Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA 2 CHẾ PHẨM THUỐC
CHỨA ENZYM

Chủ nhiệm đề tài: TS. ĐOÀN CAO SƠN
Cơ quan chủ trì đề tài:
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Năm 2010


MỤC LỤC
PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI ............................. 1
1. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................................ 1
2. Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu............................................................ 1
3. Kết quả nghiên cứu........................................................................................................... 2
4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu......................................................................................... 3
5.Về cải tiến kỹ thuật............................................................................................................. 5
6. Những đóng góp khác ...................................................................................................... 5
7. Tiến độ thực hiện .............................................................................................................. 6
PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
CẤP BỘ................................................................................................................... 7
1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................... 7
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 7
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 9

2. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ...................................................................... 9
2.1. Enzym bromelain................................................................................................. 9

2.1.1. Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain ........................................ 9
2.1.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học....................................... 10
2.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain ............. 13
2.2. Enzym Trypsin................................................................................................... 13

2.2.1. Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin ............................................ 13
2.2.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học........................................ 14
2.2.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym trypsin................... 18
2.3. Enzym streptokinase.......................................................................................... 18

2.3.1. Cấu trúc và tính chất của enzym streptokinase .................................. 18
2.3.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptokinase 19
2.3.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptokinase ......... 22
2.4. Enzym Streptodornase ...................................................................................... 23

2.4.1. Cấu trúc và tính chất của enzym streptodornase ............................... 23
2.4.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học của enzym streptodornase ... 24
2.4.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym streptodornase....... 25
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................26
3.1. Hóa chất, chất chuẩn, mẫu nghiên cứu............................................................ 26

3.1.1. Chất chuẩn.......................................................................................... 26


3.1.2. Dung môi, hóa chất: ........................................................................... 26
3.1.3. Mẫu dùng để nghiên cứu xây dựng và thẩm định các quy trình ........ 27
3.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 27

3.3. Phương pháp ...................................................................................................... 28

3.3.1. Bromelain............................................................................................ 28
3.3.2. Trypsin ................................................................................................ 28
3.3.3. Streptokinase....................................................................................... 29
3.3.4. Streptodornase .................................................................................... 29
4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................................30
4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm
thuốc chứa bromelain và trypsin............................................................................. 30

4.1.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của bromelain và trypsin .... 30
4.1.2. Thẩm định phươn g pháp xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm
thuốc chứa bromelain và trypsin .................................................................. 34
4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm
thuốc chứa streptokinase và streptodornase .......................................................... 43

4.2.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của streptokinase và
streptodornase .............................................................................................. 43
4.2.2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng để xác định hoạt tính enzym
trong chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase ..................... 50
4.3. Áp dụng các quy trình đã xây dựng để kiểm tra chất lượng của một số chế
phẩm trên thị trường ................................................................................................ 67

4.3.1. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa bromelain và trypsin .... 67
4.3.2. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa Streptokinase và
Streptodornase............................................................................................... 68
4.4. Bàn luận về ý nghĩa thực tiễn của đề tài .......................................................... 69

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................70
5.1. Kết luận............................................................................................................... 70

5.2. Kiến nghị............................................................................................................. 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................72
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng xác định hoạt tính của
bromelain................................................................................................................32
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Tyrosin..............34
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Bromelain.........35
Bảng 4: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Bromelain .............................36
Bảng 5: Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Bromelain...............................37
Bảng 6: Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Bromelain .........................38
Bảng 7: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Trypsin..............39
Bảng 8: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Trypsin trên viên Brolasin...40
Bảng 9: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Trypsin trên viên Kimoral-S41
Bảng 10: Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Trypsin..................................41
Bảng 11: Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Trypsin............................42
Bảng 12: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase
bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose...............50
Bảng 13: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase
bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose...............51
Bảng 14: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase
bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose...............52
Bảng 15: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptokinase bằng
phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose ........................53
Bảng 16: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose ........................54
Bảng 17: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng

Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông .....................55
Bảng 18: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase
bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông .............................................56


Bảng 19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo thời gian ly giải khối đông......................................................57
Bảng 20: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo thời gian ly giải khối đông.......................................................58
Bảng 21: Kết quả định lượng Streptokinase của 1 số chế phẩm trên thị trường.............59
Bảng 22: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptodornase 60
Bảng 23: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát
độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase....................................61
Bảng 24: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase.......62
Bảng 25: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát
độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase......................................63
Bảng 26: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase.........64
Bảng 27: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 1 trong thử nghiệm khảo
sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase.......................65
Bảng 28: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 2 trong thử nghiệm khảo
sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase........................66
Bảng 29: Hàm lượng bromelain và trypsin trong một số chế phẩm ..............................67
Bảng 30: Hàm lượng streptokinase và streptodornase trong một số chế phẩm .............68


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng
Tyrosin....................................................................................................................34
Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng
Bromelain...............................................................................................................35

Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và chênh lệch độ hấp thụ trong
định lượng Trypsin................................................................................................40
Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường
kính vòng ly giải....................................................................................................51
Hình 5: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường
kính vòng ly giải....................................................................................................52
Hình 6: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit của nồng độ và logarit của đường
kính vòng ly giải....................................................................................................53
Hình 7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ và logarit thời gian ly giải
khối đông trong định lượng streptokinase ..........................................................55
Hình 8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ và logarit thời gian ly giải
khối đông trong định lượng Streptokinase..........................................................56
Hình 9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và hệ số giảm độ nhớt trong
định lượng streptodornase ....................................................................................60
Hình 10: Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn độ giảm độ nhớt theo thời gian của dung
dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng
streptodornase........................................................................................................61
Hình 11: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch
chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng
streptodornase ......................................................................................................63
Hình 12: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch chuẩn
2 trong thử nghiệm khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng
streptodornase........................................................................................................66


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
KDa

: Kilo Dalton

SK

: Streptokinase

Arg

: Arginin

Val

: Valin

Asp

: Asparagin

Lys

: Lysin

Leu

: Leucin

Plgn

: Plasminogen

Pm

: Plasmin

RSD
TB

: Độ lệch chuẩn tương đối
: Trung bình


PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI
1. Mục đích nghiên cứu:
- Xây dựng

phương pháp xác định hoạt tính của các enzym: Bromelain,

Trypsin, Streptokinase và Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzym
Bromelain, Trypsin và chế phẩm hỗn hợp Streptokinase, Streptodornase.
- Áp dụng phương pháp xác đinh hoạt tính của các enzym Bromelain, Trypsin,
Streptokinase và Streptodornase để kiểm tra chất lượng một số thuốc lưu hành trên
thị trường và thẩm định, xét duyệt tiêu chuẩn.

2. Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu:
Đề tài Khoa học - Công nghệ “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt
tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là nghiên cứu đầu tiên được thực hiện một
cách có hệ thống để thiết lập các quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym trong các
chế phẩm chứa hỗn hợp các enzym. Những kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa
thực tiễn cao. Các quy trình xác định hoạt tính được thiết lập trong đề tài này đã
được thẩm định chu đáo để chứng minh về sự phù hợp, độ tin cậy khi áp dụng xác
định hoạt tính từng thành phần enzyme trong chế phẩm thuốc chứa hỗn hợp 2
enzym, góp phần nâng cao khả năng kỹ thuật của hệ thống kiểm nghiệm giám sát

chất lượng thuốc.
Các phương pháp định lượng được xây dựng hướng tới phù hợp về mặt kỹ thuật
với điều kiện trang thiết bị hiện tại của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các
cơ sở thuộc hệ thống kiểm nghiệm thuốc nói chung. Trong một số trường hợp, do
chưa có phương pháp phù hợp, sau quá trình khảo sát sơ bộ, nhóm nghiên cứu đã
phải tiến hành cải tiến các điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu thuốc
cần kiểm tra cũng như điều kiện trang thiết bị hiện có.
Cụ thể, trong số 4 phương pháp xác định hoạt tính của 4 enzym thì chỉ có 2
phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym là Streptokinase (BP và CP) và
Trypsin (USP) là có sẵn trong các dược điển ở chuyên luận thuộc về các nguyên
liệu. Còn phương pháp xác định hoạt tính của Bromelain chưa có trong dược điển

1


và Streptodornase chỉ có trong chuyên luận Streptokinase nguyên liệu và giới hạn
Streptodornase, vì vậy nhóm nghiên cứu đã thực hiện các bước sau:
1- Tham khảo các tài liệu để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của
enzym Bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin.
2- Tham khảo tài liệu USP để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin
trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin.
3- Tham khảo tài liệu BP 2003 và CP 2005 và các nguồn tài liệu khác để xây
dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Streptokinase trong chế phẩm
chứa hỗn hợp Streptokinase và Streptodornase.
4- Tham khảo các tài liệu hiện có để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính
của enzym Streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp Streptokinase và
Streptodornase.
5- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Bromelain và
Trypsin đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym
này có trên thị trường.

6- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Streptokinase và
Streptodornase đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2
enzym này có trên thị trường.

3. Kết quả nghiên cứu:
- Đã thiết lập được 4 quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym để định lượng
hoạt tính của các enzym trong 2 chế phẩm hỗn hợp là chế phẩm chứa hỗn hợp gồm
2 enzym Bromelain và Trypsin và chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym Streptokinase
và Streptodornase đạt các yêu cầu:
• Khoảng tuyến tính và hệ số tương quan.
• Độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu.
• Phù hợp với điều kiện trang thiết bị, hóa chất của Viện Kiểm nghiệm
thuốc trung ương..
- Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Bromelain và
Trypsin của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này.

2


- Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Streptokinase và
Streptodornase của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này.
.- Đã hoàn thiện được nội dung 4 bài báo khoa học, trong đó:
1/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Bromelain trong chế phẩm hỗn
hợp chứa Bromelain và trypsin. (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 2/2010).
2/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính enzym Streptokinase trong chế
phẩm hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly
giải. (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 3/2010).
2 bài báo còn lại đã được chuẩn bị hoàn tất về nội dung, nhóm nghiên cứu sẽ gửi
đăng vào tháng 10/2010, cụ thể gồm các bài báo sau đây:
3/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin trong chế phẩm hỗn hợp

chứa Bromelain và trypsin.
4/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase trong chế phẩm
hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase.

4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu:
- 4 quy trình định lượng xác định hoạt tính của 4 enzym Bromelain, Trypsin,
Streptokinase và Streptodornase trong 2 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym đã được
xây dựng, thẩm định dựa trên đối tượng nghiên cứu là các sản phẩm đang lưu hành
trên thị trường Việt Nam. Những quy trình này đã được chứng minh tính khả thi
trong điều kiện cơ sở vật chất của nước ta, trên đúng đối tượng áp dụng là các chế
phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym, do đó đây là những giải pháp kỹ thuật có ý nghĩa ứng
dụng thực tiễn cao trong kiểm tra giám sát chất lượng thuốc chứa các hoạt chất
enzym tại Việt Nam.
- Trong quá trình thực hiện đề tài, qua những kết quả thực nghiệm, chúng tôi có
một số nhận xét về tính mới sau:
a) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Bromelain trong chế
phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp
với phương pháp quang phổ UV-VIS.

3


- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym trypsin đến phương
pháp xác định hoạt tính của bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này.
Kết quả trypsin không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của
bromelain.
b) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Trypsin trong chế phẩm
hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp

với phương pháp đo quang động học.
- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym bromelain đến phương
pháp xác định hoạt tính của trypsin trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này. Kết
quả bromelain không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của trypsin.
c) Xây dựng phương p háp xác định hoạt tính của enzyme Streptokinase trong chế
phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp
với phương pháp đo thời gian ly giải khối đông và phương pháp đo đường kính
vòng ly giải fibrin trong agarose.
- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptodornase đến
phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa
hỗn hợp 2 enzyme này. Kết quả streptodornase không ảnh hưởng đến phương pháp
xác định hoạt tính của streptokinase.
d) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Streptodornase trong chế
phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp
với phương pháp đo thời gian giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất AND.
- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptokinase đến
phương pháp xác định hoạt tính của streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2
enzyme này. Kết quả streptokinase không ảnh hưởng đến phương pháp xác định
hoạt tính của streptodornase trên cơ chất ADN.

4


5.Về cải tiến kỹ thuật:
- Cách xác định điểm dừng của phản ứng tiêu fibrin thực nghiệm (trong phương
pháp xác định hoạt tính Streptokinase):
Theo dược diển Anh 2003: phương pháp xác định điểm dừng quan sát bằng mắt,
sử dụng đồng hồ bấm giây. Trên thực tế điểm dừng rất khó quan sát.

Theo dược diển Mỹ (chuyên luận ly giải fibrin của Alteplase bằng cách xác định
bọt khí) thì cũng rất khó giam giữ bọt khí đồng đều trong các ống nghiệm, hơn nữa trong
quá trình tạo bọt khí có ảnh hưởng lớn đến sự tạo fibrin nên kết quả không ổn định.
Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã cải tiến cách xác định điểm ly giải hoàn toàn fibrin
bằng quan sát sự rơi cận đáy của viên bi chuẩn cho phép xác định chính xác điểm
dừng có độ đúng cao và dễ quan sát.
- Phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase: Sử dụng nhớt kế Oswald với
mao quản thích hợp thay vì thiết bị xác định độ nhớt bằng điện cực Platin có gắn
bơm chân không. Vì thiết bị này chưa có tại Việt Nam và rất đắt tiền, còn nhớt kế
Oswald hiện có tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.

6. Những đóng góp khác:
a) Góp phần đánh giá chất lượng thuốc:
Các thuốc có bản chất là enzym rất đễ bị thay đổi về mặt chất lượng. Hơn nữa
các phương pháp xác định hoạt tính các enzym rất đa dạng, cách biểu thị hoạt tính
enzyme tùy thuộc vào từng cơ sở sản xuất (có thể xác định theo IU hoặc mg hoặc
các đơn vị khác theo qui định). Vì vậy để xây dựng được một phương pháp xác định
hoạt tính của mỗi enzym sẽ góp phần nâng cao năng lực đánh giá chất lượng của
nhóm hoạt chất "khó tính" này, đặc biệt là trên đối tượng chế phẩm phối hợp các
enzym hiện đang lưu hành trên thị trường.
b) Đào tạo:
- Qua quá trình thực hiện đề tài, năng lực kiểm nghiệm, đặc biệt là kiểm
nghiệm enzym của các cán bộ tham gia nghiên cứu được cập nhật và nâng cao. Góp
phần đào tạo các cán bộ thử việc.
- Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu đã kết hợp chặt chẽ với
trường Đại học Dược Hà Nội để gắn kết công tác nghiên cứu với đào tạo nhân lực
cho ngành Dược. Trong khuôn khổ đề tài, các kết quả nghiên cứu thu được đã đăng
ký luận án tốt nghiệp thạc sĩ dược học.

5

7. Tiến độ thực hiện:
a. Tiến độ:
• Đúng tiến độ

X

• Rút ngắn thời gian nghiên cứu
Tổng số thời gian rút ngắn….tháng
• Kéo dài thời gian nghiên cứu
Tổng số tháng kéo dài….tháng
Lý do phải kéo dài…
b. Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra:
X

• Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra
• Thực hiện các mục tiêu đề ra nhưng không hoàn chỉnh
• Chỉ thực hiện được một số mục tiêu đề ra
• Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)
c. Các sản phẩn tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương:
• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương

X

• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương

X

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạt

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả các sản phẩm đều chưa đạt
chất lượng.
• Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng
• Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí thực hiện để tài: 450 triệu đồng.
Trong đó

Kinh phí sự nghiệp khoa học: 450 triệu đồng.
Kinh phí từ nguồn khác:

0 triệu đồng.

Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí của đề tài (chi phí những trang thiết
bị có giá trị trên 3000 USD):

Không

Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán
Chưa thanh quyết toán xong:

Không

Kinh phí tồn đọng:

Không

6

PHẦN B.

NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Enzym là chất xúc tác sinh học, có vai trò quan trọng trong hầu hết các phản
ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống. Trong khoảng 20 năm trở lại đây, enzym đã
thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực như trong
công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y tế chăn nuôi, ... Hiện nay ước tính mỗi năm
có khoảng 300 000 tấn enzym được sản xuất với giá trị thương mại khoảng 1 tỷ
USD, trong số đó chủ yếu là các enzym thủy phân, chiếm tới 75%.
Trong lĩnh vực y tế, các thuốc có bản chất là enzym cũng đã và đang được
nghiên cứu đầy đủ hơn về cấu trúc, cơ chế tác dụng, và những ứng dụng lâm sàng.
Một số thuốc enzym như các thuốc có chứa trypsin, chymotrypsin, bromelain,
Papain, amylase, Streptokinase, Serratiopeptidase... được sử dụng như là thuốc hỗ
trợ trong điều trị một số bệnh liên quan và đã chứng minh được hiệu quả điều trị
của chúng như trong điều trị kháng viêm, chống phù nề trong ngọai khoa, trong điều
trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc mạnh do huyết khối, hỗ trợ trong điều trị ung thư, sử
dụng phối hợp nhằm làm tăng hiệu quả kháng khuẩn của thuốc kháng sinh. Chính
nhờ các hiệu quả điều trị như vậy, nhiều chế phẩm thuốc chứa enzym đã được cấp
số đăng ký cho phép lưu hành tại Việt nam.
Trước đây trên thị trường Việt Nam chỉ có các chế phẩm sử dụng đơn thành
phần streptokinase trong điều trị và chuyên luận streptokinase đã được đưa vào
Dược thư quốc gia. Hiện nay, để tăng hiệu quả điều trị, các chế phẩm thuốc chứa
đồng thời 2 enzym streptokinase và streptodornase đã được nhập vào nước ta trong
những năm gần đây để điều trị chống viêm nói chung và đặc biệt trong hỗ trợ
điều trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc huyết khối. Chế phẩm hỗn hợp trypsin và
bromelain được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa, hỗ trợ điều trị ung thư...

7


Về phương pháp kiểm nghiệm các enzym này, trong các dược điển mới chỉ
có Dược điển Anh quy định chuyên luận nguyên liệu Streptokinase, chưa có
chuyên luận của streptodornase nguyên liệu và các dạng chế phẩm, đặc biệt là chế
phẩm phối hợp gồm streptokinase và streptodornase.
Đối với enzym bromelain và trypsin, trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ
mới có chuyên luận nguyên liệu Trypsin, chưa có chuyên luận về chế phẩm.
Các tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm hiện có trên thị trường vẫn chưa
được thẩm định, đánh giá một cách đầy đủ. Đặc biệt là tiêu chuẩn của chế phẩm hỗn
hợp Streptokinase và streptodornase do các nhà sản xuất cung cấp vẫn chưa thực
hiện được với điều kiện của các cơ sở kiểm nghiệm trong nước do không có trang
thiết bị chuyên dụng.
Từ các lý do trên, việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm này hiện nay
vẫn còn hạn chế, và thực tế là chưa kiểm tra chất lượng các chế phẩm hỗn hợp
Streptokinase và streptodornase. Trong khi đó enzym được coi là loại thuốc sinh
học, có bản chất protein nên rất dễ bị giảm hoạt tính trong các điều kiện bảo quản
không tốt hoặc bị thoái biến theo thời gian nên không có tác dụng điều trị.
Để thực hiện nhiệm vụ này đòi hỏi phải có sự đầu tư nghiên cứu để xây dựng
các phương pháp xác định họat tính của các chế phẩm enzym nhằm áp dụng cho
công tác kiểm tra chất lượng thuốc trong điều kiện hiện có của hệ thống kiểm
nghiệm.
Trong thời gian gần đây, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã tiến hành
nghiên cứu và xây dựng được một số phương pháp, quy trình kiểm tra chất lượng
của một số dạng chế phẩm enzym. Tuy nhiên, do điều kiện kinh phí hạn hẹp, việc
nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở một số chế phẩm enzym đơn thành phẩn và đơn giản.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp
xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là thực sự cần thiết và

hữu ích nhằm nâng cao năng lực kiểm tra, giám sát chất lượng đối với các sản phẩm
thuốc có nguồn gốc sinh học với điều kiện trang thiết bị hiện có của Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương và các Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm trên toàn

8


quốc, đồng thời hỗ trợ cho các phòng kiểm nghiệm của các công ty sản xuất thuốc
trong nuớc trong việc kiểm tra chất lượng các dạng thành phẩm này, góp phần kiểm
soát chất lượng thuốc trên thị trường.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài được thực hiện theo 3 mục tiêu chính sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm kết
hợp 2 enzym bromelain và trypsin.
2. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm
kết hợp 2 enzym streptokinase và streptodornase.
3. Áp dụng các phương pháp để kiểm tra chất lượng một số chế phẩm tương
tự lưu hành trên thị trường.

2. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
2.1. Enzym bromelain
2.1.1. Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain
Enzym bromelain lần đầu tiên được phát hiện bởi nhà hóa học người
Venezuela Viente Marcane vào năm 1891 từ nước ép của quả dứa [18]. Năm 1982,
Chitenden, cộng tác với Joslin và Meara đã đi sâu nghiên cứu đầy đủ hơn và gọi
dịch chiết xuất đó là Bromelain. Sau đó, thuật ngữ Bromelain được dùng để chỉ các
enzym protease từ các thân và quả của họ dứa Bromeliaseae. Bromelain được chỉ
định là thuốc hỗ trợ điều trị một số bệnh vào năm 1957. Những nghiên cứu về
Bromelain lần đầu tiên được tiến hành ở Hawai, nhưng hiện nay, các nước châu Á, châu
Âu và Châu Mỹ la tinh quan tâm đến nghiên cứu Bromelain nhiều hơn, đặc biệt là ở

Đức, Bromelain được sử dụng rộng rãi, đứng thứ 13 trong số các thảo dược.
Năm 1964 Murachi và cộng sự đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzym
Bromelain, kết quả như sau [1]:
. Trọng lượng phân tử:

33200 - 33500 Dalton

. Hằng số lắng:

2,73 S

. Tỷ trọng:

1,346

. Điểm đẳng điện pI:

9,55

9


Bromelain là enzym thuộc nhóm enzyme thiol (Cystein) protease, có khả
năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein thành các đoạn nhỏ. Thành
phần hóa học của Bromelain là một glycoprotein. Mỗi phân tử có chứa 1 chuỗi
oligosaccharid (glycan) gồm 3 manose, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Tùy
theo phương pháp thu nhận mà thành phần acid amin thay đổi khác nhau, trong
khoảng 121 - 144 acid amin. Hơn nữa, Bromelain trong các bộ phận khác nhau của
cây dứa cũng có thành phần hóa học khác nhau như polypeptid của Bromelain thân
có acid amin (đầu -NH2) là valin hoặc glycine, còn Bromelain quả lại có acid amin

(đầu -NH2) là alanine [11].
Hoạt tính của Bromelain biểu thị khác nhau trên những cơ chất khác nhau.
So với protease thực vật khác như papain cho thấy: khả năng phân giải hemoglobin
của Bromelain mạnh gấp 4 lần so với papain, nhưng nếu cơ chất là casein thì hoạt
tính của 2 enzym này tương đương nhau, còn đối với cơ chất tổng hợp thì hoạt tính
của bromelain lại kém hơn. Bromelain có khả năng thủy phân protein, peptid, amid
và các ester của amid và peptid [1].
2.1.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học
Cơ chế tác động của enzym bromelain đã được làm sáng tỏ: các tác giả đều
thừa nhận vai trò của nhóm -SH của cystein và nhóm imidazol trong hoạt động
thủy phân của bromelain. Nhóm -SH tham gia tạo thành acyl-thioester trong gốc
carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết bị cắt). Nhóm Imidazol làm chất trung gian
nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận, giữ vai trò duy trì cấu trúc
không gian của bromelain. Cụ thể, khi dùng casein hoặc hemoglobin là 2 cơ chất tự
nhiên, trước tiên bromelain kết hợp với protein và thủy phân chúng để tạo thành các
oligopeptid và acid amin. Tiếp theo nhóm -SH của enzym khiến nó bị ester hóa rồi
nhóm imidazol sẽ khử ester để giải phóng enzym (Hình 1)

10


Hình 1: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym Bromelain
Cũng giống như các loại chất sinh học khác, Bromelain cũng bị ảnh hưởng
bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, ion kim loại ...Ở điều kiện bảo quản 40C, hoạt tính
sinh học của Bromelain không bị giảm trong khoảng 6 tháng, nhưng nếu ở 550C, pH
6,0 thì hoạt tính có thể bị giảm tới 50% trong vòng 20 phút. Biên độ pH của
Bromelain khá rộng từ 3-10, nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-9. Các
ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelain là do thường gắn vào trung
tâm hoạt động của enzym. Bromelain bị ức chế bởi các ion hoặc những hợp chất có
ái lực mạnh hơn nhóm -SH như iodoacetat, methyl bromid, clo acetophenol, Hg

2+

,

H2O2. Trong khi đó, một số ion kim loại như Zn2+, Fe2+, Ag+, ... lại làm ổn định cấu
trúc phân tử của Bromelain.
Hiện nay, bromelain được sản xuất bằng cách tinh chế từ hỗn hợp chiết xuất
trực tiếp từ cây dứa và thành phẩm tạo ra ở dạng viên nang hoặc viên nén, được
dùng trong điều trị. Ngoài tác dụng tham gia vào quá trình đồng hóa protein trong
thức ăn, Bromelain còn có nhiều tác dụng khác ở ngoài đường tiêu hóa. Trên thực

11


tế, Bromelain được biết đến như là một thuốc kháng viêm tự nhiên và được ứng
dụng ngày càng nhiều trong điều trị như là một thuốc hỗ trợ:
. Trong phẫu thuật hoặc tổn thương:
Bromelain hỗ trợ làm giảm sưng, các vết thâm tím, viêm hoặc đau sau phẫu
thuật hoặc thương tổn, đặc biệt trường hợp bị bỏng, bromelain giúp mau chóng lành
vết thương.
. Trong điều trị viêm xoang:
Bromelain được khuyến cáo như là thuốc điều trị hỗ trợ cho viêm xoang, làm
giảm sự xung huyết, gây dễ thở và ức chế ho, làm giảm các triệu chứng viêm xoang.
Nó là 1 trong những thuốc hỗ trợ điều trị thịnh hành ở Đức, được Hội đồng Điều trị
của Đức chỉ định trong điều trị viêm sưng ở mũi và xoang mũi do phẫu thuật hoặc
do tổn thương từ năm 1993 [5].
. Trong tiêu hóa :
Bromelain là thuốc hỗ trợ giúp tiêu hóa tự nhiên là do có khả năng tiêu hủy
protein, được dùng trong các trường hợp có các hội chứng sưng, sinh hơi và hội

chứng dạ dày bị kích thích. Bromelain được sử dụng ở dạng đơn thành phần hoặc
phối hợp với các enzym khác như với Lipase (enzym tiêu hủy chất béo), với
amylase (enzym tiêu hủy tinh bột) hoặc với trypsin (enzym tiêu hủy protein). Tuy
nhiên hiện nay các nghiên cứu về tính an toàn và hiệu quả của Bromelain trong điều
trị các bệnh về đường tiêu hóa vẫn đang được tiếp tục.
. Trong điều trị viêm xương khớp:
Bromelain có tác dụng trợ giúp làm giảm đau khi bị viêm khớp xương,
nhưng chưa được nghiên cứu lâm sàng trên phạm vi lớn để đánh giá tính hiệu quả.
. Trong điều trị ung thư:
Bromelain và nhóm enzym protease cũng được dùng như là thuốc hỗ trợ điều
trị ung thư trong 1 số nghiên cứu lâm sàng trên trên bệnh nhân ung thư: Bromelain
tác dụng như một yếu tố điều hòa miễn dịch bằng cách làm tăng khả năng gây độc
tế bào của các tế bào đơn nhân để kháng lại các tế bào ung thư của bệnh nhân và
bằng cách kích thích tổng hợp các cytokin như yếu tố gây hoại tử khối u (Tumor

12


necrosis factor-a), interleukin -1β, interleukin-6 và Interleukin-8. Một số nghiên cứu
trên động vật thí nghiệm đã thu được kết quả khả quan về hiệu quả ngăn ngừa các
tế bào ung thư di căn khi phối hợp bromelain với dược chất nghiên cứu có hoạt tính
diệt tế bào ung thư [18].
2.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain
Hoạt tính của enzym Bromelain được xác định dựa trên khả năng thủy phân
các cơ chất khác nhau, cụ thể như sau:
. Thủy phân cơ chất là casein: tạo ra sản phẩm là tyrosin. Định lượng tyrosin
bằng phương pháp quang phổ UV-VIS. Hoạt tính được xác định theo lượng tyrosin:
1 đơn vị bromelain là lượng enzym có khả năng thủy phân casein để giải phóng 1
mcg tyrosin trong 1 phút trong điều kiện nhất định [3, 4].
. Thủy phân cơ chất là gelatin: tạo ra sản phẩm là acid amin. Định lượng acid

amin bằng phương pháp chuẩn độ acid kiềm [7].
. Thủy phân cơ chất Nα- carbobenzoxy-L-lysin p-nitrophenyl ester: tạo ra
sản phẩm p-nitrophenol, làm thay đổi giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch theo
thời gian. Hoạt tính của bromelain được xác định dựa theo lượng p-nitrophenol tạo
thành.
. Thủy phân các protein có trong hỗn dịch sữa làm đông vón hỗn dịch sữa.
Hoạt tính của bromelain được xác định bằng cách so sánh thời gian đông vón sữa
với chất chuẩn đã biết hoạt tính.
2.2. Enzym Trypsin
2.2.1. Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin
Enzym trypsin có mặt trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật có xương
sống, có khả năng thủy phân protein. Trypsin được sản xuất tại tuyến tụy dưới dạng
tiền enzym là trypsinogen với trọng lượng phân tử là 34 Kdalton, sau khi cắt chuỗi
gồm 6 acid amin ở đầu N tạo thành trypsin hoạt động có trọng lượng phân tử 23,8
KDalton. Phân tử trypsin là 1 chuỗi peptid đơn có khoảng 223 acid amin [26].

13


Khi tuyến tụy bị kích thích bởi cholecystokinin sẽ tiết trypsinogen vào ruột
non. Tại đó, enzym peptidase trong ruột (Enteropeptidase) sẽ hoạt hóa chúng để tạo
thành trypsin. Tuyến tụy tổng hợp 3 dạng đồng phân của trypsinogen là
trypsinogen-1 (cation trypsinogen), trypsinogen-2 (anion trypsinogen), và
trypsinogen-3 (mesotrypsinogen). Trypsinogen-1 và trypsinogen-2 là hai dạng chính
chịu trách nhiệm tiêu hóa protein với tỷ lệ 2:1, trong khi mesotrypsin chỉ chiếm 5%
trong tổng số dịch tiết của tuyến tụy, không bị các chất ức chế trypsin tác động.
Mesotrypsin là một protease biệt hóa , có vai trò đặc biệt trong việc phá hủy các
chất ức chế trypsin, nên có ích trong việc tiêu hóa các thực phẩm giầu chất ức chế
trypsin như đậu tương. Bản thân trypsin hình thành cũng lại tự động hoạt hóa
trypsinogen. Do đó chỉ cần một lượng nhỏ enzym Enteropeptidase đủ để khởi động

quá trình hoạt hóa [15].
2.2.2. Cơ chế hoạt động và ứng dụng trong y học
Trong cơ thể tự nhiên, trypsin được tiết vào tá tràng, nó xúc tác quá trình
thủy phân các peptid bằng cách cắt các liên kết peptid thành các acid amin cấu
thành sau khi các protein thức ăn đã được tiêu hóa một phần bởi enzym pepsin trong
dạ dày. Cơ chế xúc tác của enzym tương tự như các enzym serin protease khác:
Trypsin cắt chuỗi peptid tại vị trí có acid amin lysin hoặc arginin ở phía gốc
carboxyl.
Trypsin là enzym thuộc nhóm serin protease. Nhóm serin protease gồm
những enzym có chứa nhóm -OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động, có vai
trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này gồm 2 nhóm
nhỏ là chymotrypsin và subtilisin. Nhóm subtilisin gồm 2 loại enzyme vi khuẩn là
subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN. Các serin protease thường hoạt động mạnh ở
vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng [21].
Trypsin có chứa trung tâm hoạt động gồm bộ ba các acid amin là histadin-57,
aspartat-102 và serin-195. Bộ ba acid amin này nằm sát gần nhau và đóng vai trò
cần thiết trong hoạt tính phân hủy protein của các enzym protease do hình thành 1
“rơ le” tích điện để tạo ra vị trí hoạt động là serin ái nhân bằng cách thay đổi mật độ

14


điện tử của serin. Gốc acid amin aspartat (Asp 189) định vị trong trung tâm xúc tác
của trypsin làm ổn định gốc lysin và gốc arginin tích điện dương, do vậy nó có vai
trò trong tính đặc hiệu của enzym, có nghĩa là trypsin cắt protein ở đầu C tại vị trí acid
amin lysin và arginin. Toàn bộ các phản ứng được tóm tắt qua 5 bước như sau [ 22]:
. Bước 1: Cơ chất polypeptid gắn lên bề mặt của enzym sao cho liên kết bị cắt nằm
vào vị trí hoạt động của enzym bằng cách nguyên tử carbon của gốc carbonyl định
vị gần với gốc serin ái nhân.
. Bước 2: Gốc – OH của serin tấn công vào nguyên tử carbon và nitơ của gốc

histidin nhận –H từ -OH của serin và cặp điện tử từ liên kết đôi –C=O di chuyển về
phía nguyên tử oxy.
. Bước 3: Liên kết giữa Nitơ và carbon của mạch peptid bị bẻ gãy. Các điện tử hóa
trị của liên kết này di chuyển để tấn công vào nguyên tử -H của histidin làm gãy
mối liên kết. Các điện tử đã chuyển dịch về phía nguyên tử oxy trong gốc carbonyl
trước đó lại di chuyển ngược lại để tái tạo lại liên kết hình thành sản phẩm trung
gian acyl-enzym.
. Bước 4: Lúc này, phân tử nước tham gia vào phản ứng. Nước thế chỗ cho đầu –N
của mạch peptid bị cắt và tấn công vào nguyên tử carbon của gốc carbonyl. Một lần
nữa, các điện tử của liên kết đôi –C=O di chuyển về phía nguyên tử oxy làm cho nó
tích điện âm, hình thành liên kết giữa oxy của nước với nguyên tử carbon, đồng
thời nitơ của Histidin nhận proton từ nước.
. Bước 5: Trong phản ứng cuối cùng này, liên kết hình thành trong bước 1 giữa
nguyên tử carbon của gốc carbonyl và serin lại di chuyển để tấn công vào nguyên tử
–H mà histidin vừa nhận được. Lúc này nguyên tử carbon tái tạo lại liên kết đôi với
nguyên tử oxy. Kết quả mạch peptit ở đầu –C bị tách ra (Hình 2).

15


Hình 2: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym trypsin
Do vị trí cắt của enzym nằm phía trong của chuỗi polypeptid nên trypsin
được phân loại là enzym peptidase nội phân tử (endopeptidase)
Trypsin có cấu trúc phân tử tương tự như của enzym chymotrypsin, tuy nhiên
chúng khác nhau ở loại cơ chất cần phân giải: trypsin cắt protein tại vị trí lysin và
arginin, còn chymotrypsin lại cắt tại các gốc kỵ nước như tryptophan, tyrosin và
phenylalanin.

16

Hoạt tính của trypsin không bị ảnh hưởng bởi chất ức chế tosyl phenylalanin
chloromethyl keton (TPCK), là khác so với chymotrypsin. Trong cơ thể, sự thiếu
hụt trypsin có thể gây những bất thường: ví dụ như bệnh u xơ có tính di truyền trên
nhiễm sắc thể là do thiếu hụt vận chuyển của trypsin và các enzym tiêu hóa khác từ
tuyến tụy dẫn đến hiện tượng tắc phân ở trẻ sơ sinh.
Trypsin có pH tối ưu ở khoảng 8,0 – 9,0 và nhiệt độ tổi ưu khoảng 370C.
Trypsin cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (-200C đến - 800C) để tránh sự tự phân
hủy. Quá trình tự phân hủy có thể được ngăn ngừa bằng cách bảo quản trypsin ở pH
3 hoặc bằng cách sử dụng trypsin đã được methyl hóa. Khi pH được điều chỉnh lại 8
thì hoạt tính của trypsin được phục hồi. Trypsin dễ tan trong nước, không hòa tan
trong Triclomethan, ethanol, glycerin... Ion Ca2+ đóng vai trò bảo vệ và hoạt hóa
trypsin. Trypsin bị ức chế bởi các thành phần có chứa phosphat hữu cơ như
diisopropylfluorophosphat và các chất ức chế tự nhiên có trong tuyến tụy. Hạt đậu
tương, lòng trắng trứng ... cũng có các chất ức chế tự nhiên đối với trypsin.
Ứng dụng của enzym trypsin:
. Trypsin có mặt với số lượng lớn trong tuyến tụy và có thể tinh chế tương
đối dễ dàng. Chính vì vậy trypsin được sử dụng rộng rãi như là thuốc hỗ trợ điều trị
giống như Bromelain: giúp cho sự lưu thông thể dịch ở vị trí viêm cũng như ức chế
quá trình viêm để thúc đẩy nhanh chóng sự phục hồi của mô và làm giảm các triệu
chứng liên quan đến tình trạng viêm.
. Trypsin được ứng dụng nhiều trong quá trình sản xuất bằng công nghệ sinh
học như: các sản phẩm được sản xuất trên tế bào, các kháng huyết thanh chứa kháng
thể đặc hiệu. Trong nuôi cấy tế bào, trypsin được dùng để tách các tế bào bám dính
trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy và thu được hỗn dịch tế bào
. Trong nghiên cứu sinh học, trypsin được dùng trong các thử nghiệm trên
các phân tử protein để thủy phân protein thành các mạch peptid cho việc phân tích
khối phổ do trypsin có tính đặc hiệu cao, chỉ thủy phân liên kết peptid tại gốc
carbonyl của acid amin là Arginin và Lysin.
. Trypsin có thể được sử dụng trong công nghệ sản xuất sữa, thực phẩm cho

trẻ nhỏ, do trypsin có khả năng phân cắt các phân tử protein trong sữa giúp trẻ tiêu
hóa dễ dàng hơn.

17


2.2.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym trypsin
Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất để xác định hoạt tính của trypsin là
trên cơ chế thủy phân cơ chất N-benzoyl-L-arginin ethyl ester như sau:
Trypsin
N-benzoyl-L-arginin ethyl ester

N-benzoyl-L-arginin + Ethanol

Trên cơ sở sản phẩm tạo thành có hai cách để xác định hoạt tính của trypsin:
- Theo Dược điển Mỹ, giá trị hấp thụ của dụng dịch theo thời gian và hoạt
tính của Trypsin được xác định bằng cách quy đổi từ sự biến thiên giá trị của độ
hấp thụ [3,28].
- Theo Dược điển Anh, lượng N-benzoyl-L-arginin tạo thành làm thay đổi
pH của hỗn hợp phản ứng. Hoạt tính enzym trypsin được tính toán bằng cách so
sánh với chất chuẩn đã biết hoạt tính, dựa trên thể tích dung dịch natri hydroxyd cần
thiết để duy trì pH tại giá trị 8,0 [27].
2.3. Enzym streptokinase
2.3.1. Cấu trúc và tính chất của enzym streptokinase
Streptokinase được phát hiện vào năm 1933, do Bác sỹ William Smith Tilett
người Mỹ một cách hoàn toàn tình cờ trong một thử nghiệm: Ông lấy huyết tương
người từ máu có chứa chất chống đông oxalat để loại bỏ Ca++ nên không bị đông.
Sau đó ông bổ sung Ca++ vào ống chứng, liên cầu khuẩn và canxi vào các ống thử
với hy vọng là các vi khuẩn sẽ hấp phụ fibrinogen trong huyết tương để ngăn ngừa
hình thành cục đông. Nhưng ông đã thất vọng khi tất cả các ống nghiệm, kể cả ống

nghiệm chỉ chứa liên cầu khuẩn cũng bị đông. Sau một thời gian tìm hiểu nguyên
nhân không thành công của thử nghiệm trước khi loại bỏ các ống nghiệm, tình cờ
ông quan sát thấy có dung dịch lỏng xuất hiện trong các ống thử có chứa liên cầu
khuẩn. Điều này đưa ông đến kết luận rằng các liên cầu khuẩn đã tổng hợp một yếu
tố ly giải fibrin nên làm tan các cục đông. Ông gọi yếu tố ly giải fibrin này là
fibrinolysin. Ông cũng đã đưa ra kết luận về tính đặc hiệu cao của yếu tố này là chỉ
làm ly giải khối đông của người mà không ly giải cục máu đông của các động vật
khác [19].

18