Nghiên cứu chiết xuất hóa học, dược lý học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng và kháng nấm bệnh của quả cây du trà (camellia (sp ) họ theaceae nhằm làm thuốc hạn chế sinh s

Chơng trình nghiên cứu khoa học cơ bản
bộ khoa học và công nghệ

báo cáo kết quả nghiên cứu

Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất hoá học, dợc lý
học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng v
kháng nấm bệnh của quả cây du trà (Camellia (Sp.)
họ Theaceae) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản,
thuốc phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ
sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ
Mã số đề tài: 511402
Giai đoạn: 2002-2005
Thuộc chơng trình nghiên cứu KHCBNN
Chủ nhiệm đề tài: GS. TSKH. Phạm Trơng Thị Thọ

6126
29/9/2006

hà nội - 2006


Cán bộ tham gia đề tài 511402
STT
Họ và tên
1
Phạm Trơng Thị Thọ

Học vị
Cơ quan
GS.TSKH Viện dợc liệu

Nhiệm vụ
Chủ nhiệm đề
tài

Phân tích

Phân tích

Tiêu chuẩn

Sinh hoá

Bào chế

Bào chế
Viện phó VDL
Theo dõi quản
lý đề tài
Viện Dựoc liệu
Viện Phụ sản
Thử tác dụng
(test invitro)
Viện Phụ sản
Viện y học dân tộc Thử tác dụng
(test invivo)

Độc tính mãn,

độc tính sinh

sản
Viện da liễu TW
Thử kháng
nấm
ĐHSP Hà Nội
Đào tạo sinh
viên, thạc sỹ
ĐHBK Hà Nội
Trung tâm KHTN Nghiên cứu
và CN quốc gia
hoá học



2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Đinh Thị Thuyết
Nguyễn Kim Bích

Nguyễn Thị Phơng
Nguyễn Minh Phơng
Phạm Thanh Trúc
Mai Lê Hoa
Nguyễn Duy Thuần
Nguyễn Minh Châu
Trần Thu Hà
Nguyễn Thanh Thuỷ
Trần Lu Vân Hiền
Lê Hồng Vân
Nguyễn Thị Hảo

Dợc Sĩ
CKI
Dợc Sĩ
Bác Sĩ
TS. DS
TS. DS
TS
DS
Thạc Sỹ
Y sỹ
PGS. TS
Dợc Sĩ
KTV

15

Lê Thị Phơng

Bác sỹ

16
17
18

Lê Thị Anh Đào
Nguyễn Minh Tú
Trần Văn Lộc

PGS. TS
TS
ThS

19
20

Đào Đức Thiện
Dơng Ngọc Tú

Cử nhân
TS


Mục lục
Số
TT
1
2
3

4

5
6

7

8
9
10
11
12

13

14

15

Nội dung
Lời nói đầu Giới thiệu vấn đề
Các kết quả nghiên cứu
A. Những nghiên cứu hoá học
B. Những nghiên cứu dợc lý
- Tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng (Test invitro)
- Tác dụng hoạt chất Sf lên tinh trùng (Test invivo)
- Xét nghiệm vi thể
- Liều độc LD50, liều độc bán trờng diễn
- Tác dụng kháng nấm
C. Thăm dò nghiên cứu dạng bào chế

D. Các tiêu chuẩn cơ sở
- Nguyên liệu
- Hoạt chất Sf
- Thẩm định tiêu chuẩn hoạt chất Sf của viện kiểm nghiệm quốc
gia
E. Các tài liệu khác
- Thông báo cục sở hữu trí tuệ chấp nhận đơn đăng ký sáng chế
- Nhận xét của các phản biện
- Giấy xác nhận hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản.
Mã số 511402 của bộ khoa học và công nghệ
- Giấy xác nhận hợp tác của công ty dợc Hậu Giang
Kết luận Lời cảm ơn
Các tài liệu tham khảo
Phần phụ lục
Bìa sách 101 cây thuốc với sức khoẻ sinh sản phụ nữ NXB
KHKT 2001
Bài báo thứ nhất Contribution to the study on chemistry and
biological activity of Saponin extracted from the seed of Du Tra
tree growing in Vietnam
10th Asian Chemical Congress, 10 ACC
8th Eurasia Conference on Chemical Sciences Eu As C2S 8
Luận văn sinh viên Phạm Quang Huy. ĐHSP 6/2003: Bớc
đầu tìm điều kiện tối u để tách saponin từ cây Sở dầu
(Camellia oleifera Abel). Bảo vệ ngày 10/6/2003 tại ĐHSP HN
đạt xuất sắc
Luận văn Thạc sĩ ĐInh Ngọc Thức, ĐHSP tháng 11 năm 2003:
Bớc đầu nghiên cứu một số thành phần hoá học cây Sở Dỗu
Nghệ An (Camellia drupifera (Lour) Pierre. Bảo vệ ngày
10/11/2003 tại ĐHSP HN đạt loại giỏi
The biological subsstance extracted from Camellia sp. growing

in Vietnam.Tạp chí dợc liệu tập 9 số 6 2004 trang 185-187

Trang
1 -2
3 -9
10 -22
10 -14
15- 18
19 21
21 -22
22- 26
26- 27
28- 35
36- 40
41
42- 43
44- 46
47
48
49
50
51
52- 57

58

59

60- 63

16

21

Tác dụng hoạt chất Sf từ 1 loài Camellia (sp.) lên tinh trùng
ngời
Những vấn đề nghiên cứu cơ bản ttrong khoa học sự sống
Hội nghị toàn quốc 2004 28.10.2004 Học viện Quân Y
Bản số liệu gốc phân tích tinh dịch. Thử tác dụng Sf (test in
vitro)
Phân tích tinh dịch; so sánh với tác dụng của nớc muối sinh lý;
tinh dịch + nớc muối sinh lý; tinh dịch + nớc muối sinh lý
+hoạt chất
Study of spermicical effect in vitro on human spermatozoa and
in vivo á locally applied in the vagina of rat and reproductive
toxicity of the active product Sf extracted from Camellia sp.
Theacea growing in Vietnam
RSCE 2005 (Regional Symposium on Chemical Engineering)
New Trends in Technology Towards Subtainable Development
Proceedings, November 30 December 2, 2005 pp 346-353
Nghiên cứu tác dụng diệt tinh trùng và độc tính sinh sản của
hoạt chất Sf tách đợc từ quả Du Trà Camellia sp. họ Theacea
mọc ở Việt nam
Báo cáo Hội nghị KHCN kỷ niệm 45 năm ngày thành lập Viện
Dợc Liệu 1961-2006
Kết quả thử LD50 của hoạt chất Sf suy ra dợc liệu

22

Khẳ năng hạn chế sinh sản trên động vật thí nghiệm của Sf

23

25

Khẳ năng phục hồi sinh sản của chuột sau khi ngừng dùng hoạt
chất Sf
Độc tính sinh sản của hoạt chất Sf đối với chuột mẹ và chuột
thế hệ F1
Kết quả thử độc tính bán trờng diễn của Sf

26

Các phiếu xét nghiệm

27

Quy trình sản xuất viên đặt âm đạo Camellia

28

Quy trình sản xuất kem Camellia

17
18
19

20

24

64- 68

69- 85
86- 118
119128

129132

133135
136141
142
143144
145149
150162
168173
174178


Lời nói đầu
I. Giới thiệu vấn đề
Cho đến nay, đã có nhiều tài liệu giới thiệu cây thuốc Việt Nam dới nhiều
hình thức phong phú và sinh động. Song, cha có tài liệu nào đề cập riêng đến các
cây thuốc có tác dụng hạn chế sinh sản một cách có hệ thống theo kinh nghiệm
dân gian và trên cơ sở nghiên cứu khoa học và cũng cho đến nay cha có một
dạng thuốc hạn chế sinh sản nào thích hợp, đợc bào chế từ nguồn dợc liệu sẵn
có trong nớc.
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu đề tài "Sàng lọc cây thuốc có tác dụng kế
hoạch hoá gia đình" của Uỷ ban Quốc gia dân số kế hoạch hoá gia đình - năm

1996-1997; Đề tài: "Sàng lọc các cây thuốc hạn chế sinh sản nam và nữ" thuộc
chơng trình nghiên cứu khoa học cơ bản nhà nớc năm 1999-2000 từng phần các
kết quả đã đợc báo cáo tại Hội nghị Châu á lần thứ 9 về cây thuốc, hơng liệu và
các hợp chất thiên nhiên khác (ASOMPS IX) tổ chức tại Hà Nội năm 1998; Hội
nghị khoa học và công nghệ hoá hữu cơ lần thứ 1 ở Quy Nhơn năm 1999; Hội
thảo sinh học Quốc tế ở Hà Nội năm 2001. Một số kết quả đã đợc giới thiệu trên
các tạp chí trong nớc. Chúng tôi đã tập hợp các kết quả đó lại, kết hợp với việc
siêu tầm các bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian một cách chọn lọc và tham
khảo các công trình nghiên cứu của nớc ngoài, để biên soạn cuốn "101 cây thuốc
với sức khoẻ sinh sản phụ nữ" (NXB KHKT 2002).
Từ 101 cây thuốc, chúng tôi đã chọn 1 cây có tính khả thi nhất làm đối tợng
nghiên cứu cho đề tài. Đó là cây Dutrà(trà mai, chè dầu, sở) tên khoa học là
Camellia drupifera (lour ) Piere Camellia obifera C. Abel họ Theaceac. Cây Dutrà
là một trong vài loại cây đợc chọn làm đối tợng trồng rừng phòng hộ (trong 5
triệu ha rừng) để chống xói mòn và phủ xanh đồi trọc. Cho đến nay, diện tích rừng
Dutrà lên đến 7500 ha, tập trung ở các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh
Hoá, Nghệ An- Rừng đã khép tán và cho thu hoạch. Mùa thu hoạch từ tháng 9 12 hàng năm. Một ha rừng Dutrà 1 vụ có thể cho thu hoạch từ 4 - 5 tấn quả. Một
tấn quả cho khoảng 240 kg dầu béo và khoảng 500 kg bã khô dầu. Thực tế, đa số
ngời trồng rừng cha biết tận dụng khai thác nguồn tài nguyên này, nên còn đói
nghèo, có khi còn chặt phá rừng làm ảnh hởng đến môi trờng. Nói đến Dutrà
ngời ta nghĩ ngay đến việc khai thác dầu béo từ quả của nó, nhng phần bã khô

1


dầu còn lại sau khi ép dầu cha đợc tận dụng, có nơi ngời ta vứt bừa bãi bã khô
dầu xuống ao hồ để giết cá, điều đó làm ô nhiễm môi trờng nớc nuôi tôm.
Theo một số tài liệu tham khảo trong và ngoài nớc cho biết, trong dầu béo
có chứa 1 lợng Saponin, do đó dầu cần phải xử lý mới ăn đợc. Trong bã khô
dầu cũng có chứa một hàm lợng Saponin tơng đối cao, nhng cha có tài liệu

nào giới thiệu rõ và chứng minh đầy đủ tác dụng hạn chế sinh sản của nó.
Chính vì vậy, chúng tôi đã đề xuất đề tài:"Chiết xuất hoá học, dợc lý học
hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng và kháng nấm bệnh của quả cây Dutrà (một
loài Camellia- Họ Theaceac) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa,
góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ.
Đề tài thuộc chơng trình nghiên cứu KHCBNN - Hớng khoa học tự nhiên
Mã số đề tài 511402 - giai đoạn 2002 - 2005
Đề tài khoa học cơ bản nêu trên đã đợc Hội đồng khoa học ngành Hoá học,
Hội đồng khoa học tự nhiên đánh giá kết quả thực hiện loại : Đạt

2


II. Các kết qủa nghiên cứu
A- Những nghiên cứu về hoá học
1- Phân tích sàn lọc sơ bộ hoá thực vật bã khô dầu Dutrà
Dùng các phản ứng định tính với các thuốc thử đặc hiệu để xác định các
nhóm chất hoá học có trong bã khô dầu quả Dutrà. Kết quả ghi ra ở bảng.
Bảng1: Các nhóm chất hoá học trong bã khô sở
Nhóm chất

Thuốc thử

Kết quả

Ankaloit

Dragendoff

Flavonoit

Xianidin

++

Tanin

FeCl3

++

Cumanrin

Axít & Kiềm

-

Glucozit tim

Keller-Kliani

-

Saponin

Tạo Bọt

Sterol

Liberman-buchardart

-

++
-

Kết quả thử định tính cho thấy trong bã khô sở Dutrà có chứa chủ yếu là
Saponin, Flavonoit, Tanin.
2- Sơ đồ chiết bã khô Dutrà theo độ phân cực của dung môi.
Bã khô dầu
Dutrà

n-hexan

CHCl3

MeOH

Phân đoạn 1

Phân đoạn 2

Phân đoạn 3

a/ Khảo sát phân đoạn1: Phân đoạn n-hexan này có chứa nhiều lipít và
nhiều axít béo tự do: Dung dịch làm mất màu nớc Brôm, chứng tỏ trong dịch
chiết có các axít béo không no, điều đó phù hợp với các tài liệu về dầu sở là các
gluxrít của axít oleic, linoléic, stearic.
b/ Khảo sát phân đoạn 2 (CHCL3): Phân đoạn 2 đợc xử lý qua sắc kí cột
SiO2. Hệ dung môi theo tỉ lệ tăng cực dần. ở phân đoạn thứ 19, Hệ dung môi

CHCl3 : MeOH (9:1) thu đợc một chất, chất này kết tinh lại trong axêton, màu
vàng sáng - điểm nóng chảy đC = 2600 - 2620
3


* Sắc kí trên lớp mỏng SiO2.
Hệ dung môi CHCl3 : MeOH (3:1)
thuốc hiện 1/ Vanilin/H2SO4
2/ Boric acid/oxalic acid
Sắc kí đồ hiện 1 vết rõ màu vàng cam. Rf = 0,44 - Chất đợc ký hiệu Kf

* Sắc ký lớp mỏng SiO2
Xử lý phân đoạn 2 cho qua cột đảo pha với chất mang LH20, dung môi rửa là
MeOH
- Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : H2O (65:35:5)
- Hơ nóng hiện màu hồng.

Sắc ký đổ cho thấy phân đoạn 2 này có chứa nhóm các chất flavonoit.
Chất ký hiệu Kf có Rf tơng đơng với nhóm này.
b'/ Xác minh cấu trúc hoạt chất Kf từ phân đoạn CHCl3 của bã Dutrà.
Bằng các phơng pháp vật lý hiện đại nh: Hồng ngoại (IR); Phổ tử ngoại
(UV); Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton (1H. NMR); Phổ DEPT-90; Phổ DEPT135. Phổ 2 chiều HMQC và HMBC đã xác định đợc chất Kf chiết đợc từ phân
đoạn CHCl3 của bã Dutrà là một flovonol có tên là Kaempherol tên IUPAC là 3, 5,
7 - Trihydroxy - 2-(4 - Hidroxy phenyl)-4H-1-Benzopyran -4-one.
4


Công thức cấu tạo nh sau: C15H10O6 m/z = 286

Theo vài tài liệu tham khảo Kaempherol có khả năng kháng ung th vú,

chống hoại tử do nọc rắn độc gây ra.
(Phụ lục số 15 trang 60 - 63)
c/ Khảo sát phân đoạn 3: Phân đoạn MeOH.
Phân đoạn 3 đợc xử lý nh sau:
Dung dịch MeOH thu hồi MeOH cặn còn lại hoà tan với Butanol bão
hoà nớc cất dung môi đến cạn hoà tan lại bằng MeOH rửa bằng axêton
: ête (5:1) thu đợc hỗn hợp Saponin tinh chế saponin sạch ký hiệu S3.
* Các phản ứng đặc trng của Saponin (S3) chiết xuất từ bã Dutrà
1/ Phân biệt hai loại Saponin: Tritecpen và Steroit.

- Hoà tan 5 mg chất S3 trong 5ml cồn loãng vào 2 ống nghiệm cao 25 cm.
ống thứ 1 độ pH = 13, ống thứ 2 độ pH = 1.
- Lắc mạnh 2 ống nghiệm nh nhau trong 1 phút - Bọt nhiều và bền vững ở
ống thứ 2 (môi trờng axit) chứng tỏ - saponin là loại Saponin tritecpen
2/ Chỉ số bọt: Chỉ số bọt của Saponin đợc tính theo công thức :
Chỉ số bọt =
A: biểu thị nồng độ nhỏ nhất của dịch chiết tính bằng g/ml để cho lớp bọt
bền, không mất sau 1 phút.
Kết quả chỉ số bọt của S3 là :

1
1
=
x10 3 571
A 1,75
3/ Vòng phá huyết: Đây là phần ứng đặc trng của Saponin đờng kính

vòng phá huyết tỉ lệ với nồng độ Saponin

5

Vòng phá huyết của Saponin S3 từ bã Dutrà.
4/ Khảo sát hoạt chất Saponin S3từ bã Dutrà
Saponin S3 có màu vàng nâu nhạt, tinh thể mịn, sáng đẹp, mùi hắc. S3 tan tốt
trong các dung môi phân cực: MeOH, EtOH, BuOH, đặc biệt là MeOH: H2O
(4:1), tan tốt trong nớc nóng, ít tan trong nớc lạnh, không tan trong ete đầu
CHCl3, C6H6, n-hexan.
Sắc ký lớp mỏng trên SiO2
Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O
65 : 35 : 10

Cho Rf = 0,45 - 0,47. ở vị trí Rf 0,44 luôn có vết màu vàng kèm theo với
thuốc hiện Vanilin/ H2SO4. Sắc đồ cho 2 vết màu lam đậm và màu vàng. Nhiệt
nóng chảy khó xác định. Từ 1860 bắt chảy, kéo dài đến 2300 - 2400 thì phồng lên
và caramen hoá. Điều đó thể hiện S3 không phải là một chất mà là một nhóm chất
có nhiều mạch đờng phức tạp dới dạng tritecpen oligoglycosides
- Bằng các phơng pháp phổ hiện tại nh 13C - NMR kết hợp với phổ DEPT
cho thấy S3 có chứa cả Cacbon bậc 1, 2, 3, 4. Nh vậy đây là những chất rất phức
tạp. Việc nghiên cứu cấu trúc hoá học của S3 đang đợc tiếp tục tiến hành với luận
án thạc sĩ năm 2006.
(Phụ lục số14 trang 59)
5/ Nghiên cứu qui trình chiết xuất hoạt chất có tác dụng sinh học Sf từ bã
khô dầu quả Dutrà.
Trong nghiên cứu dợc liệu để làm thuốc, việc nghiên cứu cấu trúc hoá học
hoạt chất là một việc làm rất cần thiết để chứng minh tính khoa học, hiện đại và từ
đó góp phần giải thích bản chất cơ chế tác dụng ... của thuốc. Do đó, việc nghiên
6

cứu cơ bản phải thực hiện đến mức tối đa có thể. Song, trong thực tế, tuỳ loại
thuốc, ngời ta thờng chiết không phải đơn chất mà là hỗn hợp hoạt chất, để hiệu
suất cao tác dụng hiệp đồng và hiệu quả kinh tế cao.
- Trên cơ sở đó chúng tôi đã xây dựng quy trình chiết tách hỗn hợp Saponin flavonoil ("Sf") từ bã Dutrà.
6/ Qui trình chiết tách hỗn hợp Saponin - Flavonoit "Sf" từ bã khô dầu
Bã khô dầu đã xay

Dutrà.

Loại lipít bằng n-hexan
Bã nguyên liệu đã loại lipit
Chiết bằng MeOH
Dịch MeOH
Cô quay chân không
Dịch đặc MeOH
Hoà tan với nBuOH bão hoà nớc
Dịch nBuOH-H2O
Cất quay chân không
Cao n-BuOH
Hoà lại với MeOH
Dịch MeOH
Cất quay chân không
Dịch đặc MeOH
Tủa với axêton: etê (5:1)
Hỗn hợp thô "Sf"
Tinh chế
Hoạt chất "Sf" sạch
7

Các thông số của hoạt chất "Sf" từ bã khô dầu
Hoạt chất "Sf" có tinh thể vô định hình màu vàng nâu non- Hiệu suất đạt 710%.
Điểm nóng chảy: ở 1800 chất bắt đầu chảy, quá trình kéo dài đến 2300,
phồng lên và caramen hoá. Hỗn hợp chất "Sf" cho qua cột đảo pha, chất mang là
LH20. Dung môi rửa là MeOH. Sắc ký số cho thấy, hỗn hợp chất "Sf" gồm có 2
nhóm chất rõ rệt. Mỗi nhóm chất có thể có từ 2 - 3 chất.
- Sắc ký lớp mỏng lên bản mỏng SiO2
- Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O
65 : 35 : 5
- Hiện bằng hơ nóng
1,4: Dịch toàn phần bã Dutrà
2: Phần Saporin
3: Phần flavonoit
* Hỗn hợp chất "Sf" không qua cột đảo pha làm SKCM trên SiO2
Hệ dung môi CHCl3 : MeOH : H2O
65 :

35 : 10

Thuốc hiện:
- Vanilin/H3PO4
- Axit bonic/oxalic ặ viết flvonoit màu vàng rõ ở phía dới
Hoạt chất "Sf" thuỷ phân trong môi trờng H2SO4 1M và chạy sắc ký lớp
mỏng SiO2
- Với hệ dung môi: Toluen: EtOAc: H2O (9 : 1 : 0,1)
8


- Thuốc hiện là Vanilin/H3PO4

Sau thủy phân

Trớc thủy phân

Sắc kí đó cho thấy có thể có từ 5 -8 Sapogenin Đối chứng là oléanolic acid)
Kết quả sắc ký trên cho thấy hỗn hợp hoạt chất "Sf" chứa hai nhóm chất
riêng lẻ đi kèm theo nhau: nhóm Sapogenin và nhóm flavonoit. Mỗi nhóm có thế
chứa từ 2 - 3 chất. Từ nhóm flavonoit đã tách riêng đợc một chất. Đó là
kaemferol. Thành phần hóa học nhóm Saponin và nhóm flavonoit còn lại đang
tiếp tục nghiên cứu trong công trình thạc sĩ vào cuối năm 2006.

9


B- Những nghiên cứu dợc lý
I- Tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng ngời (test invitro)
(thực hiện tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương)

Mục đích của thí nghiệm là xác định xem ở nồng độ nào khoảng thời gian nào
thích hợp để hoạt chất Sf ức chế đợc tinh trùng, làm cho tinh trùng không tiến
tới nhanh, dừng lại tại chỗ, không hoạt đọng đợc và chết. Điều đó bảo đảm
tinh trùng không còn khả năng tiếp cận đợc với trứng, không còn khả năng
gây thụ thai.
1- Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu
a/ Hoạt chất Sf: Hoạt chất Sf chích đợc từ bã khô dầu quả cây Du trà (Camillia
(Sf)- họ Theaceae)có tinh thể vô định hình màu nâu nhạt với các chỉ tiêu chất lợng
xác định.
b/ Tinh trùng: tinh trùng đợc lấy từ 17 ngời đàn ông khoẻ mạnh bình thờng,
đợc sử lý và thí nghiệm theo tài liệu của tổ chức Y tế Thế giới (WHO)
c/ Phơng pháp tiến hành: lấy hoạt chất Sf pha loãng với nớc muối sinh lý thành

các nồng độ khác nhau, trộn đều với một lợng tơng đơng (0,5 ml) tinh dịch
ngời, sau đó dùng kính hiển vi quang học quan sát tác dụng của hoạt chất lên hoạt
động của tinh trùng.
2- Kết quả thí nghiệm và phân tích số liệu

a/ kết quả thí nghiệm: kết quả phân tích tinh dịch theo các chỉ tiêu và mức độ:
chỉ tiêu 1: tỉ lệ sống của tinh trùng% trớc và sau khi tiếp súc với hoạt chất
Sf
chỉ tiêu 2: Độ di động của tinh trùng ở 4 mức độ :
mức độ A (%) : độ di động của tinh trùng tiến tới nhanh
mức độ B (%) : độ di động của tinh trùng tiến tới chậm
mức độ C (%) : độ di động của tinh trùng không tiến tới
mức độ D (%) : tinh trùng không di động, hoặc di động tại chỗ.
chỉ tiêu 3: nồng độ thuốc chọn 4 nồng độ
nồng độ 1: 1mg/1ml
nồng độ 3: 0,25 mg/ml
nồng độ 5: 0,0625mg/ml
nồng độ 7: 0,0156mg/ml
chỉ tiêu 4: khoảng thời gian tiếp xúc:
thời gian trớc khi dùng thuốc ( chừng): 0 phút
thời gian tiếp súc sau khi dùng thuốc: 1, 5, 10
chỉ tiêu biến đổi hình dạng sang (%)
(xem bản số liệu gốc- phần phụ lục số 7 , trang 40- 56)
10


b- phân tích số liệu-vấn đề nghiên cứu là sự sai khác giữa số tinh trùng ban đầu
cha kịp tiếp súc với hoạt chất Sf, so sánh với tinh trùng sau khi tiếp súc với hoạt
chất Sf ở các chỉ tiêu và mức độ xem xét có ý nghĩa thống kê hay không?
(độ lệch chuẩn) và chỉ ttiêu Student t

Bài toán đa về tính toán 2 (phơng sai),
theo trị trung bình tác dụng .

c- Kết quả tính toán: chọn 2 chỉ tiêu ra 2 mức độ có tác dụng quyết định để iiii
1-chỉ tiêu tỉ lệ sống của tinh trùng (%)
2-chỉ tiêu tinh trùng tiến tới nhanh
ở mức độ A: tinh trùng tìm tới nhanh %
ở mức độ D: tinh trùng di dộng tại chỗ %
Mọi cá thể đợc quan sát 2 lần:
Lần thứ 1: không dùng hoạt chất Sf
Lần thứ 2: thí nghiệm với hoạt chất Sf ở các nồng độ 1, nồng độ 3, sau 1 phút,
5 phút.
-Giá trị chỉ tiêu student t tính toán đợc, sẽ so sánh với giá trị t tra bảng ứng với bậc
tự do (n-1)
-Tất cả các kết quả tính toán chỉ tiêu student của các quà trình nghiên cứu, thí
nghiêm so với t tra bảng đợc ghi vào bảng 4.
Bảng 4: kết quả tính toán chỉ tiêu student của các quá trình nghiên cứu thí
nghiệm so với t tra bảng.
Nng
Thi gian tỏc dng
Ch tiờu S: T l sng ca tinh trựng (%0
Ch tiờu 2: Tinh trựng tin ti nhanh (%)
Mc A: Tinh trựng tin ti nhanh (%)
Mc D: Tinh trựng di ng ti ch (%)
Vi bc t do n-1 = 14
Ngýng sai
é tin cy
t tra bng

1

3
1
3
0.25
1
0.25
1
mg/ml
mg/ml
mg/ml
mg/ml
1
1
5
5
t=3,62
t=9,14
t=44,26 t=11,98
t=3,68
t=3,96

t=11,33
t=10,78

P=0,05 P=0,01
95%
99%
t = 2,145 t=3,977

t=4,55

t=4,33

t=12,77
t=12,50

P=0,001
99,9%
t=4,140

Từ các kết quả tính toán theo các chất liệu và mức độ cụ thể (bảng 4) thấy rằng giá
trị tuyệt đối các tét t của các quá trình tính toán thí nghiệm đều lớn hơn giá trị các t
tra bảng, chứng tỏ sự khác biệt có ý nghĩa khá lớn (P<0,05; P<0,01; P<0,001 ). Vậy
hoạt chất Sf có tác dụng ức chế sự hoạt động của tinh trùng ứng với sác xuất sai la
5%, 1% và 0,1%.
Ngoài các chỉ tiêu tính toán trên, chỉ tiêu hình dạng, tinh trùng có thay đổi hay
không sau khi tiếp súc với hoạt chất Sf cùng với phần minh chứng thêm cho tác

11


dụng của hoạt chất này- Thay cho tính toán chúng tôi đã chụp ảnh hình thể tinh
trùng trớc và sau khi tiếp súc với hoạt chất Sf.

Hỡnh 1

Hỡnh 2

Hỡnh 3

Hỡnh 1: Hỡnh dng ban u bỡnh thýng ca tinh trựng

Hỡnh 2: sau khi gp hot cht Sf, tinh trựng b c ch di ng v kt ỏm
Hỡnh 3: Tinh trựng b bin dng u v cht
Các kết quả này đã đợc báo cáo tại hội nghị toàn quốc 2004 về nghiên cứu cơ bản
trong khoa học sự sống - Định hớng y dợc học- Học viện quân y dợc học- Học
viện quân y 28.10.2004- Hà Nội.
Phụ lục số 16 trang 64 -68

II . Chứng minh thêm tác dụng của hoạt chất Sf
Để khẳng định thêm tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng ngời, chúng tôi tiếp
tục thí nghiệm thêm 13 mẫu tinh dich phân theo 3 nhóm, dựa theo chỉ tiêu.
Độ di động: - A: tiến tới nhanh
- B: tiến tới chậm
- C: không tiến tới
- D: không di động
1/ nhóm tinh dịch + nớc muối sinh lý 0,9% ( 6 mẫu)
2/ Nhóm tinh dịch + nớc muối sinh lý 0,9 % +hoạt chất Sf (12 mẫu)
3/ nhóm tinh dịch +hoạt chất Sf (14 mẫu)
Tất cả gồm 32 thí nghiệm để so sánh.
Trên sơ đó biểu diễn theo 3 nhóm x 2 lần thí nghiệm.

12


Qua sơ đồ thấy rõ rằng: ở nhóm thứ nhất: tinh dịch + NaCl 0,9%
- Nớc muối sinh lý chỉ có tác dụng hoà tan vào tinh dịch va không
có tác dụng gì đến ứu chế sự hoạt động của tinh trùng.
ở nhóm thứ 2 gồm tinh dich + NaCl 0.9% và
ở nhóm thú 3 gồm tinh dịch +hoạt chất Sf thấy rất rõ vai trò
của hoạt chất Sf. ở đây
- chỉ số A% tiến tới rất nhanh và tiến tới chậm bằng 0.

- chỉ số C% không tiến tới bằng 0
- chỉ số D% không di động là 100%
Điều đó khẳng định tác dụng mạnh mẽ của hoạt chất Sf
(số liệu phụ lục 18 trang 86 -118 )

13


So s¸nh t¸c dông diÖt tinh trïng chuét vµ ng−êi cña Saponin
Du trµ víi alkylphenylalcolether [3]

Thuèc
Saponin
Du trµ

Alkyl phenyl
Elcohol ether

Tinh trïng chuét cèng
Nång ®é
mg/ml 20’’ 3’ 5’ 10’ 20’
1,0
0,5
0,25
0,125
0,0625
0,0313
0,0157
+ + 1,0
0.5

0,25
0,125
+ + + 0,0625
+ + + +
+
0,0313
+ + + +
+
0,0157
+ + + +
+

Chó thÝch : - kh«ng cã tinh trïng ho¹t ®éng
+ cã tinh trïng ho¹t ®éng

14

Tinh trïng ng−êi
20’’ 3’ 5’ 10’ 20’
+ + + + + + + + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +


III Tác dụng diệt tinh trùng của hoạt chất Sf lªn ®éng vËt thÝ nghiÖm
1-T¸c dông cña ho¹t chÊt Sf trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm ( test invivo )
1.1. Thử tác dụng diệt tinh trùng của hoạt chất "Sf " dưới dạng thuốc
đặt âm đạo ở chuột cống trắng cái (phụ lục 22 trang 136 - 141)
Cách tiến hành:- lựa chọn chuột cống trắng cái có khả năng sinh sản được

chứng minh và chia thành 2 lô: lô chứng và lô thử thuốc, mỗi lô gồm 30 con,
lô thứ 3 gồm 15 chuột cống trắng đực có khả năng sinh sản, được chứng
minh để giao phối. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Tác dụng của thuốc diệt tinh trùng "Sf " đặt âm đạo trên sự
sinh sản ở chuột cống trắng cái
Lô đối chứng
Lô đối chứng: ghép đôi chuột cái
với chuột đực từ 8 giờ sáng, kiểm
tra tế bào âm đạo và tinh trùng,
nếu có tinh trùng coi như chuột đã
thụ tinh ngày thứ nhất. Mười ngày
sau khi ghép đôi và kiểm tra thấy
có tinh trùng âm đạo, mổ chuột
cái để kiểm tra và đếm số vị trí
làm tổ ở hai bên sừng tử cung rồi
đóng vết mổ lại. Đến ngày thứ 18
mổ chuột cái lần thứ hai . Đếm số
bào thai ở hai bên sừng tử cung
.Theo dõi các lứa chuột con đẻ ra.

Số v ị trí làm tổ
Trọng
(mổ lần 1)
TT lượng
Sừng
Sừng
(g)
trái
phải
1

160
3
6
2
165
3
4
3
150
5
2
4
170
3
5
5
180
3
3
6
180
4
4
7
150
3
5
8
170
4

1
9
165
2
6
10
180
7
1
11
165
3
6
12
170
5
3
13
160
2
6
14
150
3
7
15
150
3
3
Trung bình

3,53 ± 0,33
± SE

15

Số bào thai
(mổ lần 2)
Sừng
Sừng
trái
phải
2
6
3
4
5
2
3
5
3
3
3
4
2
5
4
1
2
5
7

1
3
5
5
3
2
5
2
7
3
3
3,26 ± 0,50

Lứa
đẻ,
số
con
8
7
7
8
6
7
7
5
5
8
8
8
7

9
6


Lô thử thuốc:- Liều thuốc
thử là 5mg trong 0,1ml dịch
trợ/1chuột. Ghép đôi chuột
cái với chuột đực từ 8 giờ
sáng, kiểm tra tế bào âm
đạo và tinh trùng, nếu có
tinh trùng thì tiến hành đặt
thuốc với liều như trên. Cứ
1 giờ đặt một lần. đặt liên
tục trong ngày có tinh trùng
ở âm đạo ( khoảng 5-6 lần).
Ngày thứ 10 mổ chuột.
Kiểm tra và đếm số vị trí
làm tổ của trứng và sự phát
triển của bào thai như ở lô
đối chứng. Nếu không có
sự làm tổ ở hai bên sừng tử
cung thì có thể kết luận:
thuốc có tác dụng tiêu diệt
tinh trùng ở âm đạo chuột
cống trắng cái sau sự giao
phối với chuột đực.

Lô thử thuốc
Số v ị trí làm
Trọg

tổ
TT lượng
(mổ lần 1)
(g)
Sừng Sừng
trái
phải
1
150
0
0
2
150
0
0
3
150
0
0
4
160
0
0
5
180
0
0
6
180
0

0
7
170
0
0
8
170
0
0
9
170
0
0
10 180
0
0
11 170
0
0
12 170
0
0
13 170
0
0
14 170
0
0
15 160
0

0
16 160
0
0
17 160
0
0

Số bào thai
(mổ lần 2)
Sừng
trái
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

Sừng
phải
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

Lứa đẻ,
số con

Không có
trứng làm
tổ ở hai
bên sừng
tử cung

KẾT LUẬN:

Ở lô chứng chuột mẹ thụ thai bình thường, các bào thai phát triển bình thường,
số con đẻ ra từ 5-9 con, ở lô thử thuốc: không có trứng làm tổ ở hai bên sừng tử
cung, chứng tỏ thuốc có tác dụng diệt tinh trùng ở âm đạo chuột cống trắng cái.

16


1.2. Nghiên cứu sự phục hồi khả năng sinh sản của chuột cống trắng cái
sau khi ngừng dùng hoạt chất "Sf " đặt âm đạo (phụ lục 23 trang 142 )
Tiến hành khảo sát xem chuột cống trắng cái sau khi ngừng dùng hoạt chất "Sf"
có phục hồi khả năng sinh sản bình thường hay không.
Chuột cống trắng cái sau khi diệt tinh trùng với liều thực nghiệm
(5mg/chuột/ngày)và có kết quả ngừa thai thì ngừng dùng thuốc. Cho chuột nghỉ
ngơi 2 tháng để chuột khoẻ lại bình thường rồi cho giao phối trở lại (theo quy
trình WHO)
Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Sự phục hồi khả năng sinh sản của chuột cống trắng cái sau khi
ngừng dùng hoạt chất "Sf" đặt âm đạo

Chuột thử
thuốc
TT

1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Trọng
lượng
(g)
160
150
150
160
180
180
170
170
170
170
170
170
160
160
160
170

170

θ với "Sf" 5mg/chuột/ngày
Số vị trí làm tổ
Sừng
Sừng
trái
phải
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

Tinh
trùng
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+

Sau 2 th áng cho
cho chuột giao phối
l ại
Lứa đẻ thế hệ F1
số con
5
4
6
5
7
4
9
5
6
4
7
6
7
0
0
0
0

NHẬN XÉT KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM :- sau khi thuốc có tác dụng diệt
tinh trùng ở âm đạo chuột cống trắng cái, ngừng dùng thuốc. Cho chuột nghỉ
ngơi 2 tháng để chuột khoẻ rồi cho giao phối lại. Trong số 17 chuột thử nghiệm

17


có 13 chuột đã thụ thai, sinh con bình thường, đạt tỷ lệ 76,4%. Con đẻ ra bình
thường, số lượng con bình thường.
Xét nghiệm vi thể: ảnh chụp vi thể và phiếu xét nghiệm cho thấy tử cung và
buồng trứng của chuột mẹ bình thường
2. Khảo sát độc tính sinh sản của hoạt chất "Sf " lên thế hệ F1
Nuôi chuột con thế hệ F1 trong khoảng 8-10 tuần tuổi đến khi chuột trưởng
thành đạt trọng lượng 130-200g. Cho chuột cái giao phối với chuột đực theo
quy trình WHO (phụ lục 24 trang 143 - 144).
Kết quả khảo sát đối với chuột thế hệ F1 trong việc theo dõi ảnh hưởng của
hoạt chất "Sf" đến sự làm tổ của trứng và sự phát triển của bào thai ở chuột
cái thế hệ F1 được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Khảo sát ảnh hưởng về mặt độc tính sinh sản của hoạt chất "Sf
" trên chuột thế hệ F1
Trọng
TT lượng
(g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

12
13
14
15

130
140
140
140
140
140
150
150
170
160
150
160
160
160
160

Trung bình
± SE

Số v ị trí làm tổ
Sừng
trái
4
3
5

4
5
3
3
5
3
3
4
3
3
0
0

Sừng
phải
0
3
3
3
4
2
3
4
2
0
3
3
4
0
0

3,69 ± 0,20

Số bào thai
Sừng
trái
4
3
5
4
5
3
3
5
3
3
4
3
3
0
0

Sừng
phải
0
3
3
3
4
2

2
3
2
0
3
3
4
0
0

Lứa
đẻ,
số
con
F2
4
6
8
7
9
5
5
8
5
3
6
6
7
0
0

3,69 ± 0,20

Nhận xét kết quả thực nghiệm :- Thuốc không ảnh hưởng đến sự làm tổ
của trứng và sự phát triển của bào thai ở chuột cái thế hệ F1 . Số lượng chuột
con F2 đẻ ra bình thường, không bị dị dạng.
Xét nghiệm vi thể: (một số chuột ngẫu nhiên F1, n=10) các phiếu giải phẫu
bệnh và các ảnh chụp phủ tạng chuột cho thấy thuốc "Sf "không ảnh hưởng gì
18


đến phủ tạng chuột : não, gan, thận, thần kinh, tử cung, tinh hoàn và buồng
trứng đều bình thường. Xét nghiệm nhiễm sắc thể chuột thế hệ F1 thấy rằng
thuốc không ảnh hưởng đến tế bào tuỷ sống, không gây đột biến gen

Tử cung bình thýờng của
chuột mẹ

Gan của chuột thế hệ F1 bình
thường

Buồng trứng bình thường của
chuột mẹ

Thận của chuột thế hệ F1 bình
thường

19

N ão của chuột thế hệ F1 bình

thường


Tinh ho àn của chuột thế hệ F1
bình thường

Tử cung của chuột thế hệ F1
bình thường

Buồng trứng của chuột thế hệ
F1 bình thường

Nhi ễm s ắc th ể của tu ỷ chu ột th ế h ệ F 1
b ình th ư ờng

Nhi ễm s ắc th ể của tu ỷ chu ột th ế h ệ F 1
b ình th ư ờng

IV. Xác định liều độc LD50 của hoạt chất Sf
Phương pháp tiến hành theo h ướng dẫn xác đ ịnh độc tính của thuốc ban
hành k èm theo quy ết đ ịnh 371 BYT/Q Đ ngày 12 tháng 3 n ăm 1996 của Bộ
trưởng B ộ Y tế và theo phương pháp x ác đ ịnh đ c t ính cấp của thuốc (Đ ỗ
Trung Ðàm). Nh à XB YH 1996.
Kết qu ả LD50 đ ường uống = 96 g dược liệu/kg thân trọng chuột
20


(phụ lục số 21 trang 133 - 135)
V. Kết quả thử độc tính bán trường diễn của hoạt chất Sf (phụ lục 25 trang
145 - 149)

Phương pháp thử: Theo phương pháp truyền thống
Các ch ỉ tiêu theo dõi
+ Về sinh hoá: Men gan (AST, ALT), creatinin, ure
+ Về huyết học: số l ượng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, huyết sắc t ố
Quan sát đ ại thể v à vi th ể một số tổ chức gan th ận, n ão, t ử cung, tuyến
ti ền li ệt. Lấy ngẫu nhiên từ mỗi lô thử, khi có kết quả thử nghiệm. L àm
các tiêu bản vi thể và đọc kết quả trên các tiêu bản do bác sĩ chuyên gia
phẫu thuật giải phẫu bệnh Nguyễn Như Oanh đọc (Vi ện Đông Y). Chụp các
tiêu b ản trên kính hiển vi Nikkon với độ phóng đ ại x10, x20 và chụp ảnh trên
m áy.
+ Kết quả thực nghiệm: Tất cả các ch ỉ số sinh hoá v à huy ết học đ ều
không có sự thay đổi đáng kể ở các lô th í nghiệm trước và sau 8 tuần thử thuốc
trên thỏ đ ực và thỏ cái
(Các phiếu xét nghiệm , ph ụ l ục s ố 26 trang 150 - 167)

Gan thỏ sau khi tác dụng v ới Sf

Thận thỏ sau khi tác dụng với Sf

Tử cung thỏ sau khi tác d ụng với Sf

21

Tuy ến tiền liệt thỏ sau khi tác dụng
với Sf

Não thỏ sau khi tác d ụng với Sf