acid axetic
cáckhuẩn)
loại khícógần
Hình 1.7. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic
sinh1.1.5.
vật gây bệnh

và phần
đã được
sử dụng
chodụng
mục của
đíchkombucha
điều trị trong thuốc thú y
Thành
hóa học
và công
* Lên men lactic:
và thuốc
Đầu
thếuống
kỷ XX,
những
nghiên
y học của
Đâycholà người.
một loại
thức
đượcchủ
lên yếu
menlàtrong
dung
dịch cứu
trà đường
bởi
Lên men
lactic

một
trao
đốisốđiều
năng
lượng.
phân
ATP
người
Đức,
chứng
minhlàcókombucha
có tác
dụng
và tủ’
có
ảnh
kombucha.
Kombucha
thế quá
sử trình
dụng
một
loạitiết
tràđường
đế Các
lênruột
men,
nhưng
được hình
thànhchức

trong
trình
chuyển
hóa
cơ dễ
chất
được
vilên
khuẩn
giữ
lại
hưởng
tốt dụng
đến
năng
nói
chung
co thế,
nhưng
cũng
cómen
hiệu
không
sử
được
tràquá
thảo
mộc
vì của
kombucha

bị sẽ
hỏng
khidần
tràquả
có
trong
bàodầu.
để phục
vụ
trình
chất
vàtáo
sinh
trưởng
củathận,
vi
cụ
thểtế
trong
những
họpquá
như
rối trao
loạn
tiêu
hóa,
bón,
trì, sỏi
các
nhiều

tinh
Loạitrường
trà cho
như
Earl
Grey
cóđối
chứa
dầu
thơm
Bergamot,
có sinh
thể
vấn
đề
túi các
mật,sản
tiểu
đường,
cholesterol,
cao xấu.
huyết
xơkhuấn
cứng
động
vật. Ngược
lại,
như
ethanol,
co được

vi
thải
làm
chovềkombucha
bịphẩm
chết
hoặcacid
bị lactic,
ảnh hưởng
Sửáp,dụng
các loại
tràmạch,
khác
đau
nhau
sẽmệt
chomỏira...
loại quả
thứclà uống
với những
hương
vào đầu,
môi
trường
lênnhững
men. Ket
hàm lượng
acid lactic
tích vịlũykhác
trongnhau.

môi
gần
giữa
thập
kỷ,làm
giám
“Họctrường
viện vàhóa
(“Academy of
ỉ.
1.5.1.Vào
Thành
phân
hóa
học
của
kombucha
trường
lên
men
ngày
càng
tăng,
giảmđốc
pH môi
kéohọc”
theo những
Chemists”)
Braunschweig
cấpand

năngCDC
lượng[46], [47],
Theotạinghiên
cứu củaghi
tổnhận
chứcrằng
Thekombucha
Americancung
FDA
tỷ lệ các chất hóa học có trong trà kombucha như sau: