ĐỀ tài nảy mầm TRONG ỐNG NGHIỆM và bảo tồn LOÀI LAN dược LIỆU CYMBIDIUM ALOIFOLIUM (l ) SW THÔNG QUA hạt NHÂN tạo

TRÂN TRỌNG KÍNH CHÀO CÔ VÀ CÁC BẠN


Nhóm 6
Gồm các thành viên:
1. Phạm Tiến Dũng
B1303649
2. Nguyễn Văn Phúc
B1303706
3. Võ Huỳnh Kim Ngọc
B1303817
4. Phạm Thị Thúy Quyên B1303837
5. Đỗ Đình Thao
B1303719


BÁO CÁO NUÔI CẤY MÔ
CHỦ ĐỀ:
HẠT NHÂN TẠO -ARTIFICIAL SEED

CBHD: TS. NGUYỄN THỊ PHA


ĐỀ TÀI: NẢY MẦM TRONG ỐNG
NGHIỆM VÀ BẢO TỒN LOÀI LAN DƯỢC
LIỆU CYMBIDIUM ALOIFOLIUM (L.) SW.
THÔNG QUA HẠT NHÂN TẠO
MỤC LỤC
1. Giới thiệu
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Nguồn cấy

2.2 Môi trường ươm
2.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate
2.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo
2.5 Khử trùng và kiểm tra khả năng nảy mầm
của hạt nhân tạo sau khi bảo quản
2.6 Làm cứng cây
3. Kết quả
4. Thảo luận


1. Giới thiệu
• Đa dạng về chủng loài, hình thái.

• Có giá trị cao về kinh tế và đời sống.


1. Giới thiệu
• Cymbidium aloifolium L.
Sw (C. aloifolium) là một
trong những loài lan dược
liệu có giá trị cao và bị đe
dọa của Nepal.
• Chữa được nhiều bệnh: bại
liệt, bỏng, lở loét…
• Đang được tạo hạt giống
nhân tạo bằng phương pháp
nuôi cấy mô.


2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Nguồn cấy:
- Những quả phong lan được khai thác ở độ cao 500m từ khu
vực nhiệt đới miền Trung Napal, sau khi hái về sẽ được rửa
bằng nước sạch ít nhất 30 phút để loại bỏ các hạt bên ngoài.
- Sau đó đem đi rữa bằng chất tẩy Tween 20 (0.1%) trong 15
phút và rửa lại bằng nước để loại bỏ hoàn toàn chất tẩy rửa.


- Sau đó các quả này được cắt và được khử trùng bằng cách
ngâm vào cồn 70% trong 2 phút,dung dịch sodium
hypochlorite 1 % 15 phút và rửa lại bằng nước vô trùng ít
nhất 3 lần.
- Những quả đã vô trùng này sẽ được sấy khô trên giấy lọc
Whatman và chẻ theo chiều dọc để lấy ra hạt giống.
- Sau đó trải đều hạt giống này vào môi trường Murashige và
Skoog (MS) trong điều kiện vô trùng trong 10 tuần sẽ phát
triển thành Protocorm.


2.2. Môi trường ươm:
Sự nảy mầm và sự phát triển của hạt giống nhân tạo được
đánh giá về sự tác động khác nhau của các môi trường MS
lỏng: đầy đủ 1.0 ; 0.5 ; 0.25 và 1.0 có sự bổ sung của chất điều
hòa sinh trưởng ( 0.5 mg/l BAP và 0.5 mg/l NAA).
Bảng 1: Sự nảy mầm và phát triển của hạt giống nhân tạo có
chứa protocorm của phong lan.

Số liệu của mầm, lá, rễ và cây giống được thể hiện dưới dạng
trung bình ± SD của 6 lần lặp lại được sử dụng trong mỗi điều
kiện.

Môi trường MS được bổ sung đường sucrose 3% và pH của môi
trường được điều chỉnh lên 5.8 trước khi khử trùng bằng nồi hấp.
Cho 16-20 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm( 150x25mm,
Borosil) và khử trùng ở áp suất 15 Psi và nhiệt độ 121°C trong 20
phút. Tất cả các ống nghiệm được duy trì ở (25±2)°C và được
chiếu sáng 16/8 (sáng/ tối) giờ bằng ánh sáng trắng.


2.3. Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate:
Nguyên tắc: sodium alginate chứa phôi sẽ tạo từ những hạt nhỏ
tròn và cứng khi nhỏ vào NaCl2.H2O nhờ vào sự trao đổi ion Na+
có trong sodiumalginate với Ca2+ trong CaCl2.2H2O. Vỏ bọc
cứng nhiều hay ít phụ thuộc vào số lượng Na+ và Ca2+ trao đổi.

2.4. Quy trình tạo hạt nhân tạo:
Dung dịch Sodium alginate
Đưa phôi chồi vào giọt sodium alginate
Ngâm dung dịch trong CaCl2.2H20 0.2 mol/l ít nhất 30 phút

Rửa hạt trong nước vô trùng 3 lần.


Các hạt alginate này được gọi là hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo (có
đường kính 3 ± 1 mm ) được đặt trên trên giấy lọc vô trùng có chứa
đựng đĩa petri vô trùng (30 hạt mỗi tấm ), đống gói với parafilm và
bảo quản ở 4°C hoặc sử dụng ngay lập tức. Hạt nhân tạo tươi sẽ
được cho vào các môi trường MS khác nhau để cho nảy mầm và
phát triển. Tất cả các ống nghiệm được duy trì ở (25±2)°C và được

chiếu sáng 16/8 (sáng/ tối) giờ bằng ánh sáng trắng.


2.5. Khử trùng và kiểm tra khả năng nảy mầm
của hạt nhân tạo sau khi bảo quản.
Hạt nhân tạo sau khi bảo quản khoảng 7-28 ngày sẽ được lấy ra và
cho vào môi trường MS để thử nghiệm tỉ lệ nảy mầm. Quá trình
này phải thực hiện trong tủ hút vô trùng và các hạt nhân tạo đã
được khử trùng bề mặt bằng nhiều cách khác nhau để hạn chế ô
nhiễm. Các cách xử lí khác nhau đã được sử dụng để khử trùng có
tên là T1, T2, T3, T4, T5:
+ T1: Hạt giống nhân tạo sau khi lưu trữ được tiêm trực tiếp vào
môi trường.
+ T2: Hạt giống được rửa bằng nước vô trùng, sấy khô trên giấy
thấm và được cấy vào môi trường.


+ T3: Hạt giống nhân tạo được rửa bằng thuốc diệt nấm bavistine
(0,1%) 5 phút và sau đó rửa sạch bằng nước vô trùng. Sau đó, hạt
giống được sấy khô trên giấy thấm vô trùng và cuối cùng được cho
vào môi trường.
+ T4: Hạt giống nhân tạo được nhúng vào thuốc diệt nấm
bavistine (0,1%) trong 5 phút, sau đó khử trùng bề mặt bằng natri
hypoclorit (1%) trong 5 phút, ethyl alcohol 70% trong vòng 2 phút.
Sau đó được rửa bằng nước vô trùng và thấm khô. Cuối cùng, hạt
giống nhân tạo sẽ được cấy vào môi trường.


+ T5: Hạt nhân tạo được khử trùng bề mặt với natri hypochlorite
(1%) trong 5 phút, tiếp theo là ethyl alcohol 70% 2 phút. Sau đó, hạt

giống nhân tạo được rửa sạch bằng nước vô trùng và thấm khô. Cuối
cùng, hạt giống nhân tạo được cấy trên môi trường.

Bảng 2: Ảnh hưởng của các phương pháp xử lí khử trùng khác nhau
đến sự nảy mầm của hạt nhân tạo.


Ở mỗi cách xử lí thì 10 hạt giống được sử dụng( bảng 2). Sau khi khử
trùng, các hạt giống nhân tạo được cho vào môi trường MS. Tất cả
các ống nghiệm được duy trì ở (25±2)°C và được chiếu sáng 16/8
(sáng/ tối) giờ bằng ánh sáng trắng. Các môi trường được quan sát
thường xuyên cho đến khi nảy mầm đầy đủ và phát triển của rễ, chồi,
lá từ hạt giống nhân tạo.


2.6 Làm cứng cây
- Cây con phát triển từ hạt giống nhân tạo có chồi và rễ phát triển
tốt được giữ trong phòng nuôi cấy 1 tuần trước khi chuyển sang
chậu.
Lưu ý :
+ Cây con được rửa bằng thuốc diệt nấm bavistin 0.1% trong 5
phút và rửa lại với nước vô trùng. Sau đó làm khô cây rồi chuyển
vào chậu.
+ Chậu chứa hỗn hợp gồm xơ dừa, phân rơm, rêu (2:1:1)
- Các cây trồng trong chậu (có đục lỗ để duy trì độ ẩm) được tưới
nước mỗi ngày và bón phân trong khoảng thời gian 1 tuần, phun
phân bón lá hỗn hợp gồm nitơ, photpho, kali (20:10:10).


3. Kết quả

- Sự nảy mầm bắt đầu sau 7 tuần nuôi cấy ở tất cả các môi
trường.
- Đến tuần thứ 8 thể chồi phát triển trong tất cả các môi trường.
- Lá mầm đầu tiên phát triển sau tuần thứ 9 ở môi trường 0,25
MS
- Mầm rễ đầu tiên được quan sát thấy sau 13 tuần nuôi cấy ở
môi trường 1,0 MS + 0,5 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA.


3. Kết quả

B

A

C

D

E

Hình 1: sự nẩy mầm và tái sinh cây con từ hạt nhân tạo
A: hạt nhân tạo chứa protocorm của C.aloifolium; B: hạt nhân tạo phát
tiển thành chồi mầm ở môi trường 1,0 MS; C: thể chồi và rễ phát triển trên
môi trường 0,25MS; D: Thể chồi và rễ phát triển tốt ở môi trường 1,0MS;
E: Trồng cây ra vườn ươm


3. Kết quả
Qua kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng môi trường 0,25 MS lỏng

chồi mầm mọc sớm hơn các môi trường 0,5 MS lỏng và 1,0
MS lỏng. Hình thành lá non ở tuần 8 hoặc 9 và hình thành rễ ở
tuần 14. Sau 24 tuần nuôi cấy cây con nào có chiều cao 5-6 cm
hệ thống rễ phát triển tốt thì được chọn làm giống.


3. Kết quả
Cây giống được trồng trong chậu nhựa có đục lỗ (để duy trì độ
ẩm theo yêu cầu) chứa hỗn hợp xơ dừa, phân rơm và rêu theo tỉ lệ
2:1:1 và có khoảng 85% cây con sống sót.
Hạt nhân tạo vừa tạo ra sẽ bảo quản ở 40C trong 28 ngày để
kiểm tra khả năng tồn tại của hạt. Kết quả cho thấy ở điều kiện
T1 (không có nước) và T2 (nước vô trùng) cho kết quả cao nhất
97,5% hạt nẩy mầm sau 28 ngày lưu trữ.


4. Thảo luận
- Trong tự nhiên chỉ có 2-5% giống phong lan nẩy mầm khi có
sự hiện hiện của nấm cộng sinh Rhizectonia.
- Trong điều kiện thực nghiệm. Môi trường 1,0MS lỏng bổ sung
hormone là môi trường có hiệu quả nhất cho việc chuyển đổi
hoàn toàn hạt nhân tạo thành cây con sau 16 tuần nuôi cấy.


4. Thảo luận
Trong nghiên cứu của Pradhan et al., 2013 báo cáo rằng
protocorm không có vỏ bao mất 30 tuần để cấy chuyển hoàn toàn
thành cây giống trên môi trường 1,0MS. Điều này cho thấy hạt
nhân tạo chứa protocorm cho phản ứng sớm hơn protocorm
không có vỏ bao. Có thể do sự hiện hiện của hỗn hợp alginate

tăng cường sự phát triển của hạt nhân tạo.


4. Thảo luận

- Auxin và cytokinin ngoại sinh cần cho sự tái sinh của
PLBs (protocorm like bodies) hoặc sự nảy mầm chồi và
phát triển cây non.
- Sự kết hợp tỷ lệ và nồng độ của chúng tùy từng loài và
có ý nghĩa quan trọng.
- Các tác dụng kết hợp của BAP và NAA cùng với môi
trường MS trì hoãn sự phát triển của cây giống từ hạt
nhân tạo của C.aloifolium


4. Thảo luận
Hạt giống nhân tạo chứa protocorm cho 97,5% nẩy mầm
tối đa sau thời gian lưu trữ 28 ngày trước khi nảy mầm.
Một kết quả quan trọng của nghiên cứu là việc quan sát
thấy hạ nhân tạo giữ được hình thái và khả năng tái sinh
sau 28 ngày bảo quản ở 40C.
=> Do đó, bài báo này dự kiến sẽ là một nghiên cứu mới
mở ra cánh cửa mới trong bảo quản và duy trì nguồn gen
với khối lượng lớn loài lan dược liệu đang bị đe dọa C.
aloifolium ở dạng hạt nhân tạo.