ĐỊNH LƯỢNG ĐổNG THỜI INOSIN, NICOTINAMID và ACID SUCCINIC TRONG THUỐC TIÊM CYTOFLAVlN

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẨN THỊ THANH THÚY

ĐỊNH LƯỢNG ĐổNG THỜI INOSIN, NICOTINAMID VÀ ACID SUCCINIC TRONG
THUỐC TIÊM CYTOFLAVlN® BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAQ HPLC

1. PGS.TS. Thái Duy Thìn


2. DS. Vũ Thị Nguyệt Minh Phòng Vật lý đo lường Viện kiểm
nghiệm thuốc TW

Bộ môn Hóa Dược - Trường ĐH Dược HN Tháng 12/2007 - 05/2008

Người hướng dẫn;

Nơi thực hiện:

HẦ
NỘI, 2008


Thời gian thực hiện:

MỜã&ẤMƠVl

q>ể hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp này, trước hết em xin bày tỏ lòng biết

ơri sâu sắc tới PGS.TS Thái Duy Thìn, TS. Trần Việt Hùng, DS. Vũ Thị Nguyệt Minh
những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian qua
íEm xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Viên Kiểm Nghiệm Thuốc
Trung Ương và toàn thể cán bộ Khoa Vật lý đữ lường-Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung
Ương đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện luận văn.
cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn Ban giấm hiệu, cấc thầy cô
trường Đại học Dược Hà Nội, cấc thầy cô và cán bộ Bộ môn Hóa Dược, Bô môn hóa
phân tích đã dạy dỗ, dìu dắt, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu.
cuối cùng em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở hên động viên và giúp đỡ
em trong thời gian học tập tại trưcmg và hoàn thành tốt nhất khoá ĩuận này
Hà Nôỉ, ngày tháng 05 năm 2008

Trần Thị Thanh Thúy
MỤC LỤC
LÒI CẢM
ĩ -ỉ ƠN MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATP

; Ađênôsin li ĩphusphãl

BP 2005

: British Pharmacopoeia 2005
(Dược điển Anh)

CTPT

: Công thức phân tử

DĐVN m

: Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ 3


GABA

: Gama amino butyric acid

HDL

: High density lipoprotein
(Lipoprotein tỷ trọng cao)

HPLC

:High performance liquid chromatography
( Sắc ký lòng hiệu năng cao)

LDL

: Low density lipoprotein

(Lipoprotein tỷ trọng thấp)

ODS

: Octa decyl Silica gel

PA

: Purity Analysis
(Tinh khiết phân tích)

PTL

: Phân tử lượng

TEA

: Triethylam V n -

TT

: Thuốc thồ

USP 30

The United State Pharmacopoeia 30

( Dược điển Mỹ 30
)
ĐẶT VẤN ĐỂ

■


Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật à các nước cũng phát triển
theo hướng các bệnh lý về ung thư, tim mạch, đột quỵ. Xuất phát từ mô hình bệnh tật đó,
các nhà khoa học Nga đã nghiên cứu và cho ra đời 1 loại thuốc mới có số phát minh; EP
18574Ó3Í24]. CYTOFLAVTN® là chế phẩm thuốc tiêm với sự kết hợp của 4 hoạt chất
là Nicotinamid, Inosin, Acid succinic và Riboflavin với các tác dụng chính:

- Kích thích sự hô hấp của tế bào và sản xuất nâng lượng; tăng sử dụng oxy ở mô
và phục hổi hoạt động của các Enzym chống oxy hóa.

- Hoạt hóa sự tổn® hợp Protein nội bào, tằng cường sử dụng glucose và các acid
béof tái tổng hợp GABA trong noron thần kinh.

- Cải thiện lưu lượng máu não và mạch vành, đẩy mạnh phục hổi ý thức. Với các
tác dụng như trên, CYTOFLAVIN® có vai trò quan trọng dối với
cấc bộnh vể mạch máu não như tai biến mạch máu não, hậu quẫ của đột quỵ, nhiễm độc và giảm
oxy não cấp tính, nhiễm độc mạn tính.
Là một thuốc phát mỉnh» muốn lưu hành tại thị trường Việt Nam,
CYTOFLAVIN® cần được thẩm định để được cấp số đăng ký. Tuy nhiên, trong DĐVN
IU, ƯSP 30, BP 2005 và dược điển của một số nước khác chỉ cố chuyên luận định ỉượng
cho một thành phần (Nicoùnamid và Add succinic),
thậm ehí chưa eó ehuyêA luận định lượng Inosin. Theo tiêu ehuẩn của nhà sần
xuất, Acid succinic, Inosin và Nicotinamid được định lượng bằng phương pháp HPLC
nhưng không đồng thời, Hơn nữa, trong quá trình kiểm nghiệm, các pic ra không ổn định,
hình dạng pic không đẹp, thời gian lưu dài. Do vậy, chung tôi tiến hành nghiên cứu
phương pháp định lượng đồng thơi 3 thành phần: Inosin, Nicotinamid và Acid succinic
trong cùng 1 dạng bào chế

.Ngày nay, khoa học kỹ thuật phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu đưực dưa vào
ứng dụng và mang lại những phương pháp kiểm nghiêm nhanh, đạt độ cHính xác cao.
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những
phương phấp như vậy, được ứng dụng định tính và định lượng rất nhiều loại
thuốc đa thành phần.
Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu “định lượng đồng thời Inosin,
Nicotinamid và Acid succinic trong thuốc tiêm CYTOFLAVIN® bằng phương pháp
HPLC” với mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Inosin.
Nicoiinamỉđ, Acíd succỉnỉc trong thuốc tỉễm CYTÕFLẢVTNr bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao, góp J>hần_tịêu chuẩn hóa cho sản phẩm CYTOFLAVTN®^


ứng dụng phương pháp để định tính, định ỉượng Nicotinamid, Inosin, Acid succinic
trong chế phẩm CYTOPLAVTN® nhằm kiểm nghiệm chất lượng thuốc trước khi đưa
ra thị trường.PHẨN 1: TỔNG QUAN
1:1: NICOTINẤMID

1.1.1. Đại cương [2], [21]
* Công thức:

Ồ
CTPT:
C6H6N20
PTL: 122,1

* Tên khoa học: pyridin - 3 - carboxamid

* Tên khác: Vitamin B3; vitamin pp, Niacinamid
* Tính chất:
Bột Mỉ tinh trắng hoặe tỉnh thể không màu, dễ tan trong nước và
ethanol, lg nicotinamid tan trong khoảng lml nước, l,5ml alcol, lOmí glycerol.
Nhiệt độ nóng chảy: 128°C-r 131°c.
pKa (20°C): 3,3

1.1.2. Tóm tắt một số phươíig pháp định lượng [2], [5], [10], [21]

8
8


* Phiéỡng phấp chuẩn độ ãciẩ - hãsẽ trõng mồi trường kỉìãn [5], [10]: Hoà
tan 0,250g chế phẩm trong 20ml acid acetic khan (TT)t đun nóng
nhẹ nếu cần thiết, thêm 5ml anhyđrid acetic (TT) và chuẩn đô bảng dung dịch acid
percloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể đến màu xanh lam lục.
lrnl dung dịch acid percloric 0,1N tương đương với 12,21mg C6H6N20. Phương phấp
này chỉ sử dụng định lượng nguyên liệu Nicotinamid.
* Phương pháp chuẩn đô oxy hóa khử (đo ỉod) [ 2 ] :
Nìcoũnainĩd tấc dụng với một lưựng dư chính xác (CH3COO)2CLL lạo muổi phức
xanh
.

-12+
Cu2
*

9
9

Lượng Cu2+ dư cho phản ứng hoàn toàn với KI dư để giải phóng Iod:
CuJ'
<dư>

4KI

------V-U212

**-

Ịặ

Lượng Iod giải phóng ra được định lượng bằng natri thiosulíat với chỉ thị hỗ tinh bột tới khi
mất màu.
I2 +

2Na2S203

------► 2NaI +

Na2s406

* Phương pháp đo quang phổ tử ngoại (UV) định lượng Nicotinamid trong viên nén
[5], [10]:
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân
1 lượng bột viên tương ứng với 50,0mg Nicotirmmiđ, chuyển vào tình đinh
mức 100,0ml. Thêm 50ml ethanol 96% lắc trong 15 phút và thêm ethanol 96% tới vạch, trộn
đều, lọc, bỏ 15ml dịch lọc dầu. Pha loãng 5,0ml dịch lọc thành 100,0ml với ethanol 96% và

đo độ hấp thụ của dung dịch à bước sóng cực đại 262nm. Tính hàm lượng QH*N20 theo
A'\m, lấy A1%lcm = 241.
Phương pháp này chỉ sử dung định lượng Nicotinamid trong thuốc đơn thành
phần.

* Phương pháp HPLC [21J
Pha động: Dung dịch Natn l-heptansulfonat 0,005M và Methanol (70:30)
Cột packingLl (C18)
Detector ƯV đặt ở bước sóng 254nm Tốc độ đồng: 2ml/phúí
Thể tích tiêm: 20 ụỉ

1.1.3. Tác dụng dược lý [1], [6]


Nicotinamid thực hiện một số chức năng sau khi chuyển thành NAD
(Niestinamid ãđêmn đỉRueleatid) vầ NADP (Nieỡtimmìd âdênin dinualẽtid phosphat), đóng vai trò như
các CoE xúc tác phản ứng. Các CoE này tham gia vận chuyển Hydro và diện tử trong các
phản ứng oxy hóa khử. Vì vậy nó có vai trò quan Irọng Irong quá trình chuyển hóa cho!
est.eroỉ, acid béo và tạo năng ỉượng ATP cung cấp cho chuỗi hô hấp tế bào. Khi dùng liều
cao, Niacin có tác dụng làm giảm LDL, tăng HDL gây giãn mạch ngoại vi.
Thiêu Nicõĩiriãmiđ sễ gây rã cấc triệu chứng như chán ăn, suy nhữợc, dễ bị kích
thích, viêm lưỡi, viêm miệng, viêm da, đặc biệt là viêm da vùng hở như mặt, chân, tay. Khi
thiếu nặng sẽ gây ra các triệu chứng đicn hình của bệnh thiếu vitamm pp (bệnh Pellagra) là
viêm da, tiêu chảy, rối loạn thần kinh, tâm thần.

1.2.

INOSIN

1.2.1. Đại cuơng [20], [23]

* Công thức
OH

CIPT: C10H12N4O5
PTL: 268.23

* Tên khoa học; 6,9“DIhydro-9-p-D-ribofuranosyl-lH-purin-6-on

* Tên khấc:
* Tính chất:

HypGXânthin ribogid, hypGxanthosin

Tinh thể dạng phiến hình chữ nhật dài
Tan trong nước


Phổ hấp thụ tù ngoại (UY) trong môi trường acid (pH 6,0) có cực đại hấp thụ Xmax 248,5nm

1.2.2. Tóm tát phương pháp định lượng [15]

* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng kỹ thuật đồng cô' định enrỵm:
Cột: Capceỉl Pak C18 (15cm X 0,4ócm)
Pha động: Đệm phosphat 0,1M (pH=8,0) chứa

7mM natri

1-

hexansulíonat và 0,1 mM acid p-hydroxyphenyl acetic.

Trong pha tĩnh, enzym xúc tác phản ứng chuyểncác hơp chất purin

bị

cố định cùng với aminopropyỉ.
Detector huỳnh quang.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là khoảng 30pg H- 200pg.

1.2.3. Tác đụng được lý [13], [14], [23]
Inosin là sản phẩm thoái hoá của Adenosin thông qua enzym Adenosin
desaminase. Lúc đầu Inosirt được chô là khổng có tác dụng sinh học nhưng gđn đây
người ta đã chứng minh được lằng Inosin có tác dụng điều tiết hệ thống miễn dịch và bảo


vệ hệ thần kinh với cơ chế như sau:
+ Làm tăng quá trình mất hạt nhỏ của tế bào Mast, giảm số lượng tiền chất gây
viêm do đại thực bào, bạch cầu lympho, bạch cầu trung tính sản xuất ra.
+ Giúp tái tạo tế bào trong chứng thiếu máu cục bộ và tái tạo vết thương sau khi
cấy ghép tim bằng cách giảm hoạt hoá quá trình tự miễn.
+ Làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh trong
SUỐI quá trình giảm oxy máu và kích Ihích tái tạo sợi trục thần kinh sau tổn thương.
Ngoài ra, hiên nay Inosin đang trong phase n của quá trình thử nghiệm đối với
bệnh đa xơ cứng (Multiple sclerosis)

1.3.

ACID SUCCINIC

1.3.1. Đậỉ cưỡng ft?], [20], [27]
* Công thức:

o

Ồ
CTPT: C4H604
PTL: i 18.09


* Tên khoa học: Acitl butandìoic
* Tên khác: Acid ethylen succinic, acid amber
* Tính chất:
Tinh thể hình lãng trụ đơn, không mùi, có tính acid khá mạnh.
ỉg tan trong 13ml nước lạnh, lml nước sôi, 18,5ml aỉcol, 6,3ml methanol, 36ml
aceton, 20ml gỉỵcerol, 113ml ether, gần như không tan trong benzen, carbondisulfid,
CC14.
Nhiệt độ nóng chảy: 185°c -ỉ- 187°c
Nhiệt độ sôi: 235°c
pKa— 4,19

* Nguổn gốc: Acid succinic được tìm thấy trong sản phảm chưng cất của hổ
phách. Ngoài ra còn tìm thấy trong các hóa thạch, nấm, địa y...

1.3.2. Tóm tát một số phương pháp định lượng [18], [21]
* Phương pháp chuẩn độ thể tích [21]:
Cân chính xác khoảng 250mg acid succinic hòa tan trong 25mỉ nước đã đuổi khí
C02- Thêm 2 giọt phcnolphtalein và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N (CĐ) cho tới khi đung
dịch có màu hồng bền.
liĩil NaOH Q,.1N tưcmg đương VỚỊ 5,905mg C4H604


.Phương pháp HPLC định lượng đồng thời Fenoldopam và Acid succinic [18]

Pha tĩnh; cột C18 (250x5,4mm; 5|am)
Phả dộng: áệm phòsphaí pH 2,5 - Methanol (80:20) (Đệm pỉiospiiat pH2,5: dung dịch
Natn monophosphat 0,025M, chỉnh pH 2,5 bằng dung dịch H3P04)
Tốc độ đòng: 1 ml/phút
Detecior uv đặt ở 2 bước sóng: 205nm đối với Acid succinic
225nm dối với Fenoldopam
Thể tích tiêm; 20)41

1.3.3. Tác đụng dược lý [16], [ 2 2 ] , [25], [26], [27]

Acid succinic là thành phần chủ yếu cùa chu trình Krebs, CG vai trò cung cấp electron để
tạo ra sản phẩm ỉà acid fumaric và FADH2.[pyrwsie]"- '
ứ "ị* 3
Citric acid '
,
u U,'W o
lSOatf«rj

Ị Suctinyl-CoA Ị ^
F jmafSte
«« a
*> tì

Ỡ


Ö ũ CH}" • ST’ ií »
Hình 1.1: Chu trình Kreb

sAcid succinic giúp giảm dư vị khó chịu khi dùng đồ uống có cồn, gây ra bòi sự thoái hoá
acetaldehyd-

- Àcid succinic có tác dụng giảm đau, chống oxy hoá, phục hồi nãng
lượng tế bào, kích thích sự hồi phục hộ thần kinh, tăng cường khả năng miẽn dịch. Reamberin là 1 chế
phẩm có thành phần chính là acíd succinic có các đặc tính dược lực như sau: giải độc, chống
oxy hoá, chống giảm oxy máu, giảm các gốc Lự do và phục hổi khả nàns hoạt động của lế
bào. Thuốc kích thích các enzym của chu trình Krebs, nâng cao hiệu quả sử dụng acỉd béo và
glucose của tế bào.
= Ngoài m cấc ẽẵter của acid sueeinìe còn tạo điều kiện thuận lợi eho sự
kích thích quá trình sinh tổng hợp tiền Insulin và sự giải phóng Insulin , có hiệu lực như tế
bào p, táng khả rtãng đáp ứng với tác dụng gỉảm Glucose huyết của các chất, bảo vệ tế bào p
khỏi độc tính,

1.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG HỗN HỢP ACID SUCCINIC,
INoSIN VÀ NICOTINAMID [19]
Theo tiêu chuẩn cùa nhà sản xuất, 3 thành phần trên được định lượng như sau:

* Tiến hành định lượng Nicotinamid bằng phương phấp HPLC theo USP 30 (chuyên
luận thuốc tiêm Nicotinamid)

* Tiến hành định lượng đồng thời Inosin và Acid succinic bằng phương pháp HPLC
với chương trinh sắc ký như sau:
Cột phenyỉ-hexyl (250 X 4,6mra, 5fim)
Pha động: dung dịch KH2P04 0,02M trong nước.
Tốc độ dòng: 0,7ml/phút
Detec-tor ƯV đặt ờ 2 bước sóng: 204nin đối với Acid succinic
254nm đối với Inosin

Nhiệt độ: 25°cPha tĩnh (Stationary phase)
Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi CỘT* hay còn gọi là chất mang. Trong
HPLC, pha tĩnh thông dụng nhất là silica-gel dưới dạng hình cầu. Hiện
nãy, cấc VI tiểu phấri cố kích thước 3Jim 4- IGfim, điệri tích bề mặt riêng 50m2/g 500 m2/g
là vật liệu được đùng nhiều nhất để nhồi cột phân tích. Với loại vật liệu này, kỹ thuật nhồi
khố không thích hợp mà phải nhồi cột ướt với dung môi thích hợp dựới áp suất tương đối
cao,

* Điều kiện đối với 1 pha tĩnh:
- Trơ đối với pha dộng và chất phân tích.
- Bển vững với các điều kiện của quá trình sắc ký.
- Các hạt có kích thước tương đối đồng nhất.
- Có khả năng tách chọn lọc 1 hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất
định.

- Cân bằng động học xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Tính chất bề mặt ổn định.
* Chế tạo pha tĩnh: Pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
- Pha tĩnh trên nền silica gel.
- Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm.
- Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
Trong 3 loại trên, pha tĩnh trên nền silica gel có nhiều ưu điểm hơn cả và thường dược sử
dụng.

* Pha tĩnh trên nền silica gel;
■ Silica gel trung tính: dùng ừong sắc ký pha thuận. Trên bề mặt hoạt động của nó có
chứa các nhóm OH phân cực ưa nước, dùng để tách các chất khồng phần cực và ít phân cực.

18
18

Ví dụ: Lichrosarb Si 40, Lichiosorb Si 60, Hypersil, Micropack-Si,.,
Pha động dùng cho loại này là những chất không phân cực hoặc ít phân cực, thường
ỉà các dung ĩĩiôi hữu co đơn hoặc hỗn hợp của vài đung môi hữu cơ không tan trong nước:
benzen, toỉuen, chloroform, hexan, ethyl acetat...
= Silica |ể/ đã ũỉkyỉ hóa: Dùng cho §ắc ký pha đảo dể tấolì cáe ehất không phân cực, ít phân
cực, các chất phân cực ít có khả năng tạo cặp ion. Các nhóm OH hoạt động trên bề mặt đã bị
alkyl hóa, vì vậy nó không còn phàn cực hoặc rất ít phân cực.
Ví dụ: Hypersil ODS, Lichrosorb RP18, Lichrosorb RP8...
Pha động là các chất hữu cơ phân cực: Methanol, acetonitril, nước hoặc hồn hợp cấc
chất trên. Sự tấch của các chất nhổi cột loại nằy cố độ lập lại cao nên được ứng dụng nhiều
hơn loại silica gel trung tính.

- Silica geỉ đã được sulfonic hóa, nitro hóa hoặc amin hóa: đùng cho sắc ký trao đổi
ion để tách các chất có cấu tạo ion như các kim loại và hợp chất của chúng hoặc các chất khỉ
tan vào pha động thì phân ly thành ỉon như acid, base.
+ Nhóm OH trên bề mặt hoạt động được thay thể bang nhổm S03Na, N02Na,
RCOONa có ion Na+ có thể trao đổi với các cation kim loại khác.
Ví dụ: Lichrosorb KAT, HypersỉLCEX...
+ Nhóm OH được thay thế bằng nhóm -NH2, -NH, -NR2, -NR3 có khả năng trao đổi
với các anion khác.
Ví dụ: Lichrosorb_NH2, Lìchrosorb_CN, Nucleosil_5NH2...
Pha động là dung địch nước của các muối chứa chết đệm, chất tạo phức, dung dịch
acid, base hoặc các chất hữu cơ tan trong nước.

1,5.4. Pha động

19
19

- Pha động trong HPLC là dung môi được cho chảy qua cột, tức là pha tĩnh, một cách
liên tục. Pha động có thể là một hay một hỗn hợp các dung môỉ khác nhau trộn lẫn với nhau
theo những tỷ lệ nhất định hoặc có thể là dung dịch muối có chứa các chất đệm, chất tạo
phức.
*Yểu cầu đối với một pha động:

- Trơ đồí với pha Lĩnh: không làm pha tĩnh thay đổi thành phẩn hóa học (với pha
tĩnh thông thường thỉ pH pha động phải đảm bảo 2= Hòa lân được cấc chất phân tích thì mới lỉm giũ được

- Bền theo thời gian: càng bền lâu càng tốt, ít nhất là trong thờỉ gian chạy sắc Jcý
- Cổ độ tinh khiết cao: hóa chất loại PA, đung môi tinh khiết loại HPLC
- Phù hợp với loại deiector sử đụng
- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
= Sẫn eố vầ Mah tế, eho phép thu hồi lại mẫu hay eấe chất phân tích

-

An toàn, càng ít cháy nổ, ít độc càng tốt

• Trong sắc ký phân bô pha đảo

20
20


Pha động là các dung môi phân cực, hay dùng là acetonitril (ACN), methanol
(MeOH), tetrahydrofuran (THF). Pha động thường là hỗn hợp 1 -ỉ- 2 dung môi trên với

nước, thường dùng nhất ià hỗn hợp ACN và nước vì nó có độ nhớt thấp nên có thể sắc kỹ
ở áp suất thấp. Có thể thay đổi độ phán cực của pha động bằng cách cho thêm vào nhũng
tỷ lệ nước nhất đinh. Ngoài ra, trong 1 số trường hợp còn cho thêm chất tạo cặp ion để sử
đụng trong sắc ký cặp ion, chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sấc ký...
4 ứng dụng của sắc ký cặp ion

- Nguyên tắc:

Mẫu thử được ion hóa kết hợp với jọn trái dấu đã cho thêm vàọ pha động tạo ra
cặp ion, có thể chiết được bằng pha động; hoặc được pha tĩnh hấp phụ chống lại sự đi
chuyển quá nhanh trong dung môi phân cực để tạo ra sự chia tách hoặc pha động rửa giải
chống lại sự hấp phụ quá mạnh của pha tĩnh phân cực.

- Chất tạo cặp ĩ on:
4- Tạo cặp với các cation: sử dụng các anion như acid alkyl sulfonic; acid pentan
sulfonic, acid hexan sulfonic, acid heptan sulfonic, acid octan sulfonic,

21
21


+ Tạo cặp với các anion: sử dụng các cation như muối tetrabưtylamoni hoặc
đibutylamoni.
Kỹ thuật này dùng để tách các acid và base yếu, ngoài ra còn được áp dụng để tách
hỗn hợp các ìon khác.

1.5.1. Một sô đại lượng đặc trưng trong HPLC

* Hệ §ô phân bố K (Partition coefficient)

- Hệ sô' phân bô' K là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ của nó
trong pha động, thể hiện tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh.

-

Khi nồng

độ chất tan khồng quá
cao thì K ỉà 1 hằng số, phụ thuộc vào bảrì chất cắc phả, chất tan vằ nhiêt độ.

* Thòòl gian lưu iR (Retention time)

22
22


Thòi gian lưu của 1 chất là thời gian cẩn để chất đó di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua
cột sắc ký tới detector và cho pic trên sắc ký đỗ (tính từ khi tỉêm mẫu tới khi xuất hiện đỉnh
của pic trên sắc ký đồ).
hoặc

íjj=/0(l+Ả:)

Trong đo; k’ là hệ số dung lượng
to là thời gian lưu của 1 chất tan không bị lưu giữ, trên thực tế, đó là thời gian
cần thiết để pha động đi ra khỏi hệ thống tính từ lúc bơm mẫu.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếa tố: bản chất chất tan, bản chất, tốc độ pha động,
bản chất của pha tĩnh và trong mộl số Lrường hựp còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong 1 phép phân tích, nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém,
Nêu tR quá lớn (tR>20 phút) thì pic bị doãnỗ và độ lặp lại kém, thời gian phân tích kéo

dài.

* Thể tích lưu VR (Retention volume)

Thể tịch lưu Qua 1 chất tan ỉầ thể tích GÙa lượng pha
động ụ đẩy ra khỏi cột từ lúc bát đầu tiêm mãu thử đến khi xuất hiện đỉnh của
pic trên sắc đồ.
VJỈ = tnxF Trong đó: F

23
23


là lưu lượng của pha động

* Hệ sò dung lượng k (Capacity factor)
Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha.
I. Ổ? CỊK „V.Ị
k'=-^- =

„ tR~t0 tg ,

* f

=K—

hoãc

*'= ——— = —-1

ocVV

t
ị-MrM

rM

t
t0

*0

Trong đó: Qs, QM là luợng chất tan trong pha tinh và pha động.
vs, VM lã thể tích của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Nếu k’ quá nhỏ thì quá trình rửa giải diễn ra quấ nhanh, chất cần tách bị rửa giải
ở thời điểm gđn với thòi điểm bơm mẫu. Do vậy khả nâng tách không tốt. Nếu k’ quá lớn
thi thời gian phân tích kéo dài (tR lốn), đỉnh giãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp. Tri số tối
ưu: 1 <

5

* Độ chọn lọc a (Selectivity factor)
Đô chọn lọc cho biết hiệu quả tách cùa hệ thống sắc ký nó biểu thị mức độ tách.
a = ẼẠ=hiZỈL
L-' t

24
24

(k,

A

>k,,


Ẹ JtB

a càng khác 1 nhiều thì khả năng tách càng rõ, tối ưu là 1,05 4* 2,0. Nếu a quá lớn thì
thời gian phân tích dài.

* Hiệu lực của cột (Column efficiency)

25
25