Các phương pháp giải trình tự DNA (sequencing)

L^:j

!

!Kv

í? _
Destroy
bases T and c
ơ)

- Chụp ảnh kết quả điện di bằng phương pháp phóng
CÁC PHƯƠNG PHÁP
xạ tựGIẢI
ghi. So sánh kết quả thu được ở các mẫu
khác nhau theo 4 nhóm.
Destroy
TRÌNH Tự DNA
base c
(a) DNA
(9)

( SEQUENCING)
Pỉ
Radioacỉiv
I. Phương pháp hóa hoc( Maxam và Gilbert): Radioactive label (32p)
e 1. Nguyên lý:__________________________ 5'
iabel
- Các đoạn DNA ( hoặc...
gene) có số lượng trình tự

m 5 .........................
nucleotide giống nhau được đánh dấu bằng đồng vị
Testtube! phóngTest
tube
2 5’. Các
Testtube3
xạ p32
ở đầu
đoạn DNA đã mang
dấutube 4
Test
phóng xạ được chia làm 4 nhóm. Mỗi nhóm được xử lý
bằng các chất hóa học, hoặc hỗn hợp hóa học khác nhau
nhằm bẻ gãy các đoạn DNA ở các vị trí khác nhau ở 1
hay 2 loại base N khác nhau.
-^•Sau khi xử lý tạo thành các đoạn DNA bị cắt ngẫu nhiên
có kích thước khác nhau.
- Bốn nhóm sau khi cắt được đem đi điện di trên gel
polyacrylamide và thu được các băng DNA khác nhau
theo thứDestroy
tự. Tùy theo đoạn nucleotide dài, ngắn khác
Destroy
nhau bases
sẽ thu được
base G
A andtrật tự băng khác nhau. Các đoạn
G chạy nhanh nên ở xa điếm xuất phát.
nucleotide ngắn
Các đoạn nucleotide dài chạy chậm nên ở gần điểm
(d)

xuất phát. Nhờ phương pháp phóng xạ tự ghi, ta thu
d I 1 1 M I r 1G| I I I I ỊGỊ
I các băng khác nhau trên bảng gel sau điện di.
được
S
(e)
•• %••• h
2. Các bước giải trình tư theo phương pháp Maxam- Gilbert: •••••*•••
d I I I ỊG| I I |G| I I I II
or
- Tách chiết DNA
từ các mẫu nghiên cứu.
Ịgn
te
r ------------------- Cắt DNA từ các mẫu và tạo các đoạn DNA giống
L
Destroyed
nhau bằng kỹ thuật tạo dòng DNA (cloning).
o
n
»5’ của
4 -#các
4 ■đoạn
Gắn
dồng
vị
phóng
xạ
p32
vào

đầu
d I I I |G| rn ...................................................
g
DNA.
er
- Xử lý hóa chất thành 4 nhóm riêng biệt sao cho
mỗi đoạn nucleotide chỉ bị hỏng ở một base N —»
• •chiều
1
Mỗi nhóm chứa một số đoạn nucleotide có
v:\Mw
crrm bai I I |G| I I 1 nõn dài khác nhau.
- Điện di sản phẩm của 4 nhóm trên gel
polyacrylamide. Đoạn nucleotide ngắn sẽ chuyển
động xa hơn, ngược lại đoạn nucleotide dài sẽ
chuyển động chậm và ở gần điếm xuất phát.


S
h
or
te
r
<
4----------------------------------L
o
n
g
er

So’ đồ các bước giải trình tự bằng phương pháp Maxam- Gilbert


w.

GCGARTGCGTCCAC
ARCGCTRC
GCGRRTGCGTCCRC
RRCGC
GCGRRTGCGTCCRC
RRC
• GCGRRTGCGTCCRC

GA CT
A quả các
c phóng
- Thu
băng
pháp
xạ tự
lại. kết
Người
ta chỉ
bổbằng
sungphương
các ddNTP
với nồng
độ
ghi: Chụp
và phân

tích kết
tiếngắn
hành
khoảng
1%ảnh
so với
các dNTP.
Doquả.
vậyCó
khảthể
năng
kết
giải trình
tự cả
mạch của
DNA
để tránhTừ
saiđó
sót.sẽ
liên
kết với
các2 dNTP
nhiều
hơnkhuôn
với ddNTP.
GCGRRTGCGTCC
cho
các
đoạn
polynucleotide

dài
ngắn
khác
nhau.
Neu
5'
■ri- ĩ
= . ...........
llll
G
T
A
G
A
C
T
C
G
A
GCGRRTGCGTC
chia làm
việcG
bổCsung
1%
loại ddNTPTA
'AÉtk'
CC
Gcác
CA
40 -4 nhóm với A

A
r
T H
GCGRRTGC
H di sẽH
±1
Hđiện
==
(riêng biệt) khi chạy điện
được
4 .bảng
di
khác nhau. Các băng DNA xác định được nhờ việc gắn
11
đồng vị phóng xạ vào mồi hoặc vào các dideoxy.
1234 567 89 10
2. Các bước tiến hành:
H
- Biến tính
M
20- DNA, bổ sung mồi có đánh dấu phóng xạ p32
HA
TaqDNApolymerase, bố sung đủ các loại dNTP cho
H
H T
vào dung dịch đệm thích hợp để thực hiện phản ứng
H
H
tổng hợp DNA, sau đó chia làm 4 lô (4 ống eppendorg).
B

D
H
- Bổ sung vào mỗi lô 1 loại ddNTP với tỷ lệ 1%. Với tỷ
H
H
H
lệ này thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được gắn ngẫu
H A
c
nhiên.( Nếu
T
H
c không đánh dấu bằng p32 ở mồi thi có thể
H
H
dánh dấu p32 ở ddNTP).
10H cH
HH T
HHA
HT
H
H
G
“ T
H
H
c
stra
3*
DNA

n
5*
H
template
d
c T
G o
cG
A TU|
Ac
TG
AA G
c G
G 1AG
5 6 87 fi 10
234 667
A
primer H
H
»
H
Kết
quả giải trình tụ’
cG
c c A
A
G
G TAG
c
T

c
G
H
~
5'
A
ATA c
H
II. PhưoTig pháp
dideoxy:
DNA
H =
ddTTP
polymerase
1
Hĩ
4 ddCTP
đNTPs
1. Nguyên lý:
H
♦ ddATP
- Sử dụng enzymeJ»
DNA polymerase và các dideoxy.
Dideoxy là các nucleotide mất cả 2 nhóm OH ở vị trí
cacbon số 2 và 3 trên phân tử đường pentose.
- DNA polymerase xúc tác cho việc kéo dài chuỗi
Kết quả điệnkhi
di phản
ứng
dideoxy với ddCTP

polynucleotide
gặp các
dideoxynucleotide
(ddNTP)
- Điện
di
các
nhóm
phản
ứng
bằng
phương
pháp
điện
thì dừng lại. Do vậy các đoạn polynucleotide sẽ códi
trên
chiềugel
dàipolyacrylamide
khác nhau. ở điều kiện biến tính đế được
các
băng
của
- Đầu 3’OII cầncác
chođoạn
việcoligonucleotide
hình thành liên có
kếtkích thước
khác
nhau.
phosphodiester

ở chuỗi polynucleotide đang hình thành
với các nucleotide kế tiếp. Việc thiếu nhóm 3’OH ở
dideoxynucleotide dẫn đến chuỗi polynucleotide dừng
HI


Khi sử dụng 4 loại dideoxynucleotide (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)
có 4 màu khác nhau thì có thế giải trình tự mẫu nghiên cún trong 1 phản
ứng (1 giếng điện di) thay vì 4 phản ứng (trong 4 giếng riêng biệt) như
phưong pháp dideoxy của Sanger. Phần mềm máy tính sẽ tự động giải
trình tự dữ liệu từ gel điện di và cho hình ảnh kết quả giải trình tự DNA.
2. Các bước tiến hành:
♦ Thành phần gồm:
- DNA mẫu chứa khoảng 1010 phân tử, hoặc 1010 đoạn DNA dài khoảng
103-104bp.
- Các deoxynucleotide (dNTP).
- 4 loại dideoxynucleotide (ddNTP) có gắn màu huỳnh quang khác
nhau, mỗi loại gắn một màu riêng biệt.
- Các enzyme cần thiết.
- Dung dịch đệm.
- Mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho đoạn cần nhân bản. Thể tích
chung cho mỗi phản ứng là 20microlit
♦ Tiến hành chạy PCR theo 3 bước chính:
- Biến tính DNA ở 96°c làm cho DNA kép thành mạch đon.
- Gắn mồi ở 50°c.
- Kéo dài chuỗi polynucleotide ở 60°c.

Kết quả điện di phản ứng dideoxy vói ddNTP

III.Giải trình tư DNA tư đông:

/. Nguyên lý:
Dựa theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải tiến dựa vào các
thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác hơn. Sự tự động hóa đã cải tiến
tốc độ giải trình tụ’ của mẫu, đặc biệt có ý nghĩa cho việc giải trình tự các
khuôn mẫu lớn.
Người ta không đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ mà đánh dấu bằng
chất huỳnh quang. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng 1
chất huỳnh quang (íluouchrome) có màu khác nhau —» Các phân đoạn
DNA được đánh dấu phân biệt bởi các màu khác nhau.


♦ Thực hiện khoảng 25 chu kỳ. Giữ phản ứng PCR ở 45°c trong 10 phút
hoặc đế qua đêm.


’ Denaturation,
annealing
V

Nhân dòng bằng PCR
Sản phẩm PCR được loại bỏ chất thừa. Ket tủa DNA bằng
ethanol/EDTA.
Hòa tan kết tủa sạch (bằng 15microlit HiDiFormamide do các hãng
sản xuất cung cấp).
Sau khi hòa tan kết tủa thì tiến hành điện di trên gel polyacrylamide.
Ket quả thu được nhờ máy đọc trình tự và được xử lý bằng các phần
mềm chuyên dụng.


TNNNNẦAT

ữCCAAĩ
ACOT Q
AC^CACT
rO
co Agct coo • ACC^OQOO
UCCTC1 to «0'
co A£C
C A Q O C AA^1. AOOgCO
o C A A o Ac AT
T T

»1
HAĨãi. 1 1 i
^^Jrl A .IYVẲ.IUJ I \ li .1 Li i \iỉí 1/1
11 * * 1
.
Ĩ
k
OQ
TC
C TẠfTATA
QC
T 1T0O
^^
0ỌTAAAT
C AT
P T
c rẠp
A T
TA

CẲ C
*UpT
ICC
ro
A AT
T^O
T

Một kết quả giải trình tự DNA tự động
IV Tài liêu tham kháo:
1. TS.Trịnh Đình Đạt. Công nghệ sinh học tập IV. Nhà xuất bản giáo
dục(Trang 55-60)
2. www.nucleics.com
3. www.biochem.arizona.edu
4. www.mod
ares.ar.ir