Chẩn đoán phân tử trong chẩn đoán Lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
KHOA VẬT LÝ KỸ THUẬT & CÔNG NGHỆ NANO

TIỂU LUẬN

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
ĐỀ TÀI

CHẨN ĐOÁN BỆNH LAO

GV : TS. Hà Thị Quyến
SV : Phạm Văn Hòa

Hà Nội - 2015


2|Page


MỤC LỤC
I. MỞ ĐẦU
II. TỔNG QUAN
1. Lịch sử về bệnh lao
2. Giới thiệu chi tiết về bệnh
3. Tác nhân và cơ chế gây bệnh
3.1. Giới thiệu về vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis
3.2. Cơ chế gây bệnh
3.3. Lao kháng thuốc
4. Cấu trúc phân tử (gene) và các gen có ý nghĩa trong chẩn đoán
5. Vắc xin BCG và các công trình nghiên cứu

III. CHẨN ĐOÁN BỆNH
1. Phương pháp chẩn đoán thông thường
1.1. Chẩn đoán lâm sàng
1.2.
Xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen)
1.3.
1.4.
1.5.

Xét nghiệm hình ảnh (X-quang)
Nuôi cấy đờm
Phản ứng tuberculin (Mantoux)

2. Phương pháp chẩn đoán phân tử
1.1. PCR
1.2. Real time PCR
1.3. ELISA
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

3|Page


I.

MỞ ĐẦU
Lao là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường

gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao
màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương và khớp.
Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng

đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu người tử
vong, hầu hết ở các nước đang phát triển.
Hầu hết (90%) các trường hợp nhiễm khuẩn lao là tiềm ẩn không triệu
chứng. 10% những người này trong cuộc đời họ sẽ tiến triển thành bệnh lao có
triệu chứng, và nếu không điều trị, nó sẽ giết 50% số nạn nhân. Lao là một trong
3 bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới: HIV/AIDS giết 3 triệu
người mỗi năm, lao giết 2 triệu, và sốt rét giết 1 triệu.
Sự sao lãng trong các chương trình kiểm soát lao, sự bùng phát của đại
dịch HIV/AIDS và việc di dân đã khiến lao trỗi dậy. Các chủng lao kháng đa
thuốc (MDR, multiple drug resistant) đang tăng. Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế
giới tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu đối với lao.
Do đó, việc phát hiện và điều trị kịp thời đối với bệnh lao rất quan trọng.
Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như
xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản
ứng tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại
một số mặt hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có
độ chính xác không cao,… Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học
phân tử sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả
hơn. Trong bài tiểu luận này tôi xin đề cập đến một số phương pháp chẩn đoán
bệnh lao đang được sử dụng trong và ngoài nước.

4|Page


II.

TỔNG QUAN
1. Lịch sử bệnh Lao
Năm 1819, một người Pháp tên là René Laennec (1781-1826) phát minh

ra ống nghe, đăng lần đầu tiên trên báo chuyên luận về ống nghe bệnh. Ông áp
dụng phương pháp của mình cho căn bịnh đang gặm mòn ông để rồi 7 năm sau
ông mất, lúc 45 tuổi: đó là bệnh lao. Bịnh này do ông lỡ cắt trúng tay khi giải
phẫu tử thi người chết vì bịnh lao để khám nghiệm.
Bệnh lao được biết từ thời thượng cổ, có tên là "phtisie" (tiếng Hy Lạp
phtio nghĩa là "tôi giết"). Bệnh nổ ra tại Anh quốc giữa thế kỷ thứ 18, rồi lan
tràn khắp Âu châu. Đó là căn bệnh nghiêm trọng nhất của thế kỷ 19 đã ám ảnh
các nhà văn và y sĩ. Bệnh này thường thấy ở thanh niên, làm họ chết sau 18
tháng đến 2 năm. Sự tác hại của nó rất lớn: mặc dù điều kiện sống có tốt hơn
nghĩa là con người có sức chống bệnh cao hơn, nhưng năm 1900 nó là nguyên
nhân của 12% số người chết ở nước Pháp.
Cho dù bệnh lao có thể tấn công tất cả mọi cơ quan, từ màng não cho tới
ruột non đi qua xương, thận, tử cung, thì bệnh lao phổi chiếm đến 80%. Laennec
đã chứng minh tính riêng biệt của bệnh ở những giai đoạn khác nhau và phân
biệt dạng lao phổi khác với những sự nhiễm trùng phổi khác.
Những tác giả ở thế kỷ thứ 19 đã diễn tả chu kỳ của bệnh này: bệnh nhân
ốm yếu dần, thỉnh thoảng ho khan, khạc đờm, đổ mồ hôi rất nhiều về đêm, cảm
thấy đau giữa vai và lồng ngực, rối loạn tiêu hóa và thân nhiệt lên ban đêm. Khi
khám phổi, y sĩ nghe thấy tiếng khô và ráp, tiếng ran nổ nhẹ, tiếng rắc. Vài
tháng sau, bắt đầu ho thường xuyên và đau. Đờm màu xanh với những mảnh đặc
trắng. Bệnh nhân ói mửa, ăn mất ngon, sốt. Tiêu chảy làm bệnh nhân càng yếu
hơn. Ống nghe bệnh bằng một dụng cụ quí báu mới phát minh, nghe phổi truyền
tiếng òng ọc như từ "bình bị rạn nứt" hay tiếng ồ ồ từ "đáy hang" (theo lời của
Laennec).

5|Page


Trong pha đầu, khi khám nghiệm tử thi, ông thấy thấy những hột nửa
trong nửa đục nhỏ bằng hột kê cho tới lớn bằng hột đậu tràn lan trong phổi. Sau

đó những hột nào trở thành mềm thì đổi ra màu trăng trắng, như "một viên phó
mát bị ngón tay đè nát". Chính thứ này bắt bệnh nhân khạc một cách khó nhọc.
Bên cạnh các hột này là những lỗ hổng lớn cỡ hột hạnh nhân có khi to bằng nắm
tay có chứa hoặc không chứa một chất lỏng. Phổi bị tàn phá, không thể chứa đầy
không khí.
Trong suốt một thế kỷ, gánh nặng này qui tụ quanh nó nhiều ảo giác. Vào
năm 1840, đó là căn bệnh lãng mạn, yếu ớt nhưng tỉnh táo. Sau đó đến triều đại
Napoléon, người ta tưởng rằng đó là bệnh của những tinh hoa, từ Aiglon, con
trai của Napoléon đệ nhất cho tới Chopin và nhất là bệnh của bà Beaumont do
Chateaubriand miêu tả cho tới bà Marie Duplessis, mẫu đàn bà Trà hoa nữ
(Dame aux Camélias) của Alexandre Dumas fils (1824-1895) và Traviata của
Juiseppe Verdi (1813-1901).
Vào cuối thế kỷ thì họ khám phá ra rằng chính những người nghèo mới bị
lao nhiều nhất. Những nhà đạo đức học cho rằng bệnh này xảy ra cho những
người nghiện rượu hoặc có cuộc sống thác loạn. Họ cho rằng thành phố là nơi
gom tụ những sự xấu xa nên đã sinh ra căn bệnh ác hại này. Nhưng nó không
chừa ngay cả tận cùng thôn quê.
Từ năm 1865 người ta mới biết bệnh lao truyền nhiễm. Giới trưởng giả
hốt hoảng, đuổi ngay người hầu khi thấy họ bắt đầu ho.
Các nghiệp đoàn khám phá rằng gánh nặng này do cảnh nghèo và sự bóc
lột: năm 1901, Ferdinand Pelloutier nhấn mạnh là bệnh phtisie giết gấp 4 lần
những người ở quận 15, lúc đó là quận nghèo, hơn là khu Opéra...
Mặc dù có những tiến bộ thực tiễn về hiểu biết ăn bệnh, nhưng các y sĩ
vẫn chưa có khí giới. Để chữa trị , họ chữa trị người giàu có bằng cách khuyên
họ ăn uống tẩm bổ, nghỉ ngơi, hít thở gió biển, tới Madère, Naples hay đến miền
Nam nước Pháp.
6|Page


Đến giữa thế kỷ, Hermann Brehmer và Peter Dettweiler chế ra

sanatorium, kéo người bệnh ra khỏi thế giới trong kéo dài cho tới hàng năm và
gây cảm hứng sáng tác văn chương nơi đó có quyển tiểu thuyết của Thomas
Mann La montagne magique (Núi thần diệu).
Năm 1884, hy vọng lớn lao đã đến khi nhà khoa học Đức Robert Koch
(1843-1910) khám phá ra trực khuẩn bệnh lao. Tuy nhiên phải đợi dến năm
1921 hai nhà bác học Albert Calmette (1863-1933) và Camille Guérin (18721961) cô lập được trực khuẩn vô hại, nghĩa là sự chủng ngừa, thuốc chủng
B.C.G. (Baccillus Calmette Guérin).
Lúc đầu người ta chỉ chủng ngừa bệnh, sau đó phổ biến rộng rãi và cuối
cùng hầu hết một nước đều bắt buộc phải chủng ngừa bệnh lao. Tuy nhiên
những người đã bịnh vẫn chưa có thuốc chữa cho đến thời kỳ Thế giới Chiến
tranh lần thứ Hai, các loại thuốc trị được chế tạo có hiệu nghiệm như
streptomycine, isoniazide hay rimifon.
Trong những năm 50, bệnh lao đã được đẩy lùi trong những nước kỹ nghệ
hóa. Các nhà điều dưỡng vắng dần. Con người đã quên đi sự sợ hãi khi nghe tên
bệnh. Tuy nhiên bệnh lao vẫn tiếp tục hoành hành nhất là tại các nước thuộc thế
giới thứ ba mà mỗi năm giết khoảng 2-3 triệu người.
2. Giới thiệu chi tiết về bệnh Lao
Lao là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường
gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao
màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương và khớp.
Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng
đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm, gây 2 triệu người tử
vong, hầu hết ở các nước đang phát triển.
Hầu hết (90%) các trường hợp nhiễm khuẩn lao là tiềm ẩn không triệu
chứng. 10% những người này trong cuộc đời họ sẽ tiến triển thành bệnh lao có
7|Page


triệu chứng, và nếu không điều trị, nó sẽ giết 50% số nạn nhân. Lao là một trong
3 bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới: HIV/AIDS giết 3 triệu

người mỗi năm, lao giết 2 triệu, và sốt rét giết 1 triệu.
Lao lan truyền qua các giọt nước trong không khí từ chất tiết khi ho, nhảy
mũi, nói chuyện hay khạc nhổ của người nhiễm vi khuẩn hoạt động. Tiếp xúc
gần gũi (kéo dài, thường xuyên, thân mật) là nguy cơ nhiễm bệnh cao nhất
(khoảng 22%, nhưng có thể đến 100%). Người mắc lao hoạt động không điều trị
có thể lây sang 20 người khác mỗi năm. Các nguy cơ khác bao gồm ra đời ở
vùng lao phổ biến, bệnh nhân rối loạn miễn dịch (như HIV/AIDS), cư dân hoặc
làm việc ở nơi đông người nguy cơ cao, nhân viên chăm sóc sức khoẻ phục vụ
đối tượng có nguy cơ cao, nơi thu nhập kém, thiếu vắng dịch vụ y tế, dân thiểu
số nguy cơ cao, trẻ em phơi nhiễm với người lớn thuộc nhóm nguy cơ cao,
người tiêm chích ma tuý.
Lây truyền chỉ xảy ra ở người mắc bệnh lao hoạt động (không phải lao
tiềm ẩn). Khả năng lây truyền phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn của người
mắc lao (số lượng tống xuất), môi trường phơi nhiễm, thời gian phơi nhiễm
và độc lực của vi khuẩn.
Đờm của người bệnh là nguồn lây quan trọng nhất. Người bệnh ho, nói,
khạc, tạo ra những hạt nước bọt rất nhỏ chứa đầy vi khuẩn lao bay lơ lửng trong
không khí (Nói : 200, Ho : 3.500, Hắt xì hơi : 4.500 – 1.000.000). Người ta có
thể hít phải những hạt này vào phổi và mắc bệnh. Những bệnh nhân trong đờm
có vi trùng lao lây nhiều hơn. Vi trùng lao có thể gây bệnh ở tất cả các bộ phận
trong cơ thể. Người nhiễm lao có thể trở thành bệnh lao, tỷ lệ từ nhiễm lao
chuyển thành mắc lao là 10% trong đời người, cao nhất trong 24 tháng.( HIV+
10% năm). Những người sống gần bệnh nhân, nguy cơ lây bệnh càng cao.
Chuỗi lây truyền có thể được chấm dứt bằng cách cách ly người bệnh ở
giai đoạn bệnh hoạt động và áp dụng biện pháp điều trị kháng lao hữu hiệu.
8|Page


Mycobacteria lây nhiễm lên nhiều động vật khác, bao gồm cả chim, động
vật gặm nhấm, và bò sát. Phân loài của loài Mycobacterium tuberculosis, dường

như hiếm khi có mặt trên các loài động vật hoang dã. Một nỗ lực để diệt trừ
bệnh lao bò do Mycobacterium bovis trên các đàn gia súc và nai của New
Zealand đã tương đối thành công. Những nỗ lực như thế ở Anh thì ít thành công
hơn.
3. Tác nhân và cơ chế gây bệnh
3.1.

Tác nhân gây bệnh

3.1.1. Vi khuẩn M. Tuberculosis
Tác nhân gây bệnh lao, Mycobacterium tuberculosis (MTB), là vi
khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn này phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời
gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân
chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút). MTB
không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính
hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm
Gram, nó nhuộm Gram dương rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. Trực khuẩn
lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn yếu và
sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhưng, trong điều kiện tự nhiên,
chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ (cấy M. tuberculosis in vitro cần thời
gian dài để lấy có kết quả, nhưng ngày nay là công việc bình thường ở phòng xét
nghiệm).
Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm của
nó: nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được
phân loại là "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt là AFB). Với kỹ
thuật nhuộm thông thường nhất là nhuộm Ziehl-Neelsen, AFB có màu đỏ tươi
nổi bật trên nền xanh. Trực khuẩn kháng acid cũng có thể được xem bằng kính
hiển vi huỳnh quang và phép nhuộm auramine-rhodamine.
9|Page

Phức hợp M. tuberculosis gồm 3 loài mycobacterium khác có khả năng
gây lao: M. bovis, M. africanum và M. microti. Hai loài đầu rất hiếm gây bệnh
và loài thứ 3 không gây bệnh ở người.

Hình 1 : Vi khuẩn M. tuberculosis
(Nguồn : benhlao.net)
3.1.2. Cấu tạo vi khuẩn M. Tuberculosis
Trực khuẩn lao gồm có các thành phần:
 Lipit ( lớp sáp): Chiếm 40% trọng lượng khô, các chất lipit có mối liên hệ
chặt chẽ với cấu trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn có tính kháng acid.
Đây là đặc điểm cấu tạo của trực khuẩn lao khác với các vi khuẩn khác.
Lớp sáp đã được phân tích có nhiều yếu tố, có yếu tố gây bệnh tích, có
yếu tố chỉ mang tính kháng nguyên.
 Các thành phần khác như protein, polysaccharide... Vi khuẩn có nhiều yếu
tố sợi ở vách và chất nguyên sinh gây bệnh.Trên thân vi khuẩn lao có
những hạt nhiễm sắc không đều, những hạt đó có tên là hạt Much. Trước
10 | P a g e


đây người ta cho rằng những hạt Much có vai trò trong việc sinh sản ra
các vi khuẩn mới. Sau đó hạt Much đã được xác định chỉ là những điểm
nguyên sinh chất có cấu tạo khác nhau nên bắt màu khác nhau mà không
có vai trò trong sinh sản.

Hình 2 : Cấu trúc vách tế bào vi khuẩn
(1). Lớp lipid bên ngoài

(5). Lớp màng plasma

(2). Lớp acide mycolic

(6). Lớp lipoarabinomannan (LAM)

(3). Lớp polysacharide
(arabinogalactan)

(7). Lớp phosphatidylinositol
mannoside
(8). Lớp khung vách tế bào

(4). Lớp peptidoglycan
Cấu trúc vách tế bào và acide mycolic đem lại nhiều chức năng cho vi
khuẩn lao, giúp vi khuẩn có sức chịu đựng cao, làm tăng kháng thuốc do làm hư
hại các hoá chất, khử nước và ngăn chặn hiệu quả hoạt động của kháng sinh. Nó
11 | P a g e


làm cho vi khuẩn phát triển được bên trong đại thực bào và ẩn tránh hệ thống
miễn dịch của chủ thể. Và đặc biệt làm cho sức đề kháng của chúng rất mạnh
đối với môi trường bên ngoài khi chúng ra ngoại cảnh.
3.2.

Cơ chế gây bệnh

3.2.1. Cơ chế sinh bệnh lao tiêt phát
Trong lao tiên phát, cơ thể đáp ứng với trực khuẩn lao qua 2 quá trình:
 Quá trình đáp ứng không đặc hiệu.
 Quá trình đáp ứng đặc hiệu.
Đặc điểm lao tiên phát.

 Mẫn cảm tổ chức cao.
 Hay có tổn thương ở hạch rốn phổi, hạch trung thất.
 Xăng sơ nhiễm thường ở 2/3 dưới phổi.
 Tổn thương là viêm xuất tiết và hoại tử bã đậu, rất hiếm có nhuyễn hoá
thành hang.
 Lan tràn chủ yếu theo đường máu và bạch huyết.
 Ít dấu hiệu lâm sàng.
 Đa số tiến triển tốt và khỏi, khi khỏi để lại vôi hoá.
3.2.1.1. Quá trình đáp ứng không đặc hiệu
Còn gọi là thời kỳ tiền dị ứng. Thời kỳ này kéo dài 2-8 tuần. Trực khuẩn
lao vào cơ thể qua các nhân nước bọt, đến phế nang gây nên phản ứng viêm xuất
tiết fibrin, bạch cầu. Lúc này cơ thể chưa có dị ứng với lao, do đó đáp ứng của
cơ thể là một phản ứng viêm không đặc hiệu. Đám viêm phế nang này gọi là
xăng sơ nhiễm. Đại thực bào nuốt trực khuẩn lao nhưng không tiêu diệt được
chúng nên trực khuẩn lao vẫn tiếp tục sinh sản. Đại thực bào di chuyển theo
đường bạch huyết về hạch rốn phổi, đem cả trực khuẩn lao về hạch rốn phổi, gây
12 | P a g e


viêm hạch rốn phổi cùng bên. Đường bạch huyết cũng bị viêm theo cơ chế như
vậy. 3 yếu tố: xăng sơ nhiễm, viêm đường bạch huyết, và việm hạch rốn phổi
cùng bên, tạo thành phức bộ sơ nhiễm.
Khi di chuyển theo đường bạch huyết, một số trực khuẩn lao lọt vào dòng
máu, đa số chúng bị tiêu diệt, chỉ một số ít sống sót được nằm lại ở những nơi có
phân áp Oxy cao (đỉnh phổi , khớp, thận). Lúc này nếu sức đề kháng của cơ thể
giảm, trực khuẩn gây bệnh và tạo nên những huyệt lao lan tràn. Sự lan tràn trực
khuẩn lao thời kỳ này, gọi là lan tràn sớm (lan tràn tiền dị ứng). Phản ứng
Mantoux âm tính.
3.2.1.2. Quá trình đáp ứng đặc hiệu
Sau 2-8 tuần lễ, cơ thể bắt đầu sản xuất ra kháng thể và các tế bào miễn

dịch. (Lympho bào T, DTH) hình thành miễn dịch và dị ứng lao. Phản ứng
Mantoux dương tính. Miễn dịch xuất hiện. Nếu sức đề kháng tốt sẽ làm ngừng
sự lan tràn của trực khuẩn lao và gây hoại tử bã đậu, tạo nên môi trường có hại
cho trực khuẩn lao, đa số chúng bị chết. Sau đó tổn thương hấp thu đi, chỗ hoại
tử lắng đọng canxi và hình thành vôi hoá. Nếu sức đề kháng không tốt, trực
khuẩn lan tràn và chuyển thành lao hậu tiên phát. Nếu sức đề kháng không diệt
được hết trực khuẩn, một số chúng không hoạt động gọi là trực khuẩn lao “ngủ“,
sau này gặp điều kiện thuận lợi sẽ "thức dậy" hoạt động và thành lao hậu tiên
phát.
Đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với trực khuẩn lao là CMI (miễn dịch
qua trung gian tế bào) còn miễn dịch dịch thể chỉ có vai trò phụ. CMI diệt chúng
nhờ Lympho Th1 và đại thực bào, thông qua điều hoà miễn dịch. Đại thực bào
được hoạt hoá bởi IFN g (Inles feron g) và các Cytokin khác để diệt trực khuẩn
lao. LymphoT CD4 giữ vai trò nhạc trưởng trong đáp ứng miễn dịch tế bào.
Tăng cảm muộn (DTH) là biểu hiện do sự tương tác giữa CMI và trực khuẩn lao
xác định bằng test Tuberculin (phản ứng Mantoux).
13 | P a g e


3.2.2. Cơ chế lao hậu tiên phát
Đặc điểm lao hậu tiên phát
 Đã có miễn dịch chống lao một phần, phản ứng Mantoux dương tính từ
trước.
 Tổn thương xuất tiết tăng sinh. Nhiều xơ hoá, hay có hoại tử bã đậu hiếm
viêm hạch rốn phổi.
 Nhiều triệu chứng lâm sàng.
 Tiến triển từng đợt, bán cấp, mạn tính.
 Lan tràn theo đường tiếp cận hoặc đường phế quản là chủ yếu. Lan tràn
đường máu thường chỉ khu trú ở phổi, ít khi ra ngoài phổi.
 Thường gặp nhiều dạng tổn thương: cục nhỏ, nốt, thâm nhiễm, xơ hang,

hạt kê, ít gặp ngoài phổi.
 Thường khu trú ở thuỳ trên và phân thuỳ 6 của thuỳ dưới.
3.2.2.1. Lao tiên phát tiến thẳng sang lao hậu tiên phát
Do sức đề kháng của cơ thể giảm, trực khuẩn lao tiếp tục sinh sản, lan
tràn và phát triển thành lao hậu tiên phát ngay trong thời kỳ lao hậu tiên phát. Cơ
chế này hay gặp ở người đồng nhiễm lao / AIDS, do LymphoT CD4 giảm nhiều.
3.2.2.2. Tái hoạt động nội tại
Là cơ chế chủ yếu, BK nằm “ngủ" từ những tổn thương sơ nhiễm cũ, nay
do điều kiện thuận lợi, sức đề kháng cơ thể giảm, trự khuẩn lao “thức dậy" hoạt
động, sinh sản, phát triển thành lao hậu tiên phát. Thời gian tái hoạt động nội lai,
có thể từ vài tháng đến vài chục năm.
3.2.2.3. Tái nhiễm ngoại lai
Là mắc lao mới, sau khi lao sơ nhiễm đã khỏi, trực khuẩn lao mới xâm
nhập vào cơ thể và gây bệnh, làm xuất hiện tổn thương lao mới. Bằng kỹ thuật
14 | P a g e


RLFP (Restriction Rength Fragment Polymorphism: sự đa dạng chiều dài các
mảnh DNA bằng men hạn chế) người ta xác định được vào khoảng 30% mắc lao
theo cơ chế này.
3.3.

Lao kháng thuốc

3.3.1. Khái niệm
Kháng thuốc là khả năng sống sót và sinh sản của các chủng vi khuẩn lao
sau khi đã tiếp xúc với thuốc ở nồng độ có thể tiêu diệt hoặc ức chế vi khuẩn,
chúng sinh sản và chuyển tiếp được đặc tính đó cho thế hệ sau.
Bệnh lao kháng thuốc lần đầu tiên được xác định trong năm 2006. Bệnh
được phát hiện ở 57 quốc gia và gây khó khăn điều trị. Bệnh lao kháng thuốc

phổ biến ở Đông Âu , Liên Xô cũ, Trung Quốc và Ấn Độ và đang tăng lên ở
Châu Phi .
Bệnh lao kháng thuốc là trường hợp bệnh nhân lao phổi mang vi khuẩn
lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao.
 Kháng thuốc tiên phát (primary resistance): là những chủng M.
tuberculosis kháng thuốc xuất hiện ở bệnh nhân không có tiền sử điều trị
thuốc lao (hoặc thời gian điều trị ít hơn một tháng).
 Kháng thuốc mắc phải (acquired resistance): là những chủng M.
tuberculosis kháng thuốc xuất hiện ở bệnh nhân có tiền sử đã điều trị
thuốc lao với thời gian từ một tháng hoặc hơn.
 Kháng đa thuốc (multidrug resistance): Là hiện tượng vi khuẩn lao kháng
đồng thời tối thiểu hai thuốc INH và RMP. Đây là 2 thuốc có hiệu lực tiêu
diệt vi khuẩn lao mạnh nhất trong số các thuốc chống lao hiện nay.
 Kháng đa thuốc mở rộng (Extensively drug resistance - KĐTMR): là các
trường hợp BLKĐT có kháng với bất kỳ thuốc fluoroquinolone nào (dạng
thuốc tiêm hay uống) và kháng ít nhất một trong 3 thuốc hàng hai có thể
tiêm được (capreomycin, kanamycin, và amikacin).
15 | P a g e


3.3.2. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao
Kháng thuốc có thể là một đặc tính của một loài nguyên vẹn hoặc do đột
biến gen mắc phải hoặc do vận chuyển gen. Gen kháng thuốc nằm trên nhiễm
sắc thể của vi khuẩn và di truyền cho thế hệ sau. Hiện nay người ta đã xác định
được bản đồ gen và nhiều mã gen kháng thuốc của vi khuẩn lao Gen kháng
thuốc mã hoá thông tin từ đó vi sinh vật sử dụng để chống lại hiệu lực ức chế
đặc hiệu của kháng sinh theo các cơ chế sau đây.
 Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương.
 Làm thay đổi đích tác động.
 Tạo ra các isoenzym không có ái lực với kháng sinh nên bỏ qua tác động

của kháng sinh.
 Tạo ra enzym: các enzym do gen đề kháng tạo ra có thể biến đổi hoặc phá
huỷ cấu trúc hoá học của phân tử kháng sinh.
4. Cấu trúc phân tử (gene) và gene có ý nghĩa trong chẩn đoán
Bộ gen của vi khuẩn lao đã được giải trình tự vào năm 1998, có chiều dài
4411522 bp trong đó có 3924 bp trình tự được dự đoán mã hóa cho protein, tỉ lệ
G+C chiếm đến 65,6%. Bộ gen của của vi khuẩn lao có tới 90,8% trình tự mã
hóa protein và chỉ có 6 gen giả.

16 | P a g e


Hình 3 : Cấu trúc gen một số chủng vi khuẩn lao ()
Trong chẩn đoán phân tử, gen có ý nghĩa trong việc chẩn đoán là gen
IS6110, đây là một đoạn gen ngắn có tính đặc trưng cho loài Mycobacterium

tuberculosis gây bệnh lao trên người, mà không không có ở các loài
khác.
Gen IS6110 phân bố rải rác nhiều nơi trong bộ gen. Đây là đoạn gen có
tính bảo tồn cao. Các phương pháp PCR, real-time PCR phát hiện vi khuẩn lao
đều dựa trên tín hiệu khuếch đại vùng tín hiệu này.
5. Vắc xin BCG và các công trình nghiên cứu
Vắc xin BCG để phòng bệnh lao ở trẻ. Vắc xin BCG có dạng bộtvàcó
dung môi pha hồi chỉnh kèm theo. Trước khi sử dụng phải hòa tan vắc xin
vớidungmôi đi kèm. Sau khi pha hồi chỉnh, nó phải được bảo quản ở nhiệt độ
2°C đến8°C. Phần vắc xin còn lại trong lọ sau mỗi buổi tiêm chủng hoặc sau 6
giờ phải hủy bỏ.
Phần lớn trẻ em đều có phản ứng tại chỗ tiêm. Thông thường,ngaysau khi
tiêm vắc xin BCG, thường xuất hiện nốt nhỏ tại chỗ tiêm và biến mấtsau30 phút.
Sau khoảng 2 tuần, xuất hiện một vết loét đỏ có kích thước bằng đầubútchì. Sau

đó 2 tuần, vết loét tự lành để lại một sẹo nhỏ có đường kính 5mm.Điềuđó chứng
tỏ trẻ đã có miễn dịch.
Những phản ứng khác:
Sưng hoặc áp-xe. Có thể nổi hạch ở nách hoặc khuỷu tay, mộtsốtrường
hợp dẫn đến áp-xe. Nổi hạch hoặc áp-xe thường xảy ra do sử dụng bơmkimtiêm
không vô trùng hoặc tiêm quá nhiều vắc xin, phổ biến nhất là thay vìtiêmtrong
da thì lại tiêm dưới da.

17 | P a g e


Có rất ít phản ứng nặng sau tiêm BCG. Có khoảng1/1.000.000trường hợp
bị nhiễm lao sau tiêm BCG, hay xảy ra ở những trường hợpnhiễm HIVhoặc
những trường hợp thiếu hụt miễn dịch nặng.
Tóm tắt tiêm chủng vắc xin BCG
Loại vắc xin

Sống giảm độc lực

Số liều

1 liều

Lịch tiêm

Ngay sau khi sinh càng sớm càng tốt

Liều nhắc lại Không
Chống chỉ địnhCó dấu hiệu và triệu chứng của AIDS
Phản ứng sauÁp-xe tại chỗ, nổi hạch, hiếm gặp hơn là viêm tủy, nhiễm bệnh

tiêm

lao

Chú ý đặc biệt

Tiêm trong da chính xác. Sử dụng bơm kim tiêm riêng để
tiêm vắc xin BCG

Liều lượng

0,1ml

Vị trí tiêm

Mặt ngoài phía trên cánh tay hoặc vai trái

Đường tiêm

Trong da

Bảo quản

Ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C

Vắc xin BCG có những hạn chế do đó người ta đang nghiên cứu các loại
vắc xin TB mới. Một số ứng viên protein hiện đã được thử nghiệm lâm sàng ở
pha 1 và 2. Hai phương pháp chính đang được sử dụng là cố gắng cải thiện hiệu
quả của các loại vắc xin có sẵn. Phương pháp thứ nhất liên quan đến việc thêm
một tiểu đơn vị vắc xin bào BCG, trong khi phương pháp còn lại đang cố gắng

tạo ra các loại vắc xin sống mới và tốt hơn. MVA85A, là một loại vắc xin ví dụ
cho trường hợp đầu, hiện đang trong vòng thử nghiệm tại Nam Phi, dựa trên một
loại vi-rút vaccinia bị biến đổi gen. Các vắc xin được hy vọng là có vai trò quan
trọng trong việc điều trị cả giai đoạn ủ và phát bệnh.

18 | P a g e


Để khuyến khích các nghiên cứu đi xa hơn, các nhà nghiên cứu và nhà
làm chính sách đang thúc đẩu những mô hình kinh tế mới trong việc phát triển
vắc xin, như các giải thưởng, ưu đãi về thuế, và các cam kết thị trường. Một số
tập đoàn, bao gồm Stop TB Partnership, Tuberculosis Vaccine Initiative Nam
Phi, và Aeras Global TB Vaccine Foundation, đã tham gia nghiên cứu. Trong
số này, Aeras Global TB Vaccine Foundation đã nhận được một phần thưởng trị
giá hơn 280 triệu đô-la từ Bill and Melinda Gates Foundation để phát triển và
cấp giấy phép cho một loại vắc xin cải tiến ngừa bệnh lao được sử dụng ở những
quốc gia có gánh nặng cao.

III.

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

1. Chẩn đoán thông thường
1.1.

Chẩn đoán lâm sàng

Tuy chẩn đoán lâm sàng không cho chính xác kết quả bênh nhân nhưng
đây là bước rất quan trọng để đưa ra phán đoán và phương pháp chẩn đoán cụ
thể.

Một số dấu hiệu lao lâm sàng:
 Ho kéo dài trên 2 tuần (ho khan, ho có đờm, ho ra máu) là triệu chứng
nghi lao quan trọng nhất.
 Gầy sút, kém ăn, mệt mỏi.
 Sốt nhẹ về chiều.
 Ra mồ hôi “trộm” ban đêm.
 Đau ngực, đôi khi khó thở.
1.2.

Xét nghiệm đờm tìm trực khuẩn lao (phương pháp soi trực tiếp).

19 | P a g e


Chẩn đoán lao phổi bằng xét nghiệm đờm tìm trực khuẩn lao là biện pháp
rất cơ bản lại rất đơn giản, rẻ tiền rất phù hợp với hoàn cảnh và điều kiện của các
nước nghèo, các nước đang phát triển.
Thông thường nhuộm theo phương pháp Ziehl – Neelsen hoặc phương
pháp huỳnh quang với ánh sáng cực tím.
Cần làm xét nghiệm nhiều lần, ít nhất 3 lần trong 3 buổi sáng liên tiếp.
Nếu bệnh nhân không khạc được đờm thì cho bệnh nhân dùng nước muối 5% ưu
trương để lấy bệnh phẩm.
Khi người bệnh nghi bị lao đến khám, phải lấy đờm 3 lần mỗi lần một
ngày khác nhau để xét nghiệm tìm trực khuẩn lao. Các mẫu lấy như sau:
Mẫu 1: lấy đờm tại chỗ khi bệnh nhân đến khám.
Mẫu 2: sau khi lấy đờm tại chỗ để có xét nghiệm đờm lần thứ nhất, người bệnh
được giao cho một cốc đựng đờm để sáng sớm hôm sau khi mới ngủ dậy lấy
mẫu đờm đưa đến phòng khám (xét nghiệm đờm lẫn thứ hai).
Mẫu 3: Lấy khi bệnh nhân đến đưa mẫu đờm lần 2.
Bệnh nhân phải được điều trị ngay nếu:

Kết quả xét nghiệm có 2 lần dương tính trở lên.

1.3.

X-quang

Là phương pháp quí báu góp phần chẩn đoán lao phổi. X-quang có độ
nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp trong chẩn đoán lao phổi. Nhiều bệnh có hình
ảnh X- quang phổi giống lao phổi, lao phổi ngược lại cũng có hình ảnh dễ nhầm
lẫn với các bệnh phổi khác.

20 | P a g e


Mặt khác khó phân biệt tổn thương ở phổi do lao cũ đã ổn định hay lao
mới đang tiến triển. Vì thế X-quang không phải là yếu tố quyết định trong chẩn
đoán lao phổi.
Ngày nay với đại dịch nhiễm HIV/AIDS lan tràn tổn thương lao ở phổi, ở
những người lao phổi nhiễm HIV/AIDS thay đổi nhiều so với những hình ảnh
được mô tả trước đây (tổn thương lao cổ điển mà nói chủ yếu khu trú ở đỉnh
phổi, tổn thương hang v.v...) để chẩn đoán lao phổi phải phối hợp nhiều biện
pháp, kết hợp nhiều yếu tố trong đó có chụp X-quang.
Các hình ảnh Xquang phổi nghi ngờ lao phổi:
 Đám mờ không đồng đều ở vùng đỉnh hoặc vùng dưới xương đòn hai phổi
(một hoặc hai bên).
 Hình hang: Có thể một hoặc nhiều hang (lao hang).
 Những nốt, chấm mờ nhỏ như hạt kê, đường kính 1mm lan toả cả hai phổi
(lao kê).
 Bóng mờ đặc tròn hoặc bầu dục ở góc ngoài hạ đòn hoặc hạ phân thuỳ 6
(thâm nhiễm Assman).

 Những bóng mờ ở rốn phổi và trung thất do hạch lympho sưng to.
 Có một vài nốt hoặc nhiều nốt to nhỏ khác nhau đường kính 3 – 10mm
đậm độ không đều, thường gặp ở hạ đòn và đỉnh phổi một hoặc hai bên
(lao nốt).
 Đám mờ hình thuỳ phổi (tam giác) có thể ở bất kỳ vị trí nào nhưng thông
thường thấy ở thuỳ trên và thuỳ giữa.
Nuôi cấy đờm

1.4.

Làm tăng kết quả dương tính nhưng nếu nuôi cấy bằng phương pháp cổ
điển phải mất 4 – 8 tuần mới có kết quả. Ngày nay, người ta tiến hành nuôi cấy
vi khuẩn lao bằng phương pháp MGIT Bactec cho kết quả nhanh sau 1-2 tuần.
21 | P a g e


Với những trường hợp bệnh nhẹ, ít trực khuẩn, soi trực tiếp có thể cho kết quả
âm tính nhưng nuôi cấy đờm sẽ cho kết quả dương tính. Trong khi chờ đợi kết
quả nuôi cấy cần quyết định việc điều trị căn cứ vào triệu chứng lâm sàng và
phim X quang.
1.5.

Phản ứng tuberculin (Mantoux)

Phản ứng tuberculin thể hiện phản ứng dị ứng của cơ thể đối với trực
khuẩn lao. Phản ứng tuberculin dương tính thể hiện trong cơ thể người được
làm phản ứng đã có lúc nào đó bị nhiễm trực khuẩn lao.
Phản ứng tuberculin âm tính thể hiện cơ thể người được làm phản ứng
chưa có dị ứng với trực khuẩn lao, chưa từng nhiễm trực khuẩn lao hoặc do cơ
thể quá yếu, suy kiệt, suy giảm khả năng miễn dịch nên mặc dù đã nhiễm trực

khuẩn lao cơ thể cũng không có phản ứng được.
Như vậy theo dõi sự chuyển phản ứng tuberculin từ âm tính sang dương
tính có thể suy đoán được tình hình cơ thể đã bị nhiễm lao chưa. Nếu theo dõi sự
chuyển phản ứng tuberculin trong cộng đồng dân cư hàng năm, có thể tính được
số mới bị nhiễm lao hàng năm trong tập hợp dân cư đó.
Phản ứng tuberculin âm tính thường gặp trong những trường hợp sau:
+ Suy giảm miễn dịch, nhiễm HIV/AIDS.
+ Dùng corticoid kéo dài
+ Suy dinh dưỡng, suy kiệt
+ Đẻ non, thiếu tháng
+ Người già
+ Nhiễm virus (sởi, cúm, thuỷ đậu...)
+ Ung thư, ốm dài ngày, bệnh nặng, nhiễm khuẩn nặng.

22 | P a g e


Nói chung phán ứng tuberculin có giá trị chẩn đoán nếu trước đó bệnh
nhân đã làm phản ứng nhưng kết quả âm tính (giá trị chẩn đoán nằm trong tình
trạng chuyển phản ứng).
Ở những nơi có chỉ số nguy cơ nhiễm lao cao, bệnh lao phổ biến và trên
các trẻ em đã được tiêm chủng BCG, phản ứng tuberculin chỉ có giá trị hạn chế
khi dùng để chẩn đoán tình trạng nhiễm lao.
Có nhiều loại tuberculin nhưng quan trọng nhất là hai loại tuberculin
PPD (purified protein derivative) sau:
 PPD-S được công nhận là PPD tiêu chuẩn quốc tế của tuberculin loài có
vú.
 PPD-RT23 là một lô rất lớn loại tuberculin tinh khiết, sản xuất năm 1958
và được dùng rộng rãi trong nghiên cứu trên thế giới. Một đơn vị PPDRT23 tương đương 3 đơn vị quốc tế PPD-S. Trong chẩn đoán hoặc điều
tra dịch tễ thường sử dụng 2 đơn vị RT23.

Thường tiêm tuberculin trong da ở phần dưới của 1/3 trên mặt trước cánh
tay trái. Không vô khuẩn da bằng aceton hay ether. Dùng bơm tiêm tuberculin
và kim tiêm trong da số 26 dài 10 mm tiêm 0,1 ml dung dịch tuberculin tiêm
trong da tạo nên cục sần đường kính 5-6 mm. Nếu không nổi cục sần là tiêm sai
kỹ thuật.
Kết quả đọc sau 48-72 giờ.
Ngoài ra còn một số chẩn đoán thông thường khác để chẩn đoán bệnh
lao như xét nghiệm máu, lấy dịch dạ dày…
2. Chẩn đoán phân tử
2.1.

PCR

2.1.1. Định nghĩa
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các
23 | P a g e


đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa
ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực
hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu
nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định
giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định
hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….
2.1.2. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay còn gọi là PCR là
một phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào một sợi DNA đơn khác làm
khuôn và một đoạn oligonucleotide làm mồi. Sợi DNA đơn được tổng hợp
nên có trình tự bổ trợ với sợi khuôn.

Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase và
sợi biến tính của phân đoạn DNA lớn được dùng làm sợi khuôn. Kết quả là
tổng hợp các sợi DNA mới bổ trợ cho các sợi khuôn bố mẹ. Những sợi mới
này có đầu 5’ (chính là đầu 5’của mồi oligonucleotide), trong khi đó đầu 3’
thì chưa xác định được độ dài.
Quá trình tổng hợp định hướng theo oligonucleotide của các sợi
DNA con có thể được nhắc lại nếu sợi kép mới được biến tính (bằng nhiệt) và
mồi bổ sung được phép gắn vào sợi khuôn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích
hợp). Các bước này bao gồm: a) biến tính, b) gắn mồi, c) kéo dài mồi tạo ra
một chu kỳ trong phương pháp khuếch đại PCR.
Sau mỗi chu kỳ sợi DNA mới tổng hợp có thể làm khuôn trong chu kỳ
tiếp theo. Một sợi trong sợi mới được tổng hợp từ chu kỳ 2 trở đi có đầu 5’ và
3’ được xác định tại vị trí gắn mồi oligonucleotide. Sau n chu kỳ, sự khuếch
đại các phân đoạn tuân theo quy luật sau: 1) chỉ có 1x bản sợi khuôn ban đầu
(sợi kép 2 –dna-), PCR không bao giờ tái tạo được sợi dài như sợi khuôn,
trừ trường hợp hai mồi nằm ở tận cùng hai đầu sợi khuôn. 2) Có n sợi đơn mỗi
24 | P a g e


loại (-dna và dna-) với độ dài không xác định, trong đó n là số chu kỳ. Những
phân đoạn có độ dài không xác định này có một đầu được giới hạn bởi mồi
PCR còn đầu kia không xác định. 3) Có [2n – (n+1)] bản sao sợi đơn mỗi loại
(dna xuôi và ngược) có độ dài xác định giữa hai mồi PCR.
2.1.3. Chu trình nhiệt
 Biến tính

Thường biến tính 0.5-2 phút ở 94-95oC là đủ, do sản phẩm PCR
được tổng hợp ở chu kỳ khuếch đại thứ nhất ngắn hơn đáng kể so với khuôn
DNA ban đầu và được biến tính hoàn toàn dưới các điều kiện này. Nếu DNA
khuếch đại có hàm lượng GC rất cao, thời gian biến tính có thể được tăng lên

3-4 phút.
 Gắn mồi
Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp hơn 5oC so với nhiệt độ
nóng chảy của sợi kép mồi-khuôn DNA. Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút
là đủ. Tuy nhiên, nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thu được ngoài sản phẩm
mong đợi, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước 1-2oC.
 Kéo dài
Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) được thực hiện ở 70-75oC. Tốc độ
tổng hợp DNA bằng Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này.
Thời gian tổng hợp phân đoạn PCR dài 2 kb được đề xuất là 1 phút. Khi
khuếch đại các phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp được tăng lên 1
phút cho mỗi kb.
2.1.4. Quy trình
 Pha hỗn dịch Mix
25 | P a g e