BÁO cáo SEMINAR CHUYÊN đề AFLATOXIN , đh nông lâm tphcm

GVHD: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
ĐỖ XUÂN ĐỊNH
09139034
ĐẶNG ĐÌNH SOÁI
09139146
NGUYỄN THỊ KIM LOAN
09139192
NGUYỄN NGỌC THÚY HÀO
0913904
LÊ VĂN HÀO
09139045
VÕ TUẤN HÙNG
09139069


NỘI DUNG
I.
II.

ĐẶT VẤN ĐỀ
KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN
1.
2.

NGUỒN GỐC AFLATOXIN
CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC CỦA AFLATOXIN

III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH
IV. HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI.

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO.

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

NGUYÊN TẮC
DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
HÓA CHẤT
DUNG DỊCH CHUẨN
CHUẨN BỊ MẪU THỬ
LÀM SẠCH DỊCH CHIẾT
PHÂN TÍCH TRÊN HPLC
YÊU CẦU VỀ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHÉP PHÂN TÍCH
KẾT QUẢ


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
 Aflatoxin là một trong những

nhóm chất độc mạnh nhất hình
thành trong tự nhiên. Chúng bao
gồm một họ độc tố sinh ra từ

nấm aspergillus flavus và
aspergillus paraticus trong điều
kiện khí hậu nóng ẩm.
 Những thực phẩm thường nhiễm
aspergillus flavus như đậu
Phộng, lúa mì… và do đó đây là
nhóm bị nhiễm aflatoxin.

Aspergillus fumigatus


 Aflatoxin gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề

kháng cho cơ thể. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên
thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất.

 Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan
trọng.
 Thông thường nồng độ nhiễm độc tố aflatoxin trong thực phẩm
rất thấp. Do đó để xác định chính xác độc tố aflatoxin có trong
thực phẩm cần chọn phương pháp phù hợp.
 Xác định aflatoxin trong thực phẩm bằng các phương pháp sắc
kí nhằm định lượng được hàm lượng aflatoxin có trong thực
phẩm và chiết tách aflatoxin ra khỏi thực phẩm.


II. KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN
NGUỒN GỐC AFLATOXIN
 Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài
Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin là
độc tố và là tác nhân gây ung thư.
 Aspergillus flavus và aspergillus parasiticus thuộc họ nấm
cúc, là loại nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự nhiên và trong
môi trường nuôi cấy nhân tạo.
 Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc đậu
nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng… hay trên các loại
hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc .
1.


2. CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC
CỦA AFLATOXIN
 Các nhà hóa học đã xác định

được hai aflatoxin có công thức
là C17H12O6 (aflatoxin B1) và
C17H12O7 (aflatoxin G1). Trong
cấu trúc phân tử có nhóm lacton
và metoxyl, không có nhóm
hidroxyl tự do.
 Aflatoxin B1 có màu huỳnh
quang xanh da trời, aflatoxin G1
có màu huỳnh quang xanh lá
cây. Aflatoxin G1 có chứa hai
vòng lacton, aflatoxin B1có
chứa 1 vòng lacton.

Cấu trúc 3D của aflatoxin B1

 Sau đó, hai aflatoxin B2, G2 cũng được phát hiện. Chúng có

công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1, chỉ khác
là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử.
Bảng: Tính chất lí hóa của các aflatoxin

Aflatoxin

Công thức Trọng lượng
phân tử

Điểm nóng
chảy

Huỳnh
quang

Hấp thụ
tiaUv trong
etoh

Aflatoxin B1 C17H12O6

321

268-269

Xanh lam

223.2

Aflatoxin B2 C17H14O6

314

286-269

Xanh lam

243.2

Aflatoxin
G1

C17H12O7

328

244-246

Xanh lục

222.2

Aflatoxin
G2

C17H34O7

330

229-231

Xanh lục

221.2

Aflatoxin
M1

C17H12O7

328

299

Xanh tím

226.2

Aflatoxin

C17H14O7

330

293

Xanh tím

221.2


III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG
PHÂN TÍCH
 Tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng





hiệu năng cao.
Đối tượng xác định độc chất là các loại nguyên liệu và thức ăn
chăn nuôi:
Khô dầu đậu tương, khô dầu lạc.
Cỏ khô, phụ phẩm nông nghiệp.
Các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm.


IV. HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN
CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.

 1. Nguyên tắc


Aflatoxin có trong mẫu thức
ăn chăn nuôi bao gồm các nhóm

B1, B2, G1 và G2 được chiết tách
ra bằng clorofom. Dịch chiết
đựơc làm sạch bằng phương pháp
chiết pha rắn (SPE) trên silicagel.

Hàm lượng aflatoxin có trong
dịch chiết được xác định trên hệ
thống HPLC với đầu dò huỳnh
quang, giới hạn phát hiện của
phương pháp là 0,3ppb.

Hệ thống sắc ký lỏng cao áp


2. Dụng cụ và thiết bị











Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.
Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x là ID là 25cm x 4,6 mm,
đường kính hạt từ 5 đến 10 µm.
Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g

Máy li tâm tốc độ 3000 vòng/phút
Hệ thống cô quay chân không
Cột thủy tinh có khóa Teflon , kích thước L x ID là 500 x 20 mm
và 500 x 8 mm
Ống li tâm thủy tinh dung tích 250 ml
Bình cầu thủy tinh dung tich 100 ml và 250 ml
Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml
Máy nghiền đồng thể tốc độ 10.000 vòng/ phút.


3. Hóa chất
Nước cất loại dung cho
HPLC.
 Metanol loại dung cho
HPLC.
 Clorofrom loại dung cho
HPLC.
 Axetonitril loại dung cho
HPLC.
 N- hexan tinh khiết loại dung
cho phân tich.
 Ete- etilic tinh khiết.
 Natri sunphat khan.
 Silicagel đã đươc hoạt hóa.



4. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100 ppb),

B2 (nổng độ 20 ppb), G1 (nồng độ 100 ppb), G2 (nồng độ 20
ppb)
Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10ppb),
B2(2ppb), G1(10ppb), G2(2ppb): hút chính xác 1ml dung dịch
chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10ml rồi định mức tới
vật bằng Metanol.
Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0ml, 1ml, 2ml, 4ml,
8ml, 10ml, dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức
10ml rồi định mức tới vạch bằng Metanol. Các dung dịch chuẩn
thu được có nồng độ Aflatoxin lần lượt như sau :
o


o Chuẩn 1: B1(0ppb), B2(0ppb), G1(0ppb), G2(0ppb)
o Chuẩn 2: B1(1ppb), B2(0,2ppb), G1(1ppb), G2(0,2ppb)
o Chuẩn 3: B1(2ppb), B2(0,4ppb), G1(2ppb),G2(0,4ppb)
o Chuẩn 4: B1(4ppb), B2(0,8ppb), G1(4ppb), G2(0,8ppb)
o Chuẩn 5: B1(8ppb), B2(1,6ppb), G1(8ppb), G2(1,6ppb)
o Chuẩn 6: B1(10ppb), B2(2ppb), G1(10ppb), G2(2ppb)
o Dung dịch pha động : pha hỗn hợp dung môi methanol,

nước cất theo tỉ lệ là 2:3.


5.Chuẩn bị mẫu thử
 Dùng cân phân tích cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã
được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích
250 ml.
 Thêm 100,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong
khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể.

ly tâm ống bằng máy ly tâm trong khoảng 10 phút ở tốc
độ 3000 vòng/phút.
Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom
rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung
tích 250 ml .


6. Làm sạch dịch chiết
6.1 Chuẩn bị cột
 Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon .

Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần
lượt 5,0 g sulfat natri khan , 20,0g silicagel đã hoạt hóa , 15 g
sulfat natri khan .
 Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn
lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm.

6.2 Làm sạch dịch chiết
 Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô quay chân không còn

khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC.
 Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm sạch đã
chuẩn bị và tráng rửa bình cầu bằng clorofom.


Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột

khoảng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ
hấp phụ lên các hạt silicagel.
 Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic .

Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 0,8 ml/phút. Sau đó
loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột.
 Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn
hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc
dộ 0,8 ml/phút.
. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100
ml. Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không ở nhiệt
độ 40o C cho đến khô hoàn toàn.


Cột sắc ký


7.2 Tiến hành thực hiện.
 Tiêm các dung dịch chuẩn
vào máy HPLC theo thứ tự
nồng độ từ thấp đến cao.
 Mỗi dung dịch tiêm 2 lần,
tính diện tích pic trung bình.
 Dựng đường chuẩn biểu thị
mối quan hệ giữa các diện
tích pic thu được và nồng độ
từng loại aflatoxin theo quan
hệ tuyến tính bậc 1 (phương
trình y = ax + b).



8. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích
8.1 Độ lặp lại của hai lần tiêm.



Độ lệch chuẩn tính theo diện
tích pic sắc ký của hai lần tiêm
cùng một dung dịch chuẩn phải
nhỏ hơn 0,5%.

8.2 Độ thu hồi (R)


Độ thu hồi tính được phải nằm
trong khoảng từ 85 -115%, độ thu
hồi trung bình phải lớn hơn 90%.

Đường chuẩn phải có độ tuyến
tính tốt, hệ số tương quan hồi quy
tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc
bằng 0,99.

Đường chuẩn của Aflatoxin B2


9. Tính kết quả
 Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở
đường chuẩn thu được. Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm
lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau:
Trong đó: C= (Y-b)xF
a
• C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu (ppb).
• Y là hiệu số giữa diện tich pic của dịch chiết và diện tích pic có

trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tinh theo đơn vị diện tich.
• a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b.
• F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích
dịch chiết thu được sau khi làm sạch (V) và khối lượng mẫu (m) sử
dụng.