Phương pháp giải trình tự gen doc

BỘ CÔNG THƯƠNG
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI BÁO CÁO
ĐỀ TÀI BÁO CÁO
:
:
LỚP: DHSH07LT
SVTH: Nhóm 15
GVHD: Th.s Trần Hồng Bảo Quyên
1.Nguyễn Thanh Diệu
2.Trần Thị Tha La
3.Nguyễn Thị Cẩm Nương
4.Nguyễn Thị Phương
5.Dương Chí Sơn
6.Đinh Thị Yến Thi
7.Trần Văn Thiết
8.Trần Trung Thịnh
NỘI DUNG
1. Khái niệm giải trình tự gen và ý nghĩa của GTTG
2. Phương pháp giải trình tự gen:
2.1 Phương pháp Maxam – Gilbert
2.2 Phương pháp Sanger
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
3. So sánh phương pháp Maxam–Gilbert và Sanger
4. Ứng dụng
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là

phương pháp xác định vị trí sắp xếp
các nucleotid trong phân tử DNA.
1.1.Khái Niệm:
1.2 Ý nghĩa
Giúp xác định vị trí của gen trên
NST, cho phép kết luận về bản chất
của gen. Có ý nghĩa trong việc tìm
hiểu những chức năng cấu trúc của
gen cũng như các dòng gen.
5’OH
5’OH
P
32
, ATP,
enzyme
3’
3’
90
o
C
DNA đánh dấu
P
32
P
32
P32
Tách lấy mạch
đơn
Điện di phân tách
các mạch đơn

Nguyên lý: Thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần
xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.
Bước 1:
- Đánh dấu phóng xạ P32 ở
đầu 5’ của mạch khuôn.
- Biến tính bằng nhiệt độ.
- Điện di tách lấy một mạch
DNA làm mạch khuôn, dùng
mạch khuôn này cho các xử
lý tiếp theo.
Các bước thực hiện
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu
Có thể sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phản
ứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA
cắt dài ngắn khác nhau.
Ống 1 Hóa chất xử lý Vị trí cắt
1 Dimethyl sunrfat pH 8 G
2 Piperidine formate pH2 A và G
3 Hydrazine C và T
4 Hydrazine + Nacl 1,5M C
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong
mỗi ống nghiệm đem chạy điện di,
hiện hình phóng xạ và xác định kết
quả.

Ví dụ: Xử lý Dimethylsunfat ở ống
phản ứng 1, phản ứng cắt tại G.
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
32
P ATCG
32
P ATCGCCAG
32
P ATCGCCAGTTG
32
P ATCGCCAGTTGTACCAG
32
P ATC
32
P ATCGCCA
32
P ATCGCCAGTT
32
P ATCGCCAGTTGTACCA
Trình tự gen ban
đầu
Sau khi xử lý bằng
DMSO
4
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
Bước 4: Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các
ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dài
ngắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác định

được trình tự của DNA mạch khuôn.
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
2.1 Phương pháp Maxam - Gibert
Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ
sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động
của enzyme DNA Polymerase. Với việc sử
dụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và
các deoxynucleotid thông thường.
2.2 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
Việc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lại do
ddNTP không có khả năng hình thành liên kết
phosphodieste .
2.2 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
Vật liệu:
- Primer( 20 nucleotides)
- DNA polymerase
- DNA template
- dNTP và ddNTP
- Vật liệu đánh dấu
- Hệ thống điện di
Các bước tiến hành
Bước 1: Biến tính DNA khuôn
Điện di trên gel polyacrylamid để thu các mạch
đơn DNA, dùng DNA này để tiến hành các
bước xử lý tiếp theo.
2.2 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp

DNA
Lấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phần
cần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn, mồi có
đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA
polymerase, dNTP, dung dịch đệm thích
hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một
loại ddNTP nhất định.
2.1 Phương pháp Sanger
2.1 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp
DNA
Bước 4: Điện di kết quả, so sánh kết quả
các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp
để xác định trình tự của mạch khuôn.
2.2 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
ddTTP
2.2 Phương pháp Sanger
2.2 Phương pháp Sanger
Nguyên lý: Hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc
sử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh.
Mồi và dNTP được đánh dấu huỳnh quang.
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
Mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác
nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau.
Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới
trên cả 2 mạch khuôn DNA, sử dụng phần mềm

trên máy tính để xử lý kết quả.
Bước 1: Chuẩn bị (DNA khuôn, các dNTP và
ddNTP có gắn màu quỳnh quang, enzyme,
mồi…)
Bước 2: Nhân DNA bằng PCR
Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải
trình tự gen và chạy máy giải trình tự gen.
Bước 4: Phân tích kết quả từ các dữ
liệu do máy tính cung cấp
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
Đầu đọc laser trong máy kích hoạt các chất phát
quỳnh quang khiến chúng hấp thụ và phát ra các
màu, mỗi màu ứng với một nucleotide và được
hiển thị bằng một đỉnh.
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
Đọc kết quả
ABI Automated Sequencers (contd.)
ABI Automated Sequencers (contd.)
ABI 310
ABI 3700
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động
Capillary
Máy sắc ký khối phổ
3. So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger
3. So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger

Đặc điểm
Maxam – Gibert
Maxam – Gibert
Sanger
Sanger
Giống nhau
+ Hình thành một tập hợp nhiều
oligonucleotide có chiều dài khác nhau
+ Các trình tự này được phân tách bằng
phương pháp điện di trên gel polyacrylamid
+ Kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự
ghi
Khác nhau
+ Dùng các chất hóa
học để làm cắt các
base
+ Dùng enzyme và
các ddNTP để làm
dừng quá trình tổng
hợp ADN
3. So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger
3. So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger
Maxam – Gibert
Maxam – Gibert
Sanger
Sanger
Ưu điểm:
+ Phương pháp dễ tiến hành
+ Chi phí thấp
Ưu điểm:

+ Các bước tiến hành đơn giản
+ Có độ chính xác cao
+ Là cơ sở của các máy giải
trình tự gen tự động
Nhược điểm:
+ Độ chuẩn xác không cao
+ Phải thực hiện nhiều lần và
loại bỏ các sai sót để chọn các
kết quả gần đúng nhất
Nhược điểm:
+ Chỉ đọc được một đoạn trình
tự ngắn