Định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



VŨ THỊ QUỲNH

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI
ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


VŨ THỊ QUỲNH

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALCI
ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Đặng Thị Ngọc Lan
2. DS. Phạm Lê Minh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất




HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích – Độc
chất, trường Đại học Dược Hà Nội với sự hướng dẫn và chỉ bảo và giúp đỡ
tận tình của ThS. Đặng Thị Ngọc Lan và DS. Phạm Lê Minh cùng các thầy
cô trong bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới hai thầy cô đã trực
tiếp hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn, dìu dắt chỉ
bảo tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt
nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu vì
đã luôn giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu trong suốt thời
gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các kĩ thuật viên bộ
môn Hóa phân tích – Độc chất đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành
khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban giám hiệu, phòng đào tạo
nhà trường và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian
ngồi trên ghế nhà trường.
Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã
động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong thời gian tôi
thực hiện đề tài này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên



Vũ Thị Quỳnh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… 1
Chương 1. TỔNG QUAN …………………………………………………………. 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU……………………………………. 2
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin …………………………………………… 2
1.1.1.1. Tính chất ………………………………………………………………… 2
1.1.1.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………… 2
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm ……… 3
1.1.2. Tổng quan về simvastatin …………………………………………………… 4
1.1.2.1. Tính chất ………………………………………………………………… 4
1.1.2.2. Tác dụng dược lý ………………………………………………………… 5
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm ……………. 5
1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và simvastatin 6

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 7
1.2.1. Khái niệm HPLC ………………………………………………………… 7
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ………………………………………… 7
1.2.3. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ………………………………………………. 8
1.2.4. Các thông số đặc trưng trong HPLC ……………………………………… 9
1.2.4.1. Hệ số phân bố K ………………………………………………………… 9
1.2.4.2. Thời gian lưu t
R
………………………………………………………… 9
1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’ …………………………………………………… 10
1.2.4.4. Hệ số chọn lọc α …………………………………………………………. 10
1.2.4.5. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký …………… …………. 10
1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết N ……………………………………………………… 11
1.2.4.7. Độ phân giải R
S
………………………………………………………… 11
1.2.5. Ứng dụng của HPLC ………………………………………………………. 11


1.2.5.1. Định tính ………………………………………………………………… 11
1.2.5.2. Định lượng ………………………………………………………………. 12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………… … 14
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ ………… 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu …………………………………………………… 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ………………………………………………… … 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU …………………………………………… … 15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………………………………… 16
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 16
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc …………………………………………. 16
2.3.3. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký ………………………….…………. 16

2.3.4. Thẩm định phương pháp ………………………………………………… 17
2.3.4.1. Tính tương thích hệ thống ……………………………………………… 17
2.3.4.2. Tính đặc hiệu / chọn lọc …………………………………………………. 17
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn ……………………………… ……… 18
2.3.4.4. Độ lặp ……………………………………………………………………. 18
2.3.4.5. Độ đúng ………………………………………………… ……………… 19
2.3.4.6. Phương pháp xử lý kết quả ………………………………………………. 19
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………… 21
3.1. XỬ LÝ VÀ CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU ……………………… …… 21
3.1.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử ………………………………………………… 21
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu ………………………………………. 21
3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ……………………… 22
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký ……………………………………………………… 22
3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ………………………………………… 22
3.2.3. Lựa chọn pha động ………………………………………………………… 23
3.2.4. Tỉ lệ pha động và tốc độ dòng …………………………………………… 25
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP …………………………………………… 26
3.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống ………………………………… …… 26


3.3.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp …………………………….……. 28
3.3.3. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính ………………………………………. 28
3.3.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp ……………………………………… 30
3.3.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp ……………………………………… 31
3.4. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CALCI ATORVASTATIN VÀ SIMVASTATIN
TRONG CHẾ PHẨM ………………………………………………………… 33
3.5. BÀN LUẬN …………………………………………………………………. 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………………… 37
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………. 37
ĐỀ XUẤT …………………………………………………………………… … 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4














DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ
1 ASEAN Association of Southeast Asian Nations
2 HPLC High performance liquid chromatography
3 DMSO Dimethyl sulfoxid
4 FDA Food and Drug Administration
5 DĐVN Dược điển Việt Nam
6 VN Việt Nam
7 LSX Lô sản xuất
8 HSD Hạn sử dụng
9 NSX Ngày sản xuất

10 SĐK Số đăng kí
11 KNTTW Kiểm nghiệm thuốc trung ương
12 SKS Số kiểm soát
13 CYP3A4 Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4

14 HDL High-density lipoprotein
15 LDL Low-density lipoprotein
16 dd Dung dịch
17 SIM Simvastatin
18 CA Calci atorvastatin
19 NXB Nhà xuất bản








DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Ký hiệu Tên bảng Trang
1 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát pH đệm 24
2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động và tốc độ dòng 25
3 Bảng 3.3 Tính tương thích hệ thống 27
4 Bảng 3.4
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
simvastatin
29
5 Bảng 3.5
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của calci

atorvastin
30
6 Bảng 3.6
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
đối với calci atorvastatin và simvastatin
31
7 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 32
8 Bảng 3.8
Kết quả định lượng một số chế phẩm có calci
atorvastatin, simvastatin
34













DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
STT Ký hiệu Tên hình Trang
1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo calci atorvastatin 2
2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo simvastatin

4

3 Hình 3.1
Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn của mẫu
simvastatin (a) và của mẫu calci atorvastatin (b)
22
4 Hình 3.2
Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép tại hai bước sóng 238 nm
và 246 nm
23
5 Hình 3.3
Sắc ký đồ mẫu khảo sát lựa chọn pha động với đệm
pH 4,5 của mẫu simvastatin (a) và mẫu calci
atorvastatin (b)
24
6 Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn kép ở pH 2,5 25
7 Hình 3.5
Sắc ký đồ mẫu chuẩn kép theo chương trình chạy đã
xây dựng
26
8 Hình 3.6
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng
độ và diện tích pic của simvastatin
29
9 Hình 3.7
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng
độ và diện tích pic của calci atorvastatin
30
10 Hình 3.8
Sắc ký đồ định lượng một số chế phẩm với mẫu
chuẩn kép (a), mẫu thử của chế phẩm Simvastatin
(b) và mẫu thử của chế phẩm Atostin (c)

35




- 1 -

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ở các nước trên thế giới
ngày càng đa dạng và phức tạp, tỉ lệ những người mắc các bệnh tim mạch, tiểu
đường, ung thư… ngày càng cao dần thay thế cho các bệnh nhiễm trùng trước đây.
Điều này là do sự thay đổi của khí hậu, thói quen sinh hoạt khi đời sống đang ngày
càng nâng cao. Việt Nam cũng không nằm ngoài quy luật này. Trước đây, mô hình
bệnh tật ở Việt Nam chủ yếu là các bệnh nhiễm trùng thì nay mô hình bệnh tật đã
hoàn toàn thay đổi: chỉ có 27% là các bệnh do vi trùng gây nên, có đến 62% các
bệnh không phải do vi trùng (các bệnh lây nhiễm do siêu vi trùng) như: huyết áp,
tâm thần, tim mạch, suy dinh dưỡng, tiểu đường còn lại 11% loại bệnh do tai nạn
thương tích [4].
Theo số liệu của Cục Quản lý Dược, nguyên nhân gây tử vong chính ở Việt Nam
hiện nay thuộc về nhóm bệnh tim mạch (13%) [4]. Trong đó phải nói đến các bệnh
xơ vữa động mạch, với các biểu hiện lâm sàng như suy mạch vành, đột tử, nhồi máu
cơ tim, nhồi máu não Nguyên nhân chủ yếu là do các rối loạn lipid máu. Calci
atorvastatin và simvastatin là một trong những thuốc hạ lipid máu được sử dụng
nhiều hiện nay. Tuy nhiên, trong các tài liệu trong nước như DĐVN IV và một số
tài liệu nước ngoài chúng tôi tham khảo [3, 12, 15, 16, 17, 23], chưa có nhiều
phương pháp chuẩn để định lượng hai chất này cũng như các statin khác hoặc quy
trình còn phức tạp. Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng các statin
này là hết sức cần thiết.
Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời calci
atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

với hai mục tiêu cụ thể sau:
 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời calci atorvastatin và
simvastatin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
 Ứng dụng định lượng calci atorvastatin và simvastatin trong chế phẩm bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao

- 2 -

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU
1.1.1. Tổng quan về calci atorvastatin
1.1.1.1. Tính chất
a. Công thức cấu tạo [5, 23]
Calci atorvastatin là một thuốc trong nhóm statin, thuộc dẫn chất acid heptanoic
(không đóng vòng δ-lacton). Thuốc có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo calci atorvastatin
Công thức phân tử: C
66
H
68
CaF
2
N
4
O
10

Phân tử lượng: 1155,34
Tên khoa học: Calcium (β R, δ R)-2-(p-fluorophenyl)-β, δ-dihydroxy-5-

isopropyl-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)pyrrole-1-heptanoate (1:2), trihydrate
[344423-98-9]. Anhydrous [134523-03-8]
b. Tính chất vật lý [16, 21, 23]
Calci atorvastatin có dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng nhạt. Tan nhiều trong
methanol, hơi tan trong rượu, không tan đến ít tan trong nước cất, đệm phosphat pH
7,4 và trong acetonitril
Hấp thụ UV với các cực đại hấp thụ ở 194, 224 và 246 nm
Nhiệt độ nóng chảy: 176
o
C – 178
o
C
Góc quay cực:
[

]

- 7,4
o
(C = 1 trong DMSO)
1.1.1.2. Tác dụng dược lý [10, 11]
Calci atorvastatin là một thuốc thuộc nhóm ức chế enzyme khử HMG CoA, hoạt
động bằng cách ức chế cạnh tranh men khử HMG CoA reductase – một enzyme xúc
- 3 -

tác cho phản ứng biến đổi 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG CoA)
thành mevalonate, đây là bước trung gian trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol
tại gan do đó làm giảm lượng cholesterol. Ức chế cạnh tranh với enzyme khử HMG
CoA làm giảm tổng hợp cholesterol, tăng biểu hiện của các thụ thể lipoprotein mật
độ thấp (thụ thể LDL) trên tế bào gan, điều này làm tăng hấp thu LDL bởi các tế

bào gan, làm giảm lượng LDL - cholesterol trong máu. Như các statin khác, calci
atorvastatin cũng làm giảm nồng độ triglyceride trong máu và hơi làm tăng lượng
HDL - cholesterol.
Dược động học: Calci atorvastatin hấp thu nhanh sau khi uống, với thời gian xấp
xỉ nồng độ tối đa (T
max
) 1 - 2 giờ. Sinh khả dụng tuyệt đối của thuốc là khoảng
14%, tỉ lệ gắn với protein cao (≥ 98%). Cơ chế chuyển hóa chính của calci
atorvastatin là thông qua cytochrom P450 3A4 hydroxyl để tạo thành ortho và
parahydroxylated hoạt động. Calci atorvastatin chủ yếu đào thải qua gan mật, có ít
hơn 2% thu hồi trong nước tiểu. Thời gian bán thải của thuốc là 14 giờ, hầu như
không có chu kỳ gan ruột.
1.1.1.3. Một số phương pháp định lượng calci atorvastatin trong chế phẩm
 Phương pháp 1 [16]:
- Cột C
18
(25 cm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động:
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1,54 g ammonium dihydrogen orthophosphat
vào 1000 ml nước, điều chỉnh pH về 4,0 bằng acid acetic băng.
+ Dung môi A: hỗn hợp của acetonitril : tetrahydrofuran (92,5 : 7,5)
+ Pha động là hỗn hợp của dung dịch đệm pH 4,0 và dung môi A với tỉ
lệ 50 : 50
- Tốc độ dòng: 2 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 246 nm
 Phương pháp 2 [19]:
- Cột: cột thép không gỉ Waters Symmetry C
18
(250 mm x 4,6 mm, 5 µm)
điều nhiệt cột ở 40
o

C
- 4 -

- Pha động: Dung dịch đệm kali dihydrogen phosphat pH 3,0 : acetonitril
(60 : 40)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 246 nm
 Phương pháp 3 [23]
- Cột: Cột L7 ( 25 cm x 4,6 mm x 5µm), điều nhiệt cột ở 35
o
C
Pha động: chương trình gradient dung môi như sau:
+ Dung môi A: acetonitril : tetrahydrofuran : đệm ammonium acetat pH
5,0 ± 0,1 (21 : 12 : 67)
+ Dung môi B: acetonitril : tetrahydrofuran : đệm ammonium acetat pH
5,0 ± 0,1 (61 : 12 : 27)
Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%)

0 100 0
40 100 0
70 20 80
85 0 100
100 0 100
105 100 0
115 100 0
1.1.2. Tổng quan về simvastatin
1.1.2.1. Tính chất
a. Công thức cấu tạo [6, 22, 23]

Hình 1.2. Công thức cấu tạo simvastatin
- 5 -

Công thức phân tử: C
25
H
38
O
5

Phân tử lượng: 418,57
Tên khoa học: Butanoic acid, 2,2-dimethyl-, 1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-
dimethyl-8-[2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl)ethyl]-1-naphthalenyl
ester, [1S-[1α,3α,7β,8β (2S*,4S*),8aβ]]
b. Tính chất vậtlý [13, 21, 22, 23]
Simvastatin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, ít tan trong nước, tan
nhiều trong ethanol, methanol, DMSO, chloroform.
Góc quay cực:
[

]


+292
o
(C = 0,5% trong acetonitril)
Nhiệt độ nóng chảy: 135
o
C – 138
o
C
Hấp thụ UV: dung dịch trong acetonitril có các cực đại ở 231, 238, 247 nm

1.1.2.2. Tác dụng dược lý [10, 11]
Là một trong các statin như calci atorvastatin, simvastatin cũng hoạt động theo
cơ chế ức chế enzyme khử HMG-CoA (3- Hydroxymethyl- 3- Glutaryl Coenzyme A
reductase inhibitors) ở trong gan. Đây là một enzyme khử cần thiết cho việc sản
sinh cholesterol giai đoạn sớm. Trong máu, simvastatin làm giảm cholesterol toàn
phần và lipoprotein mật độ thấp (LDL) hay cholesterol "xấu" cũng như triglycerid.
Simvastatin cũng làm tăng lipoprotein mật độ cao (HDL) hay cholesterol
"tốt". Tăng mức cholesterol HDL, cũng như làm giảm cholesterol LDL có thể làm
chậm sự phát triển của bệnh động mạch vành.
Dược động học: Simvastatin hấp thụ nhanh sau khi uống, qua chuyển hóa lần
đầu qua gan và có sinh khả dụng tuyệt đối là 5%, nồng độ đỉnh trong huyết tương
đạt được sau 4 giờ. Phân bố chủ yếu đến gan, qua được hàng rào máu não, 95% liên
kết với protein huyết tương. Qua gan, simvastatin được chuyển hóa bới CYP3A4
thành dạng có hoạt tính. Thời gian bán thải của simvastatin là 2 giờ và 1,9 giờ với
simvastatin dạng acid. Thải trừ chủ yếu qua phân (60%) và thận (13%).
1.1.2.3. Một số phương pháp định lượng simvastatin trong chế phẩm
 Phương pháp 1 [12]:
- Cột Hypersil ODS 25 cm x 4.,6 mm, 5 µm, điều nhiệt cột ở 45
o
C
- 6 -

- Pha động: đệm phosphat pH 4,5 : acetonitril (7 : 13)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 238
nm
 Phương pháp 2 [14]:
- Cột: C18-Hypersyl (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động: acetornitril : dung dịch đệm phosphat pH 4,5 : methanol (5 : 3
:1)

- Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl, bước sóng ghi: 230
nm
 Phương pháp 3 [22, 23]:
- Cột L1 4,6 mm x 25 cm, điều nhiệt cột ở 45
o
C
- Pha động: acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH 4,5 (65 : 35)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, bước sóng ghi: 238
nm
1.1.3. Một số phương pháp định lượng đồng thời calci atorvastatin và
simvastatin
 Phương pháp 1 [8]:
Phương pháp: định lượng đồng thời atorvastatin, lovastatin và simvastatin bằng
kỹ thuật sắc ký mixen điện động:
- Dung dịch điện ly nền dinatri tetraborat 15 mM pH 8,0 chứa 50 mM chất hoạt
động bề mặt sodium deoxycholat và 15% methanol
- Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 57 cm, chiều dài hiệu quả
48,5 cm, đường kính trong 50 µm; nhiệt độ cột 30
o
C; điện thế 30 kV. Kiểu tiêm
mẫu 50 mbar x 5 giây. Bước sóng phát hiện 237 nm
- Calci atorvastatin được dùng làm chuẩn nội khi phân tích định lượng cho
simvastatin và lovastatin. Lovastatin dùng làm chuẩn nội khi phân tích định lượng
calci atorvastatin

- 7 -

 Phương pháp 2 [18]:
- Định lượng atorvastatin, simvastatin, lovastatin, pravastatin sử dụng chuẩn nội
là mevastatin:

 Mẫu chiết pha rắn trong nước
 Cột Genesis C18 (2,1 x 50 mm, 3µm)
 Pha động: gradient dung môi của dung môi A (acetonitril + methyl acetat
2 mM + acid acetic 0,1%) và dung môi B (nước + methyl acetat 2 mM +
acid acetic 0,1%)
 Hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ESI
+
MS-MS SRM
- Định lượng atorvastatin, simvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin sử
dụng chuẩn nội là theophyllin:
 Mẫu: chiết từ dịch huyết tương
 Cột: Intersil ODS 3V (4,6 x 250 mm, 5µm)
 Pha động: ammonium acetat 0,01 M pH 5,0 + acetonitril + methanol
 Bước sóng ghi: 238 nm
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Khái niệm HPLC [2]
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại
pha tĩnh sử dụng.
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký [1, 7]
Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động. Pha này có thể là một chất khí,
chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và
không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các
chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác
nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di
chuyển khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở
cho phân tích định tính và định lượng.
- 8 -

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết
định bản chất của quá trình sắc ký. Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố,
hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng
nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố.
1.2.3. Sắc ký phân bố hiệu năng cao [1, 2]
Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của
các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động. Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc
vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
 Pha tĩnh:
Sắc ký lỏng - lỏng: pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt
các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này thường có
đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong
sắc ký điều chế). Pha tĩnh kiểu này có nhược điểm là: bị rửa trôi dần theo dòng pha
động, hiệu lực cột sẽ giảm dần trong quá trình sử dụng.
Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc phục
được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng. Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức
hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol. Tính phân cực
của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết
 Pha động:
Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung
môi. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ
các thành phần dung môi.
Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố
thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân
cực được gọi là sắc ký pha thuận. Dung môi pha động thường là các
hydrocacbon mạch thẳng như: pentan, hexan, heptan… Trong sắc ký pha
thuận các chất không phân cực sẽ được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm
dần theo chiều tăng của độ phân cực của các thành phần trong mẫu thử.
- 9 -

- Sắc ký pha đảo: Hệ pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực gọi là sắc
ký pha đảo. Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm
nghiệm thuốc. Chất càng tan tốt trong dung môi phân cực thì càng được rửa
giải sớm. Dung môi pha động thường là: nước, methanol, acetonitril…Việc
đuổi khí hòa tan trong pha động rất quan trọng trong sắc ký pha đảo.
1.2.4. Các thông số đặc trưng trong HPLC [1, 2, 7]
1.2.4.1. Hệ số phân bố K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:
K =





Trong đó: C
S
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/lit)
C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/lit)
Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan. Trị số K
càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn
hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng
hơn.
1.2.4.2. Thời gian lưu t
R
Thời gian lưu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến

detector. Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định, điều này làm cơ sở cho phép định tính. Thời gian lưu của mỗi chất phụ
thuộc các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- Một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động
Trong một phép phân tích nếu t
R
quá nhỏ thì sự tách kém, nếu t
R
quá lớn thì pic
bị doãng và độ lặp lại của pic rất kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo
nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích
kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà t
R
phụ thuộc.
- 10 -

1.2.4.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A
qua cột. Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lương giữa hai pha:
k’
A
=


.




.

= K
A






Trong đó: V
S
: thể tích pha tĩnh (lít)
V
M
: thể tích pha động (lít)
C
S
: nồng độ mol chất tan trong pha tĩnh (mol/lít)
C
M
: nồng độ mol chất tan trong pha động (mol/lít)
K
A
: hệ số phân bố
1.2.4.4. Hệ số chọn lọc α
Để đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số
chọn lọc α:
α =





=






=

,


,


Với quy ước K
B
>

K
A
nên α luôn lớn hơn 1
Để tách riêng 2 chất thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 ÷ 2. Nếu α quá
lớn thời gian phân tích sẽ dài.
1.2.4.5. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký
Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:

 Hệ số bất đối AF:
AF =



Trong đó: a: Nửa chiều rộng phía trước pic
b: Nửa chiều rộng phía sau pic
(cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao pic)
Giá trị AF càng gần 1, pic càng đối xứng.
 Hệ số kéo đuôi A
S
:
A
S
=



- 11 -

Với a và b đo ở 1/20 chiều cao pic
Nếu A
S
càng lớn hơn 1, pic kéo đuôi càng nhiều, pic càng mất cân đối.
1.2.4.6. Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký
N = 16






= 5,54




/


Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic
W
1/2
: chiểu rộng đo ở nửa chiều cao pic
1.2.4.7. Độ phân giải R
S

R
S
=
.(
,

,
)




=

,.(
,

,
)

/,

/,

Với:
t
R,B
, t
R,A
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)
W
B
, W
A
: độ rộng pic đo ở các đáy pic
W
1/2,B
, W
1/2,A
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Các giá trị trên được tính theo cùng một đơn vị
Độ phân giải R
S
còn được tính theo công thức:

R
S
=
√


×


×







Yêu cầu R
S
> 1, giá trị tối ưu R
S
= 1,5
1.2.5. Ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung, HPLC nói riêng là các kỹ thuật phân tích rất có hiệu quả để
tách và định lượng các hợp chất có cấu trúc hóa học gần như nhau trong một hỗn
hợp. Vì vậy nó được dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc
sinh vật. HPLC có các ứng dụng phổ biến sau:
1.2.5.1. Định tính
Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu (t
R

) của chất phân tích trong cùng điều kiện sắc ký
(pha động, pha tĩnh, nhiệt độ…), những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có
mặt của chất phân tích trong mẫu. Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng
- 12 -

quang phổ thường gặp nhiều khó khăn, do đó sắc ký trong đó có HPLC thường
được dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ.
1.2.5.2. Định lượng
Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic.
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ
của chất tỉ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic.
Các phương pháp định lượng trong HPLC [2]
 Phương pháp chuẩn ngoại
Nguyên tắc: mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều
kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn và mẫu thử sẽ tính được
nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm
hoặc nhiều điểm.
- Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với mẫu thử, tiến
hành sắc ký cả hai mẫu trong cùng điều kiện. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:
C
X
= C
S






Trong đó:

C
X
: nồng độ mẫu thử
C
S
: nồng độ mẫu chuẩn
S
X
(H
X
): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử
S
S
(H
S
): diện tích (chiều cao) của píc mẫu chuẩn
- Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi
tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi
điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao
(H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường
chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
 Phương pháp chuẩn nội
Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của
một chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này
- 13 -

gọi là chuẩn nội. Từ dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao) pic và lượng (hoặc nồng
độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của chất cần
phân tích trong mẫu thử.
Yêu cầu của chất chuẩn nội là:

- Tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích
- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử
- Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất thử
- Không phản ứng với các thành phần trong mẫu thử
- Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm
 Phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn
tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành sắc ký trong cùng
điều kiện.
Nồng độ chưa biết C
X
của mẫu thử được tính theo công thức:
C
X
= S
X

∆
∆

Trong đó: S
X
: diện tích (hoặc chiều cao) của pic mẫu thử
∆C: lượng chất chuẩn thêm vào
∆S: sự chênh lệch diện tích pic (hoặc chiều cao)
 Kỹ thuật thêm đường chuẩn
Nguyên tắc: chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau
và các chất chuẩn với lượng tăng dần. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký trong cùng
điều kiện. Dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích (S) hoặc
chiều cao (H) của pic tổng (thử + chuẩn) với lượng hoặc nồng độ chất chuẩn

thêm vào (∆C). Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành là nồng độ
của chất cần xác định.



- 14 -

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chế phẩm có chứa simvastatin 10mg:
- Viên nén Simvastatin 10mg (STADA - VN), SĐK: VD-7764-09, NSX: 10-
07-2012, HSD: 10-07-2014, LSX: 020712
- Viên nén bao film Winthrop (Sanofi Aventis), SĐK: VD-11615-10, NSX:
09-05-2011, HSD: 09-05-2013, LSX: 010511
Các chế phẩm có chứa calci atorvastatin 10mg:
- Viên nén Lipitad (STADA - VN), SĐK: VD-10728-10, NSX: 27-05-2012,
HSD: 27-05-2015, LSX: 030512
- Viên nén Atostin (Công ty DP Trường Thọ), SĐK: VD-9565-09, NSX: 17-
02-2012, HSD: 17-02-2015, LSX: 121
- Viên nén Hacortin (COHAVINA - XNDP150), SĐK: VD-4592-09, NSX:
30-11-2012, HSD: 30-11-2014, LSX: 28211
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
a. Hóa chất
- Acetonitril, methanol tinh khiết loại dùng cho HPLC (Merck, Đức)
- Chất chuẩn: simvastatin hàm lượng 99,14% (SKS: 0210182.02) và calci
atorvastatin khan hàm lượng 98,77%, độ ẩm 4,98% (SKS: WS. 0208225) do
Viện KNTTW cung cấp
- Natriumdihydrogenphosphat dihydrat (NaH
2

PO
4
.2H
2
O) (Merck, Đức)
- Acid ortho - phosphoric 85% (Merck, Đức)
- Nước cất 2 lần dùng cho HPLC
b. Trang thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 G 1314A kết nối với detector
UV-Vis (Mỹ)
- Cột sắc ký Apollo C18 5u (4,6 x 250 mm, 5µm)
- Máy khuấy từ WiseStir MSH - 20A (Hàn Quốc)
- 15 -

- Máy đo pH Eutech Instrument pH510 (Singapore)
- Autopipet 100 - 1000 µl, 1000 - 5000 µl (Nhật)
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H (Đức)
- Máy li tâm Harmonic Series (Đài Loan)
- Máy hút chân không Vacuubrand Membran (Đức)
- Màng lọc Satorius cellulose acetat 0,4 µm (Đức)
- Cân phân tích Sartorius TE214S có độ chính xác ± 0,1 mg (Đức)
- Bộ màng lọc mẫu 0,20 µm
- Bình định mức dung tích 10 ml, 20 ml, 100 ml
- Pipet thủy tinh chính xác 5 ml, 10 ml
- Ống đong dung tích 100 ml, 500 ml
- Cốc có mỏ dung tích 50 ml, 100 ml, 1000 ml
- Bơm tiêm, vial
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời simvastatin và calci atorvastatin
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Lựa chọn điều kiện sắc ký
 Lựa chọn cột sắc ký
 Lựa chọn pha động và các điều kiện pha động
 Tốc độ dòng, thể tích tiêm
 Lựa chọn bước sóng phát hiện
 Quy trình xử lý mẫu
- Đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng
 Độ thích hợp của hệ thống sắc ký
 Tính chọn lọc
 Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và phần trăm diện tích pic
 Độ lặp lại
 Độ đúng
 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng các chế phẩm đã chọn
- 16 -

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Xử lý và chuẩn bị mẫu thử
 Chuẩn bị dung môi pha mẫu
Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài liệu
tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp.
Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích.
 Xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử
Muốn định lượng được dược chất trong chế phẩm vấn đề đầu tiên cần quan tâm
là có được quy trình xử lý mẫu hợp lý, đảm bảo dược chất được chiết tách hoàn toàn
vào mẫu thử, không bị biến đổi tính chất và không lẫn quá nhiều tạp gây sai lệch
cho kết quả phân tích.
Tham khảo các tài liệu kết hợp với thực nghiệm khảo sát lựa chọn ra quy trình
xử lý mẫu thích hợp. Tiến hành xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử.
2.3.2. Chuẩn bị dung dịch đối chiếu
Để có thể định lượng được dược chất trong các chế phẩm, việc chuẩn bị dung

dịch gốc đối chiếu và các mẫu chuẩn là rất cần thiết, cần được tiến hành đồng thời
với việc chuẩn bị mẫu thử
Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp các tài liệu
tham khảo lựa chọn ra dung môi pha và bảo quản dung dịch chuẩn gốc.
2.3.3. Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký
 Cột sắc ký
Từ các tài liệu tham khảo và điều kiện hiện có, lựa chọn cột sắc ký, phương
pháp sắc ký sử dụng trong quá trình phân tích.
 Bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn calci atorvastatin và dung dịch chuẩn
simvastatin ở một nồng độ thích hợp. Căn cứ phổ đồ thu được, kết hợp các tài liệu
tham khảo và tiến hành khảo sát để lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp.
 Pha động