phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm bằng phương pháp pcr

VẬT TRONG THỰC
PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP PCR
(Polymerase Chain
Reaction)
Khái niệm chung về phương pháp PCR
Phương pháp phát hiện Salmonella bằng
PCR
Phương pháp phát hiện V. cholerae bằng
PCR

1


KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP PCR
Khái niệm
 PCR là phương pháp khuếch đại in vitro (trong
ống nghiệm) một trình tự DNA dựa trên một
trình tự DNA đích ban đầu bằng một cặp mồi
(primers) và enzym DNA polymerase
 Khuôn DNA (template)là trình tự DNA đích đặc
trưng cho đối tượng cần phát hiện
 Mồi (pimers): là một trình tự DNA hay RNA
ngắn bắt cặp với mạch khuôn DNA có mang
một đầu 3’- OH tự do giúp DNA polymerase bắt
đầu tổng hợp mạch mới.
Trong một phản ứng cần có 2 mồi

2

KHÁI NIỆM CÁC THUẬT NGỮ
 Bắt cặp bổ sung: là sự kết hợp giữa hai mạch
DNA đơn hay một mạch DNA đơn với RNA khi
trình tự hai mạch này tương đồng đối song song
(A-T, G-C)
 DNA polymerase là enzym tổng hợp mạch DNA
mới từ một mạch khuôn. Trong phương pháp PCR
thường sử dụng Taq DNA polymerase là một
enzym chòu nhiệt
 Biến tính: là sự chuyển từ DNA mạch kép thành
hai mạch DNA đơn dưới tác dụng của tác nhân
biến tính.
Trong PP PCR tác nhân biến tính là nhiệt

 Lai: là sự bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA theo
nguyên tắc bổ sung

3


KHÁI NIỆM (tt)
 Khuếch đại: là sự nhân bản các đoạn DNA. Trong
PP này, sự khuếch đại thông qua các chu kỳ nhiệt
độ
Độ lớn của đoạn DNA được khuếch đại bằng kích
thước nằm giữa hai mồi

 Điện di: là quá trình phân tách các đoạn DNA có
kích thước khác nhau trong gel agarose dưới tác
dụng của dòng điện 1 chiều

 Thang DNA (DNA marker) là phương tiện để đo
kích thước các đoạn DNA. Đây là hỗn hợp các
đoạn DNA có kích thước khác nhau đã biết
 Cặp base ( base pair - bp): cặp base bổ sung trong
DNA mạch đôi
4


CÁC BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH
KHUẾCH ĐẠI
 Phản ứng PCR được thực hiện thông qua nhiều chu kỳ
nhiệt liên tiếp gồm các bước như sau:
 Bước 1: Biến tính: làm cho hai mạch của DNA tách rời nhau
ra dưới tác dụng của nhiệt. Nhiệt độ biến tính luôn cao hơn
nhiệt nóng chảy (Tm) của khuôn DNA. Thường thực hiện ở
nhiệt độ 92-95oC
 Bước 2: Lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của mồi cho phép
mồi bắt cặp với khuôn DNA. Nhiệt độ lai dao động trong
khoảng 40-70oC
 Bước 3: Kéo dài: nhiệt độ được tăng lên đến nhiệt độ tối ưu
cho taq DNA polymerase hoạt động (72oC) tổng hợp hợp kéo
dài mạch mới từ đầu 3’OH của mồi

 Chu kỳ tiếp theo sẽ quay lại bước 1 sau khi kết thúc
bước 3 của chu kỳ trước
5


CÁC BƯỚC CỦA PHẢN ỨNG PCR
Chu kỳ

1

Nhiệt
độ (Co)

Biến
tính
bản
mẫu
Mồi bắt
cặp

Thời gian
(phút)

Chu kỳ 2

Tổng
hợp
DNA

6


SÔ ÑOÀ PHAÛN ÖÙNG PCR

7


THÀNH PHẦN THAM GIA TRONG

PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI PCR
 Khuôn DNA
 Mồi (primers): gồm một mồi xuôi và một mồi ngược
có nồng độ bằng nhau
 dNTP là hỗn hợp gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP.
Các thành phần này có nồng độ bằng nhau
 Taq DNA polymerase
 MgCl2 là thành phần không thể thiếu, có tác dụng
làm tăng ái lực kết hợp mồi – khuôn và dNTP – Taq
polymerase.
Nồng độ phụ thuộc từng qui trình khuếch đại

 Đệm phản ứng: gồm Tris – HCl, Tween 20(NH4)SO4,
KCl và các chất tăng cường khuếch đại
8


THU NHẬN KHUÔN DNA
 DNA nằm trong nhân tế bào, bên trong màng tế
bào vi khuẩn hay trong vỏ bọc của virus
 Giải phóng DNA bằng cách phá huỷ màng tế
bào, màng nhân, vỏ virus …
 Tác nhân phá màng để giải phóng DNA có thể
là nhiệt, lysozym hay các chất tẩy mạnh. Trong
phân tích vi sinh thường sử dụng tác nhân là
nhiệt
 Khuôn DNA có thể được tinh sạch hoạt không
9

MỒI
 Là thành phần quyết đònh tính chuyên biệt cho
đối tượng cần phân tích
 Mồi được thiết lập dựa trên một trình tự DNA
được biết trước
Được thiết lập trên một gen đặc trưng cho đối tượng
cần phân tích

 Độ lớn sản phẩm khuếch đại là khoảng cách
giữa hai mồi
 Nên chọn mồi cho sản phẩm khuiếch đại 2001000bp
 Tm của hai mồi tương đương nhau
 Nên chọn mồi có tỉ lệ G + C > 50%

10


QUI TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
BẰNG PCR
 Gồm các bước cơ bản như sau
– Tăng sinh: để làm tăng số lượng VSV  tăng độ nhạy
của phương pháp
– Xử lý khuôn DNA
– Khuếch đại: làm giàu số lượng DNA mục tiêu
– Điện di: phân tích sản phẩm khuếch đại trên gel
agarose
– Nhuộm DNA với ethidium bromide trên gel, đọc kết
quả dưới đèn UV.
– Kết quả dương tính: có sản phẩm khuếch đại phù hợp
kích thước được thiết kế

– Kết quả âm tính: không có DNA được khuếch đại hay
kích thước tạo ra không phù hợp kích thước thiết kế
11


KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÊN GEL
AGAROSE

T: thang DNA, 1,3,4,5,6,8,9,10,11: Mẫu cho kết
quả dương tính với sản phẩm khuếch đại 380bp,
2,7: Mẫu âm tính

12


Ưu, nhược điểm của phương pháp PCR
 Ưu điểm
–
–
–
–

Thời gian cho kết quả nhanh: 24-28 giờ
Có thể phát hiện VSV khó nuôi cấy
Hoá chất dễ bảo quản, dễ tìm
Ít tốn công lao động

 Nhược điểm
– Taq DNA polymerase bò ức chế bởi các thành phần
của mẫu

– Cần có bước làm giàu nếu mật độ VSV trong mẫu
quá thấp
– Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết
13


CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM ĐÃ ÁP
DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR
Vi sinh vật

E. coli
E. coli (ETEC)
E. coli O157:H7

Loại thực
phẩm
Thòt heo, sữa,
rau, cá
Thòt heo, sữa
tươi, rau cải,
Thòt heo, sữa
tươi, rau cải

Salmonella spp.

Thòt thủy sản

Staphylococcus
aureus
V. cholerae

Sữa tươi, rau
cải, thòt thủy
sản
Thòt thủy sản

V. para.

Thòt thuỷ sản

Thời
gian
(giờ)

Độ nhạy
(CFU/phản
ứng)

Độ nhạy
(CFU/25g
mẫu)

12

90

10

14

700

5

16

32

10

12

90

3

24

200

10

14

30

10

16

370

10

Các ứng dụng đã được nghiên cứu triển khai tại ĐH KHTN14
TPHCM


PHAT HIEN
SALMONELLA TRONG
THệẽC PHAM BAẩNG
PCR

15


THIẾT BỊ, VẬT DỤNG
 Tủ ấm 37oC: tăng sinh Salmonella
 Máy luân nhiệt (thermocycler): khuếch đại
 Máy ly tâm eppendorf 1.5ml: xử lý khuôn DNA
 Máy lắc ống nghiệm
 Thiết bò điện di ngang và bộ nguồn có điện thế
80-150V
 Hộp đèn soi UV có kính lọc 302nm
 Pipetteman 1-10µl, 10-100 µl, 0.1 – 1 ml
 Eppendorf 1.5ml, ống PCR 0.2 hay 0.5ml
16


HOÁ CHẤT – VẬT TƯ

 Môi trường BPW
 Mồi: gồm invA1 và invA2 cách nhau 520bp
được thiết lập trên gen invA có trình tự là:
invA1: 5’-TTGTTACGGCTATTTTGACCA-3’
invA2: 5’-CTGACTGCTACCTTGGCTGATG-3’

Mỗi mồi được pha loãng 6pM/µl trong đệm TE
(10mMTris-HCl (pH8), 1mMEDTA)

 Taq DNA polymerase 1.25U/ µl
 Đệm phản ứng:
Tris-HCl (pH 8.8):
NH4)2SO4
Tween 20
dNTP
MgCl2

7.5mM
20mM
0.01%
20 µM mỗi loại
1.5mM

17


HOÁ CHẤT – VẬT TƯ
 Thang DNA có thể đo được đoạn 520bp
 Agarose sử dụng cho sản phẩm <1000bp

 Đệm điện di TAE 1X
Tris
Na2EDTA 0.5M, pH 8
Axit acetic băng
Nước cất

4.84g
2ml
1.14ml
đủ 1 lít

 Đệm tải mẫu

Glycerol
Brommophenol blue
Tris
Na2EDTA 0.5M, pH 8
 Ethidium bromide

30%
0.25%
200mM
20mM

10mg/ml

18


QUI TRÌNH

 Tăng sinh: 25g mẫu + 225ml BPW  ủ 37oC/ qua đêm
 Xử lý khuôn DNA: Hút 0.5ml dòch tăng sinh vào eppendorf  ly tâm 10 000
vòng/ 5 phút  đổ bỏ dòch  rửa sinh khối 2 lần với nước cất vô trùng  ly
tâm để bỏ phần nước  cho vào 0.5ml nước cất hay đệm TE  đun sôi cách
thủy 10 phút  dòch mẫu (khuôn) DNA

19


QUI TRÌNH (tt)
 Chuẩn bò ống khuếch đại

Đệm phản ứng

44 µl

Taq DNA polymerase

1 µl

Mồi invA1 6pM

1 µl

Mồi invA2 6pM

1 µl

Khuôn DNA

3 µl

 Chương trình khuếch đại
95oC / 5 phút  (95oC/60 giây, 54oC / 45 giây, 72oC / 60 giây) x 35 chu
kỳ  72oC/ 10phút  giữ ở 20oC

20


QUI TRÌNH (tt)
 Nhuộm mẫu: cho 10µl dd nhuộm mẫu vào sản phẩm sau khuếch đại 
trộn đều
 Chuẩn bò gel agarose 2%: 2g agarose + 100ml TAE  đun tan  cho
vào 5 µl dd ethidium bromide  cho vào khay có gắn các lược để tạo
giếng  chờ gel đông đặc  bỏ lược  ngâm vào đệm TAE
 Điện di: hút 5-10 µl mẫu đã nhuộm cho vào giếng  điện di ở điện thế
100V trong khoảng 1 giờ
 Cho gel lên bàn UV để đọc kết quả

21


DIỄN GIẢI KẾT QUẢ
 Kết quả dương tính: có xuất hiện vạch sản phẩm 520bp
 Kết quả âm tính: không có vạch sản phẩm, hay xuất hiện các vạch khác
kích thước trên

22

KHUYẾN CÁO
 Không sử dụng chung các dụng cụ vào các việc trước và sau khuếch đại
 Chuẩn bò mẫu khuếch đại và xử lý mẫu sau khuếch đại được thực hiện
tại các khu vực khác nhau
 Ethidium bromide là chất gây ung thư, phải có găng tay khi tiếp xúc
hoá chất này
 Chỉ mở đèn UV khi đã đóng kính bảo vê%

23


QUI TRÌNH PHÁT HIỆN V. CHOLERAE
BẰNG PCR
 Thực hiệntương tự như qui trình phát hiện Salmonella, các điểm khác là

– Trình tự mồi:
Mồi 1: 5’-TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3’
Mồi 2: 5’-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3’
Nồng độ mồi: 10pM/µl

– Chương trình khuếch đại: nhiệt độ lai mồi và
khuôn DNA là 55oC
– Sản phẩm khuếch đại có kích thước 777bp

24