Bệnh gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K29

SERMINA

BỆNH GUMBORO
VÀ CÁC KỸ THUẬT SINH
HỌC PHÂN TỬ

Sinh viên thực hiện:

Giáo viên hướng dẩn

Trương Minh Dũng

TS. Nguyễn Ngọc Hải

Nguyễn Hồng Phong
Nguyễn Thị Minh Thư
Ngô Thị Thu Ngân

11/2006
-1-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

I. LỜI MỞ ĐẦU
Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức
độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành
khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh. Sinh học phân tử chủ
yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau
trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA,
RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này.
Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã có
nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, tới
sản xuất và đời sống.
Ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe
dọa quá trình phát triển. Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi
nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới.
Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn
đoán, điều trị bệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu.
Ngày 30 tháng 11 năm 2006
Nhóm báo cáo.

-2-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

II.

MỤC LỤC

I.

LỜI MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1

III.

TỔNG QUAN................................................................................................................4

U

III.1.

IV.

Bệnh Gumboro .....................................................................................................4

III.1.1.

Khái niệm........................................................................................................4

III.1.2.

Sơ lược về túi Fabricius ..................................................................................4

III.1.3.

IBDV...............................................................................................................4

III.1.4.

Lịch sử phát hiện .............................................................................................6

III.1.5.

Cơ chế .............................................................................................................7

III.1.6.

Triệu chứng .....................................................................................................8

III.1.7.

Bệnh tích .........................................................................................................9

PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU ....................................................................................12
U

IV.1.

Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang ........................................................................12

IV.1.1.

Nguyên lý và cơ sở phát huỳnh quang ..........................................................12

IV.1.2.

Các phương pháp kháng thể huỳnh quang ....................................................12

IV.2.

Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar gel precipitation test, AGP)......17

IV.3.

RT-PCR ..............................................................................................................19

IV.3.1.

Nguyên tắc ....................................................................................................19

IV.4.

RFLP ..................................................................................................................23

IV.5.

Phản ứng trung hòa virus(Virus neutralization=VN) ........................................26

IV.6.

ELISA .................................................................................................................26

IV.6.1.

Enzyme linked immuno Sorbent assay (Elisa) phát hiện kháng thể:.............26

IV.6.2.

Elisa phát hiện kháng nguyên: antigen capture (AC)-elisa ...........................29

IV.7.

Vaccine...............................................................................................................30

V.

KẾT LUẬN .................................................................................................................32

VI.

TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................33

-3-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

III. TỔNG QUAN
III.1. Bệnh Gumboro
III.1.1.

Khái niệm

Infectious bursal disease (IBD) là một căn bệnh có khả năng lây lan cao
trong đàn gà con. Bệnh được gây ra bởi Infectious bursal disease virus (IBDV).

Bệnh làm suy giảm hệ thống miễn dịch và gây tử vong đối với gà từ 3-6 tuần
tuổi. Một mặt, nó làm gia tăng tính nhạy cảm đối với các bệnh khác; mặt khác,
nó trơ với việc chủng ngừa có hiệu quả. Trong những năm gần đây, nhiều dòng
chủng IBDV (vvIBDV), nguyên nhân chính gây ra sự tử vong đồng loạt trên
gà, đã xuất hiện ở châu Âu, Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi và Trung Đông.
III.1.2.

Sơ lược về túi Fabricius

Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn.
Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và
giống như tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô.
Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa
trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài.
Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó
bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn.
Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi
nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn
nhưng có chứa tương bào.
Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B.
III.1.3.

IBDV

IBDV có dạng hình khối, nhiều gốc cạnh, khích thước: 55-65 nm, phân
tử khối: 2.106 Dalton (Nick, 1976).
IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài.
IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn
riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al.,
-4-

Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp thành
bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein
cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP).
IBDV genome chứa hai mạch, A và B. Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1
(VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase phụ thuộc
RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie &
Azad, 1993; Spies et al., 1987). Polipeptide này hiện diện dưới dạng virus nghỉ
ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một
protein liên kết genome (còn được gọi là VPg). VPg được cố định vào đuôi 5’
của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990).
Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open
reading frame-ORF). ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5,
không cần thiết cho quá trình sao chép virus in vitro nhưng lại quan trọng đối
với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998). ORF
lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110 kDa, tự xác tác phân cắt hình thành 3
loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) và VP4 (28 kDa). VP4, một
loại enzyme protease phân cắt serine-lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham
gia quá trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez,
1999). pVP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối
cùng để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000). VP2
và VP3 là những protein cấu trúc. Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng
nguyên quan trọng và hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993).
Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có loại
serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm.

Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà. Có ít nhất khoảng 6 loại
kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm trung
hòa trong ống nghiệm. Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên
phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử
vong trên gà từ 60-100%. Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa các chủng cổ
điển và biến thể. Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất nhỏ (Mc Ferran và
Cs 1980)
-5-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây. Về phương diện
miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau. Tuy
nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không phát
bệnh.
Sức đề kháng:
IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý hóa và môi trường. Chịu
đựng được pH từ 2-12 (Benton và cs, 1967). Ở 56oC, IBDV tồn tại trong 5h, ở
70oC thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50oC trong 18 tháng độc lực không suy
giảm (Landgraf và cs, 1967).
Trong chất thải, phân, nước tiểu,... IBDV vẫn giữ nguyên tính gây
nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày.
IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5% và
timerosal 1.125% ở 50oC trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin 0.5%
trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng
độ cao, có thể diệt được IBDV.
Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất.

Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng... cũng chứa
virus.
Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lay truyền qua đường tiêu hóa là phổ
biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng. Trong phòng thí nghiệm,
có thể dùng đường mũi và mắt.
Sự lan truyền:
Bệnh có thể truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước
uống, dụng cụ chăn nuôi,...
Bệnh mang tính phức tạp trong đường lây lan do sức chịu đựng của
virus trong môi trường ở nhiệt độ cao, cũng như với một số hóa chất sát trùng.
III.1.4.

Lịch sử phát hiện

Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở
thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con
với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius.
-6-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản
truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống
nhau.
Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà đã
miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius.
Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân

gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận).
Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công
bố.
Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại
Belgium và The Netherlands.
Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious
Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious
Bursal Disease Virus (IBDV).
III.1.5.

Cơ chế

IBDV tấn công chủ yếu vào mô lympho. Tế bào lympho B của túi
Fabricius bị phá hủy. Tế bào lympho T của tuyến Thymus bị tổn thương. Sau 2
ngày xâm nhập vào cơ thể, thấy xuất hiện những biến đổi viêm túi Fabricius.
Đặc biệt đến ngày 3-4 ở túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng
và sự thâm nhiễm của các tế bào viêm đạt ở độ cực đại. Cùng với sự phóng
virus, thân nhiệt cũng tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển ở các nang
(Foliculu) của túi, phá hủy tất cả các mô lympho và cuối cùng sau 5-7 ngày túi
teo nhanh. Những thay đổi suy thoái phát triển ở những nơi tế bào lympho B
hay tụ tập.

-7-


Seminar

III.1.6.

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Triệu chứng

Thể lâm sàng: ở gà từ 3-6 tuần tuổi và có thể trên 10 tuần tuổi. Biểu hiện
đầu tiên là cơ vòng hậu môn luôn co bóp, sốt cao, bỏ ăn và khát nước, sau ỉa
chảy. Phân loãng và có màu trắng, lẫn máu; gà ủ rũ, lông xù, xã cánh, nằm
quẹo rồi chết.
Thể ẩn: thường xảy ra dưới 3 tuần tuổi gây suy giảm miễn dịch. Vì thể
hiện lâm sàng không rõ nên dễ nhầm với các bệnh khác, nhất là bệnh Newcatle.

-8-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

III.1.7.

Bệnh tích

Bệnh tích đại thể:
-Lách sưng.
-Thận sưng, biến đổi màu, ống niệu quản đầy muối urat.
-Xuất huyết từng đám ở cơ ngực, cơ đùi.
-Da chân khô tóp lại (cơ thể bị mất nước do tiêu chảy).
-Dịch niêm mạc tăng.
-Túi Fabricius không ngừng bị biến đổi: Sau 3 ngày nhiễm túi Fabricius
tăng kích thước và trọng lượng do thủy thủng các nang túi. Đến ngày thứ 4
trọng lượng tăng gấp 2-3 lần bình thường, các nang viêm không đều. Dịch nhày

vàng lẫn hồng giữa các nang, có thể có từng đám xuất huyết trong các nang dẫn
đến dịch này chuyển màu vàng đục sánh, đôi khi có kèm bã đậu (fibrin). Có
trường hớp dịch nhày bao quanh cả bên ngoài túi. Đến ngày thứ 5 trọng lượng
túi Fabricius bắt đầu giảm và teo dần, nhưng các nang túi vẫn không đồng đều.
Ngày nhiễm
2-3

Hình thái

Kích thước

Bursa gia tăng nhanh về Bị phù, chất tiết sền sệt màu
kích thước và trọng lượng.

4

Bursa tăng gấp đôi về kích trắng sang màu kem. Những
đốm xuất huyết xuất hiện.

thước và trọng lượng.
5

Bursa trở về trọng lượng Chất tiết, tình trạng phù biến
mất. Bursa có xu hướng hóa

ban đầu
8

vàng. Màu sắc biến đổi từ màu

Bursa teo nhỏ (=!/3 kích nâu.
trọng lượng nguyên thủy)

-9-


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Bệnh tích vi thể:
Có hoại tử của các thành phần tế bào lympho như: ở túi Fabricius, ở van
hồi manh tràng, lách. Các thành phần của tế bào lympho bị phá hủy, nhân tế
bào bị teo rỗng.

- 10 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Trong trường hợp nhẹ: Trong nang có những đám thâm nhiễm lớn của tế
bào viêm ở mô giữa các nang. Ở các nang có những tế bào rỗng tạo thành các
không bào (Vacuolas) hoặc thấy hiện tượng hoại tử của các tế bào cùng những
mảnh vụn của tế bào bị phá hủy, làm thành một khối. Phản ứng viêm nhiễm
không phân biệt rõ. Việc các tế bào bị phá hủy sẽ dẫn đến việc biến mất hoàn
toàn các nang lympho. Tại chỗ của chúng phát triển các tế bào biểu mô ít phân
biệt.
Trong trường hợp cấp tính: Ở tại các mô đệm của các nang thường thấy

đầy hồng cầu trên bề mặt. Ở giữa lớp tế bào thấy xuất hiện những thành phần tế
bào hoàn toàn bị lệch vị trí, do có những mảnh tế bào và dịch nhày màu hồng.
Tóm lại: toàn bộ quá trình là sự nhiễm có mủ và hoại tử với sự xuất hiện
của các không bào.

- 11 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

IV.

PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU

IV.1. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang
Một trong những kỹ thuật đánh dấu được ứng dụng rộng rãi trong
nghiên cứu miễn dịch học là kỹ thuật kháng thể huỳnh quang do Coons đề
xướng năm 1942.
Trong dịch tể học, kỹ thuật kháng thể huỳnh quang dùng để phát hiện
nhanh chóng và phân biệt rõ ràng các tác nhân gây bệnh.
IV.1.1.

Nguyên lý và cơ sở phát huỳnh quang

Nguyên lý: Dùng một chất đánh dấu (chất màu huỳnh quang) gắn vào
kháng thể hoặc kháng nguyên để phát hiện ra kháng nguyên hoặc kháng thể
tương ứng chưa biết ở mức vi thể dưới KHV huỳnh quang.
Cơ sở phát quang: Các nguyên tử của một số chất khi hấp thu các dạng

năng lượng khác nhau (trong đó có ánh sáng) thì thay đổi vị trí, tức bị hưng
phấn, khi trở về trạng thái ban đầu của mình nó tỏ phát ra năng lượng dưới
dạng ánh sáng gọi là sự phát quang. Thời gian phát quang sau khi ngừng tác
dụng của yếu tố hưng phấn không quá 1.10-3s gọi là sự phát huỳnh quang.
Sự phát huỳnh quang của chất được chiếu sáng bởi tia cực tím gọi là
hiện tượng huỳnh quang tiêu phát.
Sự phát sáng xuất hiện trong những chất đặc biệt (chất màu huỳnh
quang), những chất này dùng để đánh dấu vào kháng thể hoặc kháng nguyên
gọi là hiện tượng huỳnh quang thứ phát.
IV.1.2.

Các phương pháp kháng thể huỳnh quang

Phương pháp trực tiếp:
-Nguyên tắc: Kháng thể hoặc kháng nguyên đã được gắn chất huỳnh
quang phản ứng trực tiếp với kháng nguyên hoặc kháng thể đặc biệt trên tiêu
bản.
-Kỹ thuật:
+Gắn kháng nguyên lên lame.

- 12 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

+Cố định kháng nguyên bằng Aceton (ngâm lame trong Aceton đặt ở 20oC/ 20’ hoặc 4oC/ 20’).
+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô.

+Nhỏ Conjugate, để tủ ấm 37oC/ 30’.
+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô-xem kính.
-Kiểm tra sự phát huỳnh quang bằng KHV huỳnh quang:
Chất huỳnh quang được sử dụng là Flourescein Isothyocianate.
+Nếu kháng nguyên và kháng thể tương đồng thì phức hợp không bị rữa
trôi, sẽ phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu dương tính.

+Nếu kháng nguyên và kháng thể không tương đồng thì Conjugate sẽ bị
rữa trôi và do đó không phát sáng dưới KHV huỳnh quamh-mẫu âm tính.

- 13 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

-Ưu điểm: Chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao. Đơn giản hơn các
phương pháp khác.
-Nhược điểm: Trang thiết bị đắt tiền, tốn kém. Muốn kiểm tra loại kháng
nguyên nào thì phải có loại kháng thể huỳnh quang tương ứng đó mà việc sản
xuất các kháng thể huỳnh quang đòi hỏi nhiều thời gian.
Phương pháp gián tiếp:
-Nguyên tắc: Kháng kháng thể gắn huỳnh quang (Conjugate) phản ứng
với kháng nguyên hoặc kháng thể định tìm qua một khâu trung gian là kháng
thể hoặc kháng nguyên tương ứng.
-Các bước tiến hành:
+Gắn kháng nguyên lên lame.
+Cố định kháng nguyên bằng Aceton (ngâm lame trong Aceton đặt ở 20oC/ 20’ hoặc 4oC/ 20’).
+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô.

+Nhỏ huyết thanh chuẩn, để tủ ấm ở 37oC/ 30’.
+ Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô.

+Nhỏ Conjugate, để tủ ấm 37oC/ 30’.
+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô-xem kính.
-Kiểm tra sự phát huỳnh quang bằng KHV huỳnh quang:
Chất huỳnh quang được sử dụng là Flourescein Isothyocianate.
- 14 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

+Nếu kháng nguyên và kháng thể tương đồng thì phức hợp không bị rữa
trôi và gắn với Conjugate sẽ phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu dương
tính.

+Nếu kháng nguyên và kháng thể không tương đồng thì kháng thể sẽ bị
rửa trôi và do đó không gắn được với Conjugate, không phát sáng dưới KHV
huỳnh quang-mẫu âm tính.

-Ưu điểm: Chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao và rất nhạy. Theo
Pressman (1958) thì phương pháp gián tiếp nhạy hơn phương pháp trực tiếp 412 lần.
Chỉ cần một Conjugate của loài thì có thể kiểm tra được nhiều loại
kháng nguyên.
*Để chẩn đoán bệnh Gumboro, ta sử dụng kỹ thuật kháng thể huỳnh
quang gián tiếp (Indirect Flourescent Antibody Test).
-Kháng nguyên: Sử dụng thận của những con gà có triệu chứng, bệnh

tích đặc trưng của bệnh Gumboro.

- 15 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

-Conjugate: Sử dụng Conjugate ở hiệu giá 1/40 (đã được thử hiệu giá
phát quang năm 1992 để vừa đảm bào phản ứng có kết quả vừa đảm bảo tiết
kiệm Conjugate).
-Huyết thanh: Sử dụng huyết thanh chuẩn do Proconco cung cấp và
huyết thanh dương tính tự chế.
Mỗi mẫu gà bệnh được làm 3 tiêu bản. Mỗi tiêu bản chia làm 3 ô, ô thứ
nhất gắn kháng nguyên chuẩn, ô thứ 2 gắn kháng nguyên nghi, ô thứ 3 gắn
kháng nguyên âm tính (-).
Tiêu bản thứ 1 nhỏ huyết thanh chuẩn do hãng Proconco cung cấp. Để
làm đối chứng dương.
Tiêu bản thứ hai nhỏ huyết thanh dương tính tự chế.
Tiêu bản thứ ba nhỏ huyết thanh âm tính tự chế. Để làm đối chứng âm.
-Sơ đồ thí nghiệm:
Huyết thanh chuẩn

Huyết thanh dương tính tự chế

Huyết thanh âm tính

Ghi chú:
1. Kháng nguyên dương tính.

2. Kháng nguyên nghi.
3. Kháng nguyên âm tính.

- 16 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

IV.2. Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar gel
precipitation test, AGP)
2.1 Nguyên lý: Sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên hòa tan và kháng
thể tương ứng xảy ra hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, phức hợp
kháng nguyên-kháng thể đạt được mức độ nhất định thì có sự bảo hòa, lúc này
sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa.
Nếu thiếu hoặc thừa 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra. Sự kết
tủa này biểu hiện bằng chất cặn màu trắng xám trông rất rõ. Sự kết tủa này đòi
hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải.
2.2 Các phản ứng kết tủa trong môi trường thạch agar.
a. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm.
-Nguyên tắc: Đây là phản ứng lợi dụng tính khuếch tán của kháng
nguyên và kháng thể, để chúng gặp nhau và kết hợp với nhau, chổ nào có sự
đồng đều tương ứng giữa kháng nguyên–kháng thể thì sẽ có sự kết tủa.
-Ứng dụng: Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm chủ yếu để
phát hiện kháng nguyên và định lượng kháng nguyên.
- Có 2 phương pháp thực hiện:
+Phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch đơn giản của Oudin
Cho thạch và kháng thể trộn lẩn với nha, rồi cho vào ông nghiệm. Sau
đó cho kháng nguyên vào trên mặt thạch, kháng nguyên sẽ khuếch tán xuống

dưới gặp kháng thể tương ứng, kết tủa sẽ xuất hiện ở vùng mà kháng nguyênkháng thể có tỷ lệ tương ứng
+Phương pháp kết tủa khuếch tán kép của Oúkeyfulthor:
Cho kháng thể vào ống nghiệm, rồi cho thạch vào, sau đó cho kháng
nguyên lên trên thạch. Sẽ có sự khuếch tán lên của kháng thể và khuếch tán
xuống của kháng nguyên, vùng kết tủa sẽ xuất hiện ở chổ kháng nguyên-kháng
thể có tỷ lệ đồng đều tương ứng.
Có thể làm ngược lài là cho kháng nguyên vào trước, rồi đến thạch và
sau cùng là kháng thể. Kết quả tương tự như trên.
b. Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thach trên phiến kính (phương
pháp Ouchterlony).
- 17 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Thực chất là phản ứng kết tủa khuếch tán kép, dễ làm, thông dụng.
Ứng dụng :
+Khảo sát mối quan hệ kháng nguyên, kháng thể.
+Định lượng sơ bộ hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của xúc vật
được gây miển dịch.
-Tiến hành:
+Chuẩn bị vật liệu:
* Agar Difco

1.5g.

* NaCl

8.5g.

* Phenol

0.5ml.

* Nước cất vừa đủ

100ml.

+ Cách làm: Hòa muối và phenol trong nước cất, chỉnh pH=7.5, cho
agar vào đun cách thủy cho tan, lọc qua vải gạc. Sau đó đổ thạch lên lam kính
một lớp dày khoảng 3mm và để lam trong nhiệt độ 4-10oC/10 phút cho thạch
đông lại.
Dùng ống sắt có dường kính 3mm đục lổ, mỗi cụm 7 lổ, một lổ ở giữa
và 6 lổ xung quanh:
* Lỗ giữa cho huyết thanh đã biết.
* Các lỗ xung quanh thì 2 lỗ cho kháng nguyên chuẩn dương ứng với
huyết thanh đã biết để làm đối chứng dương, 2 lỗ tiếp cho kháng nguyên âm
tính để làm đối chứng âm, 2 lỗ còn lại cho kháng nguyên cần chẩn đoán.
Sau đó cho vào tủ ấm 37oC từ 6-24h, đem ra đọc kết quả. Nếu thấy giữa
huyết thanh và kháng nguyên nghi xuất hiện vạch kết tủa giống như huyết
thanh và kháng nguyên chuẩn thì kháng nguyên nghi tương ứng với kháng thể.
Có thể làm ngựơc lại là cho kháng nguyên đã biết vào lỗ giữa, còn các lỗ
còn lại cho huyết thanh.
Vật liệu để chẩn đoán bệnh Gumboro theo phương pháp kết tủa
khuếch tán trên thạch:
Kháng nguyên: Thận, lách, túi fabricius của những con gà có triệu
chứng bệnh, bệnh tích đặc trưng đem nghiền nhỏ pha với dung dịch PBS với tỷ
lệ ½, xử lý kháng sinh, đông tan 3 lần.

- 18 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Huyết thanh: Sử dụng huyết thanh dương tính tự chế.

IV.3. RT-PCR
IV.3.1.

Nguyên tắc

Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta có thể xác định IBDV
một cách nhanh hơn bằng cách phân lập virus. Trong số những phương pháp
sinh học phân tử thường được sử dụng để phát hiện bộ gene, thì phương pháp
RT-PCR được sử dụng khá phổ biến. Phương pháp này có thể phát hiện bộ
gene IBDV mà không cần phải tăng sinh trong môi trường nuôi cấy trước khi
khuyếch đại.
RT-PCR được tiến hành trong 3 bước:
B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu.
B2: thực hiện phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA.
B3: khuyếch đại cDNA thu được bằng PCR.Chọn những mồi
oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus.
Những vùng khác nhau của bộ gen sẽ được khuyếch đại phụ thuộc vào sự định
vị từ những primer được chọn.
Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên ngoài (protein capsid outer).

- 19 -

Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Ly trích acid nucleic:
Trong khi RNA chuỗi đơn rất dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase, thì bộ
gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng sự phân huỷ bởi enzyme RNase.
- 20 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Trong thực tế, những tế bào nhiễm (dương tính với IBDV) chứa các chủng
RNA chuỗi đơn có thể được sử dụng như một mẫu ở bước RT. Sự ly trích RNA
được tiến hành một cách cẩn thận: sử dụng găng tay, những tác nhân không có
RNase và phòng thí nghiệm nhân tạo.
RNA IBDV có thể được ly trích từ những mô nhiễm bằng cách sử dụng
một vài bộ kit có sẵn. Bằng cách khác RNA IBDV có thể được ly trích bằng
cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) và 1mg/ml protein K đối với
700 µl dịch huyền phù virus (như dịch đồng nhất bìu). Ủ ấm khoảng 60 phút ở
370C. Acid nucleic được thu bằng cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly
trích phenol/chloroform ( chú ý: phenol là một chất độc và nên được xử lý và
loại bỏ sau đó). Acid nucleic được thu hoạch từ giai đoạn dịch cuối cùng bằng
việc kết tủa ethanol và được giữ ở trong nước cất không có RNase hoặc dung
dịch đệm bền. RNA pha loãng nước nên được giữ lạnh ở nhiệt độ dưới -200C
cho đến khi sử dụng.

Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription)
Sử dụng mồi PCR “lower” ( bổ sung với mạch dương của bộ gen IBDV)
có thể tổng hợp cDNA từ cả dsRNA IBDV cũng như từ những RNA chuỗi đơn
lấy từ IBDV được lấy từ những tế bào nhiễm.
Hỗn hợp RNA IBDV phải được biến tính trước khi chuyển vào hỗn hợp
phản ứng RT. Thêm 20% (bằng thể tích) dimethylsulphoxide vào dung dịch
RNA IBDV giải lạnh. Đun nóng khoảng 3 phút ở 920C và làm lạnh trên đá;
một phương pháp khác là đun nóng khoảng 5 phút và ủ ấm hỗn hợp tức thì
trong nitơ lỏng. Chuyển thể tích hỗn hợp biến tính vào trong hỗn hợp phản ứng.
Ủ ấm theo sự chỉ dẫn của nhà cung cấp enzyme.
Dung dịch cDNA thu được sau bước RT nên được giữ lạnh ở < -20oC.
Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau khi tổng hợp cDNA có thể là nguyên nhân
gây ra kết quả PCR âm tính giả.
PCR
Enzyme DNA polymerase dùng cho phản ứng PCR nay đã được thương
mại hóa. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- 21 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Cặp mồi U3/L3 được dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV serotype
1 đã được thiết kế:
Upper U3:

5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGCGGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3'

Lower L3:

5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTCGAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3'

Những mồi U3 và L3 là những mồi lai dài 44 nucleotide. Chúng bao
gồm một đầu tận cùng 3’ đặc hiệu IBDV (ở những chỗ nghiêng trong trình tự
chỉ ở trên) bắt cặp tại vị trí nucleotide 657 đến 676 hoặc 1193 đến 1212 của
đoạn IBDV. Đầu tận cùng đặc hiệu IBDV được ghép với đầu tận cùng 5’
không đặc hiệu (loại bôi đen trong trình tự ở trên), sản phẩm PCR được tinh
sạch từ quá trình khuếch đại với cặp mồi U3/L3 thì thuận lợi cho quá giải trình
tự. Trong mồi U3 và L3 có những vị trí cắt giới hạn của enzyme endonuclease
restriction (gạch dưới trong trình tự ở trên), kết quả sản phẩm PCR này có thể
được ứng dụng trong việc tạo dòng. Cặp mồi U3/L3 tạo sản phẩm 743 bp
chúng đặc hiệu cho trình tự IBDV được khuyếch đại.
Sau đó, ta tiến hành bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi một chu
kỳ gồm một bước biến tính, một bước bắt cặp và một bước kéo dài). Đối với
cặp mồi U3/L3, trong một chu kỳ, biến tính ở 950C/30 giây và bắt cặp ở 640C/
45 giây (nhiệt độ biến tính được điều chỉnh thích ứng nếu những mồi khác
được sử dụng). Những thông số đối với bước kéo dài nên được thiết lập theo
lời chỉ dẫn của nhà cung cấp.
Sự phát hiện có thể được tiến hành bằng điện di với sản phẩm PCR và
marker trọng lượng phân tử DNA trong gel agarose 1% nhuộm với ethidium
bromide ( chú ý: EB là độc chất và là tác nhân gây ung thư. Nên xử lý và loại
bỏ sau đó).
Ưu điểm:
Phát hiện nhanh, sớm, lượng mẫu dùng để phát hiện đòi hỏi không
nhiều.
Nhược điểm:
- 22 -

Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Ba bước phản ứng PCR phải được tiến hành đối với từng mẫu cDNA
(tinh sạch, cDNA pha loãng 10-100 fold) để tránh những kết quả âm tính.
Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm và dương.
Việc trì hoãn PCR khoảng một vài tuần sau bước RT có thể gây ra kết
quả PCR âm tính giả

IV.4. RFLP
Những năm gần đây, những kĩ thuật phân tử được sử dụng để kiểm tra
những thay đổi di truyền trên IBDV đã tăng nhanh ( Wu và cộng sự,1992;
Stram và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1997; Akin và cộng sự,
1998). Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm những phương pháp
phân tử để khuếch đại những đoạn đặc trưng của bộ gen IBDV bằng RT/PCR
tiếp sau đó là bằng RFLP (Dybing và Jackwood, 1996; Jackwood và Niselsen,
1997; Jackwood và Sommer, 1997; Ture và cộng sự, 1998). Những nghiên cứu
phân tích chuỗi nucleotide của VP2 giúp ta có thể phân tích được gen mã hoá
cho nhóm kháng nguyên xác định của virus (Schnitzler, 1993). Phân tích
RT/PCR-RFLP đã cho thấy nhạy hơn những phương pháp khác bao gồm ACELISA.. Sử dụng RT/PCR và RFLP cho phép ta xác định được những đặc
trưng kháng nguyên phụ cũng như cho phép phân lập mầm bệnh khác từ virus
vaccine (Lin và cộng sự, 1993; Liu và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood,
1994, 1997; Jackwood và Nielsen, 1997).
Những enzyme cắt giới hạn khác nhau đã được sử dụng cho RFLP của
IBDV như BstNI hoặc EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI hoặc NboI, StuI
HaeIII, TaqI và BspMI, là tất cả hiện nay được sử dụng kết hợp hoặc sử dụng
riêng rẽ ( Jackwood và Jackwood, 1997; Jackwood và Neilsen, 1997;
Dormitorio và cộng sự, 1997; Jackwood và Sommer, 1998, 1999; Banda và

cộng sự, 2001).
RFLP đã thành công trong việc tìm vùng biến đổi của gen VP2 trên
IBDV. RNA của IBDV sau khi được chiết tách và thực hiện phản ứng RT-PCR
sẽ thu được sản phẩm 743bp. Sản phẩm 743bp này còn được gọi là 700+RTPCR. Phân tích RT/PCR-RFLP sản phẩm 743 bp về sự hiện diện và vùng đa
- 23 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

dạng của vị trí cắt giới hạn BstNI hoặc MboI bằng cách so sánh với kích thước
những đoạn giới hạn trong kết quả (jackwood và Sommer, 1997). Những
enzyme cắt giới hạn khác nhau được sử dụng trong RFLP cho IBDV hiện nay
như enzyme BstNI hoặc EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI hoặc NboI, StuI
HaeIII, TaqI và BspMI được sử dụng kết hợp hoặc riêng rẽ ( Jackwood và
Jackwood, 1997; Jackwood và Neilsen, 1997; Dormitorio và cộng sự, 1997;
Jackwood và Sommer, 1998, 1999; Banda và cộng sự, 2001). Giữa chúng,
BstNI và MboI xuất hiện để cung cấp sự nhận biết đúng đắn nhất cho sự phân
lập IBDV ( Jackwood và Sommer, 1998). Jackwood và Sommer (1998) đã báo
cáo 1 vài đáp ứng RFLP đạt được khi sử dụng enzyme BstNI so với enzyme
MboI. Enzyme BstNI ghi nhận 1 trình tự 6 base trong sản phẩm của RT/PCR.
Như vậy, khả năng đạt được của 1 RFLP BstNI mới thấp hơn so với MboI đạt
được bởi vì BstNI chứa trình tự nhận biết 6 base trong đoạn sản phẩm RT/PCR
743 bp so với trình tự nhận bíêt 4 base của MboI (Jackwood và Sommer,
1998). Do lí do này, chúng tôi sử dụng MboI trong phân tích giới hạn để phân
tích đa dạng di truyền giữa các dòng IBDV phân lập.
Một lượng sản phẩm 700+RT-PCR được phân cắt bởi BstNI và 1 lượng
khác được phân cắt bởi MboI. Sau đó profile RFLP của những đoạn giới hạn
BstNI và MboI đuợc xác định sự khác nhau trên gel agarose, tốt nhất là gel

2.5% agarose. Proflie tốt nhất nên được xác định bằng cách nhuộm màu gel với
thuốc nhuộm SYBR.TM. green I.
Những dữ liệu của RFLP đạt được trên sự phân cắt của sản phẩm
RT/PCR trong những dòng vaccine và những dòng trong phòng thí nghiệm cho
biết những dòng có thể đặt vào bên trong 6 nhóm phân tử có liên quan với tính
trạng phụ của kháng thể đã được nhận biết trước đó. Nhóm 1 và 2 chứa đựng
những dòng biến đổi, nhóm 3 và 4 chứa đựng những dòng truyền thống, nhóm
5 bao gồm những giống Lukert/Edgar. Nhóm phân tử 6 chứa đựng giống truyền
thống đặc trưng tìm thấy bên ngoài nước Mỹ.
Kết quả cắt của ezyme cắt giới hạn MboI và BstNI

- 24 -


Seminar

Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Enzyme

Đọan cDNA cắt giới hạn

Nhóm virus

MboI

BstNI

1

229 &b 234

119, 424, 172

2

229 & 403

119, 424, 172

3

229 & 362

119, 172, 154, 139

4

229 & 362

119, 209, 172, 154

5

229 & 480

119, 424, 172

6

229 & 362

119, 424, 172

Sau đó, dữ liệu RFLP từ gà nhiễm bệnh đem so sánh với dữ liệu RFLP
từ những phân loại virus đã thu thập được trước đó trên1 nhóm gà nhiễm bệnh
khác. những phương pháp cho phép không chỉ xác chuẩn đóan được sự hiện
diện của IBDV trên gà , mà còn xác định được đặc trưng kiểu kháng nguyên
phụ của IBVD. Có thể xác định virus từ nhóm kháng nguyên phụ 1,2,3,4,5,6
hay các nhóm khác.
Khi sử dụng RT- PCR tại Elazig, phía đông Thỗ Nhĩ Kỳ, người ta đã
kiểm tra được 40 mẫu dương tính với IBVD trong tổng số 56 mẫu bursa gà thu
được. Sử dụng RFLP với enzyme cắt giới hạn là MboI cho 40 mẫu này người
ta đã thu được kết quả như sau: các đọan dài 349 và 236 được tìm thấy trên cả
40 mẫu IBDV dương tính nhưng đọan 142 chỉ được tìm thấy trên 10 mẫu. Điều
này cho thấy độ đồng nhất di truyền tồn tại trên các chủng virus là rất thấp.

- 25 -